실험에 사용한 황기는 국내에서 재배된 4년근 (1bangherb, Geumsan, Korea)을 구입하였고, 선별된 미생물은 국내·외 전통식품 및 발효식품 유래 균주로 분리·동정된 것을 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터에서 분양받았으며, Saccharomyces cerevisiae (HLJG0703, KACC 83014BP)는 빵에서, Pediococcus pentosaceus (HLJG0702, KACC 81017BP)는 김치에서 분리된 균주를 분리·동정하여 사용하였다.

Isoflavonoid 표준품 calycosin 7-O-glucoside, formononetin 7-O-glucoside, calycosin, formononetin은 Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다 (Table 1).

액상발효를 수행하기 위해 황기를 50% EtOH로 상온에서 2 일 간 진탕추출하여, 추출물을 농축·동결 건조한 후, 정제수를 첨가하여 발효균이 성장할 수 있는 농도인 1 brix, 3 brix로 현탁액을 제조하였다. 이후, 48 시간 동안 MRS broth 또는 YM broth에서 pre-incubation 시킨 균주의 O.D.값을 600 ㎚에서 1.5로 보정한 균주 5% (v/w) 접종하여 1 일 - 3 일 간 조건적 혐기발효 (25℃, facultative anaerobe)를 실시하였다. 불활성화를 시키기 위해 수욕상에서 80℃, 1 시간 동안 처리하여 반응을 종료시켰으며, 동결건조하여 시료로 사용하였다.

시료 2 g을 정밀히 달아 50 ㎖ 부피 플라스크에 취하고, 완전하게 용해시키며 50% EtOH을 표선까지 채운 후, syringe filter (0.45 ㎛) 및 희석하였으며, 표준품은 3.124 ㎍/㎖, 6.250 ㎍/㎖, 12.500 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 사용하였다. Isoflavonoid 함량분석은 high performance liquid chromatography (HPLC) Ulti-Mate 3000 (Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA) 기기로 수행하였고, column은 Luna C18 (Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA), 이동상은 0.1% acetic acid가 첨가된 acetonitrile과 water를 사용하였다.

시료 주입량 10 ㎕, 유속 0.8 ㎖/min, 온도 30℃, UV detector로 260 ㎚에서 table 2와 같은 이동상 조건으로 측정하였다. 시료의 정량값 측정은 피크면적을 검량선 방정식에 대입한 후 아래의 계산식에 의해 산출하였다. 검량선은 x축에 농도를 y축에 피크면적을 적용하여 최소자승법으로 계산하였다 (Table 2).

C: 시험용액 중 개별 isoflavonoid농도 (㎍/㎖)
a: 시험용액의 전량 (㎖)S: 시료 채취량 (g)
b: 희석배수1/1,000: 단위 환산 계수

모든 실험은 3 회 반복으로 수행한 후, 평균과 표준편차로 나타내었고, 통계처리는 Prism 8 software (Graphpad software Inc., San diego, CA, USA)를 이용하여 이원분산분석 (Two-way ANOVA)으로 p < 0.05 수준에서 Dunnett’s Multiple Comparison Test에 의하여 시험물질 간 유의성을 검증하였다.

Esculin agar를 통한 정성분석 결과, P. pentosaceus 91.7 ± 2.9%, W. cibaria 90.7 ± 1.2%, S. cerevisiae 83.3 ± 5.8%, B. licheniformis 79.3 ± 6.7%, L. mesenteroides 79.0 ± 3.6% 순으로 black zone 형성율을 나타냈고, β-glucosidase activity를 통한 정량분석은 W. cibaria 39.3 ± 8.7 unit/ℓ, S. cerevisiae 30.5 ± 0.5 unit/ℓ, P. pentosaceus 27.5 ± 0.2 unit/ℓ, B. licheniformis 17.4 ± 1.7 unit/ℓ, L. bulgaricus 17.4 ± 2.3 unit/ℓ 순으로 정량값을 나타내었다. 20 종의 미생물 중 정성분석과 정량시험에 활성을 나타내는 W. cibaria, P. pentosaceus, S. cerevisiae를 발효시험 균주로 선발하였다 (Table 3).

Isoflvonoid 정량분석은 황기추출물을 대조군으로 W. cibaria, P. pentosaceus, S. cerevisiae로 발효한 발효추출물 (1 brix - 3 brix, 1 일 - 3 일)을 처리군으로 나누어 실시하였고, 발효공정에 따른 황기의 calycosin 7-O-glucoside, formononetin 7-O-glucoside, calycosin, formononetin 함량은 Table 4에 나타내었다. 대조군 대비 모든 처리군에서 배당체 calycosin 7-O-glucoside, formononetin 7-O-glucoside가 감소하고, 비배당체 calycosin, formononetin이 증가하였다. 이중 황기추출물을 1 birx로 희석하여, S. cerevisiae로 3 일간 발효시킨 처리군에서 calycosin 1.102 ± 0.008 ㎎/ｇ, formononetin 1.482 ± 0.001 ㎎/ｇ으로 최대 함량이 검출되었다.

Ibe 등 (2001)은 건조된 볏짚에서 분리한 50 여종의 미생물 중 β-glucosidase 활성이 높은 Bacillus subtilis (natto) 분리·동정한 후, 대두추출물을 발효하였을 때, 추출물에 함유된 isoflavonoid 배당체 daidzein과 genistin 함량이 감소하면서 비배당체 daidzein과 genistein이 증진되는 발효양상을 검증하였고, Kuo 등 (2006)은 검은콩 두유를 Bacillus subtilis로 24 시간 발효하였을 때, daidzein과 genistin이 탈탕화에 의해 비배당체 daidzein과 genistein으로 변환되었다고 보고하였다.

Im 등 (2010)은 황기를 에탄올로 추출한 후, 탄수화물 분해효소 viscozyme L, 셀룰로오스 분해효소 celluclast, 팩틴 분해효소 pectinex로 반응시킨 후, calycosin과 formononetin의 함량을 비교하였을 때, viscozyme L을 처리하였을 때, calycosin과 formononetin 함량이 4 - 5 배 증가하였고, viscozyme L에 함유된 arabanase, cellulase, β-glucanase가 deglycosylation에 관여하는 것을 확인하였다.

Hsu 등 (2018) 연구에 따르면 isoflavone은 3-phenylchrome 골격을 갖고 있는 화합물로 치환기에 부착된 성분에 따라 calycosin 7-O-glucoside, ononin, daidzein, genistin 등으로 구분되며, 미생물에 의해 생성되는 대사물질에 따라 deglycosylation, glycosylation, phosphrylation, succinylation 과정을 거쳐 화합물이 변환되는 것을 확인하였다.

본 실험에서는 deglycosylation 효소 중 glucoside 분해효소를 갖는 β-glucosidase 활성균주로 발효하였을 때, 황기 isoflavonoid 배당체 calycosin 7-O-glucoside와 formononetin 7-O-glucoside가 감소하고, calycosin과 formononetin이 증가하여, 미생물의 β-glucosidase 효소활성이 배당체 isoflavonoid 분해하는데 영향을 미치는 것을 확인하였지만, 배당체와 비배당체의 변환율을 비교하였을 때, calycosin 7-O-glucoside와 formononetin 7-O-glucoside 이외의 대사물질이 calycosin, formononetin 증가량의 상호적인 역할을 하는 것으로 사료되며, 추가적인 연구가 필요할 것으로 확인되었다.

생리활성평가는 황기추출물을 대조군으로 S. cerevisiae로 발효한 발효추출물 (1 brix - 3 brix, 1 일 - 3 일)을 처리군으로 나누어 실시하였고, 발효공정에 따른 황기의 항산화 활성을 DPPH 및 ABTS로 수행한 결과는 Table 5에 나타내었다. DPPH IC₅₀ value은 대조군 1587.1 ± 30.9 ㎍/㎖, 처리군4 1327.1 ± 45.1 ㎍/㎖, 처리군1 1215.9 ± 36.4 ㎍/㎖, 처리군5 1056.1 ± 71.4 ㎍/㎖, 처리군2 945.1 ± 35.6 ㎍/㎖, 처리군6 671.5 ± 51.6 ㎍/㎖, 처리군3 565.1 ± 59.1 ㎍/㎖순으로 증가하였고, ABTS IC₅₀ value은 대조군 1728.2 ± 32.4 ㎍/㎖, 처리군4 1597.1 ± 42.6 ㎍/㎖, 처리군1 1454.6 ± 129.0 ㎍/㎖, 처리군5 1114.6 ± 42.7 ㎍/㎖, 처리군2 942.1 ± 59.4 ㎍/㎖, 처리군6 791.1 ± 28.3 ㎍/㎖, 처리군3 678.2 ± 17.8 ㎍/㎖순으로 활성이 증가하였다.

Wang 등 (2014)은 황기추출물에서 formononetin, calycosin을 Sephadex LH-20 chromatography로 분리한 후, ABTS를 확인하였을 때, 7.468 ㎎/㎖, 0.159 ㎎/㎖의 IC₅₀을 라디칼 소거능을 검증하였고, Park 등 (2019)은 황기의 볶음조건 (200℃, 30 분 간 1 회 - 3 회)에 따른 DPPH, ABTS 활성을 비교하였을 때, 대조구 대비 2 회 볶음에서 formononetin은 286.65 ± 2.51 ㎍/g에서 726.80 ± 3.45 ㎍/g, calycosin은 253.13 ± 1.23 ㎍/g에서 778.58 ± 2.72 ㎍/g으로 함량이 증가함에 따라 DPPH는 3125.1 ± 82.7 ㎍/㎖에서 564.6 ± 20.9 ㎍/㎖, ABTS는 1450.2 ± 114.3 ㎍/㎖에서 108.2 ± 3.1 ㎍/㎖으로 증가한다고 보고하였다.

Tyrosinase inhibition rate를 측정한 결과, 처리군4 42.9 ± 8.6%, 대조군 50.1 ± 1.1%, 처리군5 54.2 ± 2.9%, 처리군1 56.0 ± 3.4%, 처리군2 56.9 ± 1.8%, 처리군6 74.9 ± 0.3%, 처리군3 78.4 ± 0.9%순으로 활성이 증가하였고, 처리군3에서 최대 저해율을 나타내었다 (Table 6).

Kim 등 (2009)은 황기 calycosin의 mushroom tyroinase 억제효과를 실시한 결과, 38.4 ± 0.9 μM (100 ㎍)의 저해효과를 검정하였고, Wagle 등 (2019)은 칡에 함유된 isoflavonoid의 L-DOPA inhibition을 측정하였을 때, formononetin 0.31 ± 0.62%, calycosin 70.17 ± 1.08%, kojic acid 76.78 ± 3.34%의 L-DOPA 억제율을 확인하여, calycosin이 formononetin 대비 미백활성에 효과를 나타내는 것으로 보고하였다.

Collagenase inhibition rate를 측정한 결과, 처리군5 77.8 ± 0.9%, 대조군 78.1 ± 0.8%, 처리군2 79.9 ± 0.8%, 처리군1 80.1 ± 0.5%, 처리군4 80.8 ± 0.2%, 처리군6 82.0 ± 1.0%, 처리군3 83.8 ± 1.1%순으로 활성이 증가하였고, 처리군3에서 최대 저해율을 나타내었다 (Table 6).

Hsu 등 (2009)은 Bacillus subtilis로 황기를 발효하였을 때, calycosin과 formononetin 함량이 증가함에 따라, 인간진피 섬유아세포의 procollagen (type I, III) 합성량이 증가한다고 보고하였다.

본 시험에서는 대조군 대비 calycosin과 formononetin 함량이 증가된 처리군3에서 tyrosinase inhibition, collagenase inhibition 활성이 증가되는 것을 확인하였으며, 발효에 의해 증가된 비배당체 isoflavonoid와 미백과 주름개선 활성의 연관성이 있을 것으로 사료된다.