본 실험에 사용한 엉겅퀴 (Cirsium japonicum var. ussuriense) 뿌리는 식품의약품안전처의 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (good manufacturing practice, GMP)을 인증받은 제품을 광명당한약도매 (onherb, Gwangju, Korea)에서 구입하였으며, 세척한 후 일주일 동안 대형 건열 건조기 (SAM-DR1700, Samgong Co., Ltd., Busan, Korea)에서 50℃ 조건으로 건조하였다.

건조된 시료 409 g을 완전히 분쇄하고 시료 무게의 10 배에 해당하는 물을 넣은 뒤 환류 냉각추출방법을 통해 105℃에서 5 시간 동안 2 회 반복, 추출했다. 반복추출을 거친 추출물은 대형 회전감압농축기 (NVC-2200, Eyela, Tokyo, Japan)를 통해 55℃에서 농축하였고, 농축이 끝난 추출물은 filter paper (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용해 여과한 뒤 동결건조기 (LYOPH-PRIDE 20R, ilShinBioBase Co., Ltd., Dongducheon, Korea)를 이용해 건조하였다.

본 실험 조건에서 시험물질은 250 g을 수득하여 약 61.1%의 수율을 확인하였고 건조된 파우더는 0.5% CMC (carboxymethyl cellulose, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 녹인 뒤 사용했다.

성분 분석을 위해 LC-20AD pump, CTO-20A column oven, DGU-20A3 degasser, SPD-20A UV detector, SIL-20AC autoinjector로 구성된 UFLC XR (Shimadzu Co., Kyoto, Japan)을 이용하였고, ESI interface를 통해 IT TOF mass spectrometer (LC-IT-TOF MS, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)로 분석하였다. Column은 Capcell Pak IF C18 (2 ㎛, 2.0㎜ × 100㎜, Osaka soda Co., Ltd., Osaka, Japan)를 사용하였으며, 분석 시 column 온도는 40℃로 설정하였다. 분석 용매는 0.1% 포름산을 포함한 정제수 (용매 A)와 0.1% 포름산을 포함한 아세토나이트릴 (용매 B)을 사용하여 총 20분간 0.3 ㎖/min 유속으로 분석하였다 (Table 1).

성분 분석에 사용 된 표준물질은 4-caffeoyl quinic acid (Sigma-Aldich Co., St. Louis, Missouri, USA), 3,5-dicaffeoylquinic acid (Biopurify Phytochemicals Ltd., Chengdu, China), diosmin (Tauto Biotech Co., Ltd., Zhangjiang, China), 4,5-dicaffeoylquinic acid, linarin, pectolinarin (ChemFaces Biochemical Co., Ltd., Wuhan, China)를 사용하였고, chlorogenic acid, rutin, syringin, luteolin 및 rutinoside는 직접 분리하여 구조가 동정된 화합물을 사용했다.

본 실험은 동물보호법 (제정 1991년 5월 31일 법률 제 4379호, 일부개정 2015년 1월 20일 법률 제 13023호)에 근거한 한국한의약진흥원 한약자원개발본부의 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었으며 (승인번호: NIKOM-2017-003), 실험에 사용된 수컷 6 주령 DBA/1 마우스는 오리엔트 바이오 (Jeongeup, Korea)에서 구입하였고 그룹당 7 마리 씩 다섯 그룹으로 분리했다.

Immunization grade bovine type II collagen (Chondrex Inc., Redmond, WA, USA)은 면역보조제인 complete Freund’s adjuvant (CFA, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)와 incomplete Freund’s adjuvant (IFA, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 녹여 사용했다.

류마티스 관절염의 유도는 먼저 bovine type II collagen을 CFA에 1 : 1 비율이 되도록 충분히 섞어 마우스 꼬리 기저부에 100 ㎕를 주입하고, 일주일 뒤 IFA에 1 : 1 비율로 녹인 bovine type II collagen을 마우스 꼬리 기저부에 100 ㎕를 주입해 류마티스 관절염을 유도했다.

정상대조군 (normal control)과 음성대조군 (negative control)을 제외한 양성대조군 (positive control) 그룹은 0.2 ㎎/㎏의 농도로 methotrexate를 3 주간 경구투여 했으며, 엉겅퀴 뿌리 물 추출물 투여 그룹은 3 주 동안 100 ㎎/㎏ (WRCJ 100 ㎎/㎏) 또는 500 ㎎/㎏ (WRCJ 500 ㎎/㎏) 농도로 경구투여했다. 실험이 끝난 뒤, IACUC의 실험동물 관리 기준에 따라 이산화탄소를 과호흡시켜 실험동물의 안락사를 유도했다.

실험동물로부터 분리된 다리는 10% neutral buffered formalin (HT501128, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 이틀 동안 고정한 뒤 조직처리 과정을 통해 파라핀으로 검체를 제작하였으며, 검체는 활막과 관절이 뚜렷하게 보이도록 5 ㎛ 두께로 조직 슬라이드를 제작해 Dako Mayer’s Hematoxylin (Agilent Technologies Inc., Santa clara, CA, USA)과 Eosin Y (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용한 hematoxylin and eosin 염색을 통해 광학현미경으로 관찰했다.

류마티스 관절염 지수는 류마티스 관절염이 유도된 후 일주일마다 진행하였으며, 각각 세 번씩 독립적으로 측정했다. 스코어는 Endale 등의 방법을 참고했으며 적용된 수치는 다음과 같다 (Endale et al., 2013, symptomless; 0, erythema; 2, mild swelling and erythema; 4, mild swelling, erythema from the tarsals to the ankle; 6, moderate swelling, erythema from the metatarsal joints to the ankle; 8, severe swelling and erythema from the foot to the ankle; 10).

조직 병리 지수는 보고된 방법을 참고해 활막 내 염증 반응을 현미경으로 관찰했고 적용된 수치는 다음과 같다 (Nishikawa et al., 2003; Sun et al., 2011, normal; 0, cell infiltration in synovial membrane; 1, cartilage erosion; 2, erosion of subchondral bone; 4, loss of joint integrity and ankylosis; 5).

혈청에 존재하는 염증매개인자인 IL-6와 TNF-alpha의 비율을 측정하기 위해 ELISA를 수행했으며, 실험동물로부터 전혈을 얻은 뒤 BD vacutainer^TM SST tube (Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltam, MA, USA)에 넣어 실온에 10분간 방치하고 4,000 rpm 4℃ 조건에서 10 분간 원심분리하였다.

분리된 혈청은 Mouse IL-6 quantikine ELISA (M6000B, R&D systems Inc., Minneapolis, MN, USA), Mouse TNF-alpha quantikine ELISA (MTA00B, R&D systems Inc., Minneapolis, MN, USA)와 Anti-mouse type II collagen IgG antibody assay kit (2036, Chondrex Inc., Redmond, WA, USA)를 사용해 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 수행하였다.

통계처리는 statistical package for the social sciences (SPSS, IBM, Armonk, NY, USA)을 이용하여 평균값과 표준편차를 구했고 실험군 간의 유의적인 차이를 검증하기 위해 일원배치 분산분석을 수행한 후, Tukey-Kramer Multiple Comparison Test를 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 통계적인 차이를 검증했다.

시험물질은 LC ESI-IT-TOF/MS를 이용하여 분석하였으며 총 10 개의 주요 peak를 확인했다.

각 peak들의 기초정보는 Table 2에 표기했으며 (Table 2), 이러한 결과를 바탕으로 각각의 표준품, retention time, 분자량 및 선행연구와 비교하여 chlorogenic acid (1) (Lee et al., 2019), 4-caffeoyl quinic acid (2) (Park et al., 2019), syringin (3) (Li et al., 2019), 3,5-dicaffeoylquinic acid (4) (Lee et al., 2019), rutin (5) (Lee et al., 2018), luteolin rutinoside (6) (Hassan et al., 2019), 4,5-dicaffeoylquinic acid (7) (Park et al., 2019), diosmin (8) (Adouani et al., 2013), linarin (9), pectolinarin (10) (Ganzera et al., 2005)으로 확인했다 (Fig. 1).

Fig. 1.  LC chromatogram of the water extract from the root of Cirsium japonicum var. ussuriense.

(1; chlorogenic acid, 2; 4-caffeoyl quinic acid, 3; syringin, 4; 3,5-dicaffeoylquinic acid, 5; rutin, 6; luteolin rutinoside, 7; 4,5-dicaffeoylquinic acid, 8; diosmin, 9; linarin, 10; pectolinarin)

실험 동물 모델에서 엉겅퀴 (Cirsium japonicum var. ussuriense) 뿌리 물 추출물 (WRCJ)이 다리의 부종과 같은 형태학적인 염증 반응에 어떠한 효과를 나타내는지 확인하기 위해 실험을 진행했으며, 본 실험에 적용한 시험물질의 농도는 약용자원을 이용한 여러 선행 실험결과를 바탕으로 결정했다 (Fujita et al., 2001; Watcho et al., 2006; Patel et al., 2012).

류마티스 관절염 유도 1 주일 후 양성대조군 (0.2 ㎎/㎏ methotrexate, positive control) 그룹은 음성대조군 (negative control) 그룹과 비교하여 다리에 부종이 개선되는 경향이 나타나기 시작했으며, 3 주차에 가서야 양성대조군과 엉겅퀴 뿌리 물 추출물 500 ㎎/㎏ 투여군은 다리의 부종이 유의적으로 개선되는 것으로 확인되었다 (Fig. 2A and 2B).

Fig. 2.  Improvement effect of WRCJ on type II collagen-induced swelling of hind legs.

Mice were separated 5 group (normal control, negative control; type II collagen-induced rheumatoid arthritis, CIA, positive control; CIA + 0.2 ㎎/㎏ methotrexate, CIA + 100 ㎎/㎏ WRCJ, CIA + 500 ㎎/㎏ WRCJ, n = 7). (A) Rheumatoid arthritis score was weekly assessed beginning from 14 days. Examiners for three times per week. Assessment as follows: symptomless; 0, erythema; 2, mild swelling and erythema; 4, mild swelling, erythema from the tarsals to the ankle; 6, moderate swelling, erythema from the metatarsal joints to the ankle; 8, severe swelling and erythema from the foot to the ankle; 10. (B) Morphological image of hind legs. Data are presented as means ± SEM (n = 7). Statistical significance was indicated for weekly. *p < 0.05, versus negative control group by One-way ANOVA with Tukey-Kramer Multiple Comparison Test. CIA, type II collagen induced rheumatoid arthritis; WRCJ, water extracts derived from the root of Cirsium japonicum var. ussuriense.

활막을 구성하는 활막액은 전염증성 매개인자가 존재하여 단핵구, 대식세포와 같은 세포들과 상호작용함에 따라 면역반응에 쉽게 반응하며 (Burmester et al., 1983), 이러한 상호작용은 관절의 부종과 직접적으로 연결된 보고되어있다 (Song et al., 2015; Guo et al., 2018).

본 실험조건에서 엉겅퀴 뿌리 물 추출물을 100 또는 500 ㎎/㎏의 농도로 3 주간 투여했을 때, 100 ㎎/㎏ 투여동물은 type II 콜라겐에 의한 다리 부종을 개선하지 못했고 500 ㎎/㎏ 투여동물은 유의적으로 부종을 개선시키는 것으로 나타났는데 이는 엉겅퀴 뿌리 물 추출물이 콜라겐에 의해 유도된 활막의 염증반응에 이로운 영향을 미치는 것으로 사료될 뿐만 아니라 투여 농도 차이에 의해 염증매개물질 분비에 미치는 영향이 다를 것으로 사료되어 활막의 조직학적인 분석과 류마티스 관절염에 관여하는 혈액 인자를 측정하였다.

실험동물로부터 얻어진 조직을 hematoxylin과 eosin 염색 및 조직 처리 과정을 통해 육안으로 확인한 결과, 음성대조군은 정상대조군에 비해 활막의 염증이 증가되는 것으로 나타났으며, 양성대조군과 500 ㎎/㎏ 농도의 엉겅퀴 뿌리 물 추출물투여군은 유의적으로 제2형 콜라겐 주입에 의한 활막염증을 개선하는 것으로 나타났지만 100 ㎎/㎏ 엉겅퀴 뿌리 물 추출물 투여군은 유의적인 효과가 확인되지 않았다 (Fig. 3A and 3B).

Fig. 3.  Improvement effect of WRCJ on infiltration of inflammatory cell on synovial membrane.

Mice were separated 5 group (normal control, negative control; type II collagen-induced rheumatoid arthritis, CIA, positive control; CIA + 0.2 ㎎/㎏ methotrexate, CIA + 100 ㎎/㎏ WRCJ, CIA + 500 ㎎/㎏ WRCJ, n = 7). (A) Representative images were stained by hematoxylin and eosin (H & E) staining (B) Histological score determined on H&E stained sections in different groups. Histologic scoring of inflammation and bone erosion was performed by three independent observers. *p < 0.05, versus negarive control group. Statistical analysis for histological score was conducted using One-way ANOVA with Tukey-Kramer multiple comparison test. CIA, type II collagen induced rheumatoid arthritis; WRCJ, Water extracts derived from the root of Cirsium japonicum var. ussuriense.

제2형 콜라겐은 DBA/1 마우스에서 조직학적으로 활막의 염증을 일으키는 것으로 보고되어 있고 이러한 염증 반응은 염증매개물질인 IL-6가 필수적으로 필요한 것으로 알려져 있다 (Srirangan and Choy, 2010). 또한 염증반응에서 IL-6는 B 세포의 분화와 항체 생성에 관여하며, T 세포의 분화와 증식을 자극함에 따라 interleukin 17을 생성하고 호중구를 혈관으로부터 조직으로 이동시킨 뒤 ROI (reactive oxygen intermediates)와 단백질 분해효소를 방출하여 관절을 손상시킨다 (Lally et al., 2005; Dienz et al., 2009).

본 실험에서 500 ㎎/㎏ 농도의 엉겅퀴 뿌리 물 추출물은 음성대조군에서 나타난 활막의 염증세포 침윤을 개선하는 것으로 나타남에 따라 엉겅퀴 뿌리 물 추출물이 동물 모델에서 활막의 염증에 관여하는 염증매개인자의 발현에 영향을 미칠 가능성이 있는 것으로 사료되어 이에 관련한 여러 인자를 측정했다.

비장은 면역에 관여하는 주요 장기로 체내 전반적인 면역 기능에 영향을 미치며 류마티스 관절염 동물모델과 임상적으로 염증반응에 의해 무게가 증가되는 것으로 보고되었다 (Bedoya et al., 2015; Serag El-Dien et al., 2016). 이와 같은 근거에 따라 동물모델에서 비장의 절대중량을 측정한 결과 정상대조군은 0.070 ± 0.014 g, 음성대조군은 0.155 ± 0.031 g으로 약 두 배 이상 유의적으로 증가되었다. 아울러 양성대조군은 비장의 절대중량이 0.088 ± 0.013 g으로 감소되었을 뿐만 아니라 100 또는 500 ㎎/㎏ 엉겅퀴 뿌리 물 추출물 투여군은 각각 0.103 ± 0.015 g, 0.088 ± 0.015 g으로 감소되어 엉겅퀴 뿌리 물 추출물은 음성대조군과 비교하여 비장의 중량증가를 유의적으로 개선시키는 것으로 나타났다 (Fig. 4A).

Fig. 4.  WRCJ administration decreased the serum level of IL-6, TNF-alpha, type II collagen IgG, and spleen weight on type II collagen-induced rheumatoid arthritis models.

Mice were separated 5 group (normal control, negative control; type II collagen-induced rheumatoid arthritis, CIA, positive control; CIA + 0.2 ㎎/㎏ methotrexate, CIA + 100 ㎎/㎏ WRCJ, CIA + 500 ㎎/㎏ WRCJ, n = 7). (A); Spleen weight. (B, C, D) type II collagen IgG, TNF-alpha, and IL-6 in serum are analyzed by ELISA. Data are presented as mean ± SEM (n = 7). ^#p < 0.05, versus normal control group; *p < 0.05, versus negative control group. Between groups comparisons were conducted using One-way ANOVA with Tukey-Kramer multiple comparison test. CIA, type II collagen induced rheumatoid arthritis; WRCJ, Water extracts derived from the root of Cirsium japonicum var. ussuriense.

류마티스 관절염이 유발된 환자의 혈청과 활막액에 제2형 콜라겐에 대한 자가항체가 증가되는 것이 류마티스 관절염의 혈액 지표로 이용될 뿐만 아니라 (Jung et al., 2003), 환자 체내의 염증 활성의 정도를 측정하는 지표로 사용됨에 따라 (Kim et al., 2000) 엉겅퀴 뿌리 물 추출물이 제2형 콜라겐 자가항체 생성을 감소시킬 수 있는지 알아보고자 실험을 진행했다.

혈청에 존재하는 제2형 콜라겐 자가항체를 측정했을 때 음성대조군은 109.4 ± 16.5 pg/㎖로 증가되었고, 양성대조군은 45.9 ± 16.3 pg/㎖로 유의적으로 감소되었을 뿐만 아니라 100 또는 500 ㎎/㎏ 농도의 엉겅퀴 뿌리 물 추출물을 투여한 실험군은 각각 24.7 ± 11.0, 17.2 ± 7.7 pg/㎖로 엉겅퀴 뿌리 물 추출물 투여시 제2형 콜라겐 자가항체 농도를 유의적으로 개선시켰다 (Fig. 4B).

양성대조물질인 methotrexate는 aminoumidazole carboximide ribonucleoide, dihydroflate reductase 및 transformylase와 같은 염증 매개 단백질을 억제함에 따라 세포 외부의 adenosine을 증가시키고 pyrimidine의 합성을 저해하며, TNF-alpha와 interleukin 6의 생성을 억제하여 염증 반응을 억제한다고 알려져 있다 (Whittle and Hughes, 2004). 이러한 이유를 근거로하여 엉겅퀴 뿌리 물 추출물이 염증반응을 억제하는 역할을 통해 TNF-alpha와 interleukin-6의 생성을 개선할 수 있는지 알아보기 위해 실험을 진행했다.

혈청내 TNF-alpha의 수준을 측정해본 결과 음성대조군은 103.6 ± 14.7 pg/㎖ 로 정상대조군과 비교하여 증가하였으며 양성대조군은 36.5 ± 6.4 pg/㎖, 100 또는 500 ㎎/㎏ 엉겅퀴뿌리 물 추출물은 각각 67.5 ± 9.2 pg/㎖와 53.0 ± 8.5 pg/㎖로 나타났다 (Fig. 4C).

Interleukin 6의 혈청 농도는 음성대조군이 408.7 ± 18.5 pg/㎖, 양성대조군은 126.6 ± 17.5 pg/㎖, 100 또는 500 ㎎/㎏ 엉겅퀴 뿌리 물 추출물은 각각 273.0 ± 16.3 pg/㎖와 236.5 ± 21.6 pg/㎖로 나타났다 (Fig. 4D).

본 실험 실험결과에서 양성대조군을 포함한 모든 실험군은 모두 유의적으로 혈청내 TNF-alpha와 interleukin 6 수준을 개선시킨 것으로 나타났다. 류마티스 관절염에서 가장 중요한 염증매개인자로 보고되어 있는 TNF-alpha와 interleukin 6는 단핵구와 호중구의 침윤을 증가시켜 염증반응을 조절하고 collagenase와 stromelysin를 포함한 단백질 분해효소의 생성을 증가시킨다 (Saxne et al., 1988; Shingu et al., 1993).

체내에서 생성되는 TNF-alpha는 대부분 대식세포와 T 림프구에 의해 만들어지며, 혈관 내피에서 내피백혈구와 상호작용을 통해 Intercellular adhesion molecule 1과 Vascular cell adhesion molecule 1을 포함한 세포부착분자의 발현을 증가시켜 조직상태를 악화시킨다 (Bradley, 2008). 또한 Interleukin-6는 염증 초기단계에서 파골세포 활성화를 통해 관절을 파괴하고 항체를 생성하는 B세포의 성숙에 작용하여 류마티스 관절염의 병인에 기인한다 (Tanaka et al., 2014).

본 실험 조건에서 양성대조군인 0.2 ㎎/㎏ methotrexate와 엉겅퀴 뿌리 물 추출물은 농도의존적으로 혈청에서 염증매개인자인 TNF-alpha, interleukin 6 및 제2형 콜라겐 자가항체의 수준을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났지만, 100 ㎎/㎏ 엉겅퀴 뿌리 물 추출물은 혈중 염증매개인자를 유의적으로 감소시킨것과 반해 type II 콜라겐 투여에 의한 다리의 부종은 개선하지 못했다.이는 류마티스 관절염 동물모델에서 500 ㎎/㎏ 엉겅퀴 뿌리 물 추출물의 섭취가 유의적으로 다리의 부종을 개선한 것으로 보아 뚜렷한 염증반응 억제 효과를 나타내기 위해서 500 ㎎/㎏ 농도에 가까운 유효농도가 되어야만 이로운 효과를 나타내는 것으로 사료된다.

위와 같이 고농도의 엉겅퀴 뿌리 물 추출물은 류마티스 관절염 동물 모델에서 양성대조군으로 사용된 0.2 ㎎/㎏ methotrexate에 비해 류마티스 관절염 개선 효과적은 적었으나 체내의 염증반응 억제를 통해 염증매개물질의 생성 및 관절의 부종을 개선함을 통해 류마티스 관절염의 병리학적 특징을 감소시키는 것으로 보이지만, 이를 자세히 확인하기 위해 엉겅퀴 뿌리의 유효성분 분석과 조직 및 세포수준에서 어떤 단백질 신호전달 경로를 통해 염증반응을 개선하는지 밝히기 위해 추가적인 실험이 필요할 것으로 사료된다.