잣나무 (Pinus koraiensis Siebold et Zucc.) 잎은 2017년 6월 강원도 홍천 남면 (Hongcheon, Korea) 소재 잣나무 군락에서 채취하여 사용하였다. 시료는 상온에서 2 일, 45℃에서 2 일간 건조한 뒤 분쇄기 (Food Mixer, FM 909T, Hanil Electric Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 분쇄한 후 실험에 사용하였다.

추출물 제조에 사용된 감압농축기는 Evaporator N-1000 (EYELA, Tokyo, Japan), 동결건조기는 FDTA-4508 (OPERON, Kimpo, Korea), 생리활성 측정을 위한 UV/Vis spectrophotometer는 VersaMax (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), CO₂ incubator는 MCO-18AC (Panasonic Co., Osaka, Japan)을 사용하였다.

추출 및 분획에 사용된 용매 ethanol (EtOH), n-Hexane, ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH)는 대정화금 (Siheung, Korea)에서, 생리활성에 사용된 시약 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), [2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt] (ABTS), L-ascorbic acid (≥99.0%, MW: 176.12 g/mol), gallic acid (≥97.5 - 102.5%, MW : 17.012 g/mol), quercetin (≥95.0%, MW : 302.24 g/mol), epigallocatechin gallate (EGCG), ursolic acid, Folin & Ciocalteu’s phenol reagent, sodium carbonate (Na₂CO₃), potassium acetate, n-succinnyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide, collagenase from clostridium, elastase from porcine pancreas, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)사의 제품을 구입하여 사용하였다.

효소 활성 검정을 위하여 Procollagen Type I C-Piptide (PIP) Kit (Takara, Shiga, Japan)와 Matrix Metalloproteinase-1 (MMP-1), Biotrak ELISA System (Amersham, Buckinghamshire, Engaland)를 사용하였다.

삼각플라스크에 건조 시료 당 10 배 (v/w)에 해당하는 80% EtOH 을 이용하여 실온에서 24 시간 침출시켰다. 2 회 반복 추출한 뒤에 filter paper (No. 20, Hyundai micro Co., Ltd., Seoul, Korea)로 여과하여 사용하였다. 잣나무 잎 80% EtOH 추출물은 감압농축기로 감압 농축한 뒤, 동결 건조하였다.

동결 건조시킨 잣나무 잎 80% EtOH 추출물을 물에 용해시킨 뒤 동량의 n-Hexane을 가하여 분획하였다. 분획은 4 회 반복하였으며, 극성 순서에 따라 n-Hexane, EtOAc, n-BuOH 순으로 분획하였다. 분획이 완료된 각 분획물은 감압농축기로 감압 농축하여 잣나무 잎 분획물을 제조하였다.

DPPH 자유 라디칼 소거 활성은 Clarke 등 (2013)의 방법을 변형하여 실시하였다. Microplate에 농도별 시료 100 ㎕와 1.5 mM DPPH 100 ㎕를 넣어 암실에서 30 분간 반응시킨 후 UV/Vis spectrophotometer를 이용하여 517 ㎚에서 흡광도 값을 측정하였다. 양성대조군으로 butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), ascorbic acid를 사용하였으며 radical을 50% 소거하는데 필요한 농도 단위인 RC₅₀ (㎍/㎖)으로 결과를 산출하였으며 산출식은 다음과 같다.

DPPH scavenging activity (%) = [1 − (A/B)] × 100(A = control absorbance, B = sample absorbance)

ABTS 자유 라디칼 소거 활성은 Ozgen 등 (2006) 방법을 변형하여 실시하였다. 2.6 mM potassium persulfate (K₂S₂O₈)와 7.4 mM ABTS를 1 : 1 비율로 혼합하여 암조건에서 15 시간 반응하여 ABTS reagent를 제조하였다.

Microplate에 농도별 시료를 10 ㎕와 ABTS 90 ㎕를 넣어 상온에서 10 분간 반응하여 734 ㎚ 흡광도 값을 측정하여 ABTS 소거율을 다음과 같이 백분율 (%)로 산출하였고 BHA, BHT, ascorbic acid를 양성대조군으로 사용하였다.

ABTS scavenging activity (%) = [1 − (A/B)] × 100(A = control absorbance, B = sample absorbance)

총 페놀 함량은 Folin & Ciocalteu의 방법을 변형한 Singleton 등 (1999)의 방법으로 실시하였다. 1 ㎎/㎖ 농도의 시료 100 ㎕에 Folin-ciocalteu's phenol 50 ㎕을 첨가한 후 5 분간 상온에서 반응 후, 20% sodium carbonate (Na₂CO₃) 300 ㎕를 넣고 15 분간 반응시켰다.

반응시킨 용액에 1 ㎖의 증류수를 넣은 후 UV/Vis spectrophotometer를 이용하여 740 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid를 사용하였으며 0, 50, 100, 200 ㎍/㎖로 희석하여 검량선을 작성 후, gallic acid equivalents (㎎·GAE/g)로 나타내었다.

총 플라보노이드함량은 Kim 등 (2012)의 방법을 변형하여 실시하였다. 1 M potassium acetate 100 ㎕와 10% aluminum nitrate 100 ㎕를 넣어 혼합하여 준 후, 1 ㎎/㎖ 시료 500 ㎕를 첨가하여 40 분 동안 반응시킨 후, UV/Vis spectrophotometer를 이용하여 510 ㎚에서 흡광도 측정하였다. Flavonoid 함량은 quercetin를 표준물질로 하였으며, 0, 10, 50, 100 ㎍/㎖로 희석하여 검량선을 작성하고, quercetin equivalents (㎎·QE/g)로 나타내었다.

Collagenase 저해효과는 Wünsch and Heidrich (1963)의 방법을 변형하여 측정하였다. 잣나무 잎 추출물 및 분획물에 대한 collagenase 저해활성 측정은 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl₂와 0.3 ㎎/㎖ 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg를 녹인 기질액 500 ㎕에 시료 200 ㎕, 0.2 ㎎/㎖ collagenase 300 ㎕를 첨가하여 상온에서 20 분간 반응시킨 후, 6% citric acid 1 ㎖ 넣고 ethyl acetate 3 ㎖을 첨가한 뒤, 상등액을 320 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료 용액 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율 (%)로 나타내었다. 양성대조군으로 epigallocatechin gallate (EGCG)를 사용하였다.

잣나무 잎 분획별 elastase 저해활성은 Kwak 등 (2005)의 방법을 변형하여 측정하였다. Microplate에 잣나무 분획물별시료 40 ㎕ 넣고, 효소액 elastase 40 ㎕와 기질액 nsuccinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide 80 ㎕를 첨가하였다. 20 분간 반응시킨 뒤, 410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군은 ursolic acid를 사용하였다.

잣나무 잎 추출물 및 분획물을 HaCaT cell를 1 × 10⁴ cells/well씩 96 well plate에 분주하여 37℃의 5% CO₂ incubator에서 24 시간 배양하였다. 새로운 배지로 교체하고 100, 200, 400, 500 ㎍/㎖ 농도의 추출물을 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 5 ㎎/㎖의 thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT)를 첨가한 후 4 시간 동안 추가배양 하였으며 배양 후 형성된 formazan을 DMSO에 녹이고, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였고 세포생존율을 백분율로 표시하였다.

Procollagen 생합성 측정은 100, 200, 400, 500 ㎍/㎖ 농도의 잣나무 잎 시료를 HaCaT 세포에 처리한 후, 24 시간 배양하여 배지를 회수하여 procollagen 생합성에 미치는 변화를 procollagen type-I C-peptide EIA kit를 사용하여 procollagen의 함량을 측정하였다.

MMP-1 저해 활성 측정은 HaCaT 세포를 1 × 10⁴ cells/well 농도로 96 well plate에 분주한 후, 각 well에 잣나무 잎분획물 시료를 첨가하여 CO₂ incubator에서 24 시간 배양했다. MMP-1의 활성을 높이기 위하여 10 ng/㎖ tumor necrosis factor-α (TNF-α)를 첨가하였다. 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였으며, matrix metalloproteinase-1 biotrack activity assay kit를 이용하여 측정하였다.

모든 실험의 데이터는 통계처리를 통한 유의성 검정을 위해 Two-way ANOVA 분석을 실시하였다. 통계처리의 모든 데이터는 최소 3 반복 수행하여 평균 (means) ± 표준편차 (standard deviation)로 나타냈었다. 통계처리는 IBM SPSS Statistics v24 (SPSS, Chicago, IL, USA) 종합 소프트웨어를 사용하여 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의성을 검증하고, 통계적 유의성을 5% 수준에서 분석하였다 (p <0.05).

잣나무 (Pinus koraiensis Siebold et Zucc.) 잎의 추출물 및 분획물별 활성을 검정하기 위하여, DPPH 및 ABTS 항산화 활성 분석을 실시하였다. DPPH와 ABTS 자유 라디칼 소거활성 결과 EtOAc 분획물에서 RC₅₀값이 각 23.83 ± 1.15 ㎍/㎖, 6.11 ± 0.08 ㎍/㎖으로 가장 높은 활성을 확인하였다. DPPH와 ABTS의 자유 라디칼 소거활성 결과 EtOAc, n-BuOH, 80% EtOH, Water, n-Hexane의 순으로 활성이 우수하였다 (Table 1).

잣나무 잎 추출물과 대조군인 (+)-α-tocopherol의 자유 라디칼 소거활성 (FSC₅₀)값을 측정한 결과 EtOAc 분획물이 50% EtOH 추출물에 비해 약 2 배의 소거활성 값 차이를 나타낸다고 보고하였으며 (Kim et al., 2010), 이는 본 연구에서 EtOAc 분획물이 80% EtOH 추출물에 비해 높은 활성을 가지는 결과와 유사하였다. 이와 같은 결과를 통해 잣나무 잎추출물에서 자유 라디칼 소거활성에 관여된 물질이 EtOH 추출물에서 EtOAc로 분획되는 과정에서 다수 함유되는 것으로 생각된다.

잣나무 잎 추출물 및 분획물의 총 페놀 함량은 gallic acid를 표준물질로 하여 측정하였다. 그 결과 EtOAc 분획물에서 259.09 ㎎·GAE/g으로 가장 높은 값을 보였다. 80% EtOH 추출물과 n-BuOH 분획물은 각 109.00 ㎎·GAE/g, 114.55 ㎎·GAE/g으로 유사한 값을 보였고, water 분획물 26.10 ㎎·GAE/g, n-Hexane 분획물 23.69 ㎎·GAE/g 순이었다 (Fig. 1).

Fig. 1.  Total phenolic contents of 80% ethanol leaf extract and different solvent fractions in P. koraiensis.

¹⁾GAE; gallic acid equivalents. ²⁾EW; amount of extract and fractions. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown (n = 3). ^*Means within a row followed by the same letter are not significantly different based on the Duncan's Multiple Range Test (DMRT, p < 0.05).

총 플라보노이드 함량은 quercetin을 표준물질로 하여 측정하였고, 그 결과 80% EtOH 추출물에서 49.48 ㎎·QE/g, EtOAc 분획물에서 49.41 ㎎·QE/g, n-Hexane 분획물에서 27.79 ㎎·QE/g값을 보였으며, n-BuOH 분획물과 water 분획물에서는 검출되지 않았다 (Fig. 2).

Fig. 2.  Total flavonoid contents of 80% ethanol leaf extract and different solvent fractions in P. koraiensis.

¹⁾QE; quercetin equivalents. ²⁾EW; amount of extract and fractions. ND; not detected. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown (n = 3). ^*Means within a row followed by the same letter are not significantly different based on the Duncan's Multiple Range Test (DMRT, p < 0.05).

Kwak과 Choi (2015)는 복숭아꽃의 EtOH 추출물과 EtOAc, butanol을 이용하여 분획한 분획층의 총 페놀과 플라보노이드 함량을 검정한 결과 총 페놀 함량은 EtOAc 분획층에서 394.6 ㎎·tannic acid/g으로 가장 높은 함량을 나타났으며, butanol 분획층의 경우 128.3 ㎎·tannic acid/g, EtOH 추출물에서 78.1 ㎎·tannic acid/g 순이었다고 하였고 총 플라보노이드의 상대적 함량은 EtOAc 분획층이 253.7 ㎎·rutin/g, butanol 분획층이 93.1 ㎎·rutin/g, EtOH 추출물이 55.3 ㎎·rutin/g 순으로 나타났다고 보고하였다.

이상의 보고를 본 연구 결과와 비교하여보면 추출물 및 분획층의 상대적 함량 차이에 있어서 총 페놀화합물의 경우 추출물 및 분획층 시료별 차이는 유사하게 나타났다. 하지만 총 플라보노이드 함량에서는 EtOAc 분획층과 80% EtOH 추출물이 높은 함량으로 확인되었으나 n-BuOH, water 분획물에서 측정되지 않은 부분은 차이가 있었다. 이는 실험재료, 용매제의 용량 그리고 희석의 정도에 따라 나타나는 상대적 함량의 차이라고 여겨지며, 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

잣나무 잎 추출물 및 분획물이 가지는 주름 개선 효능 평가를 위하여 collagenase와 elastase의 저해활성에 미치는 영향을 확인하였다. 모든 시험은 250 ㎍/㎖의 동일한 농도로 처리하여 진행하였다.

Collagenase 저해활성은 잣나무 잎의 80% EtOH 추출물에서 20.27%로 가장 높은 저해율을 나타내었는데, 대조군으로 사용된 단일물질인 EGCG의 9.58% 저해율보다 약 2.1 배 높은 저해율을 보였다. n-BuOH 분획물에서 7.45% 저해율을 보였으며, n-Hexane, EtOAc, water 분획물에서는 저해 활성을 확인하지 못하였다 (Table 2).

Elastase 저해활성은 n-Hexane 분획물에서 14.71%로 가장 높은 저해활성을 확인했으며, 80% EtOH 추출물에서 7.50%의 저해율을 나타내었다. 반면 EtOAc, n-BuOH, water 분획물에서는 저해 활성이 낮거나 확인하지 못하였다 (Table 2).

Jeon (2018)은 HDF human dermal fibroblast 세포에 대한 잣나무 잎 추출물의 collagen 생성 촉진능 변화를 관찰하기 위해 잣나무 잎 추출물을 HDF 세포에 48 시간 처리 후 배양 상층액을 ELISA 방법으로 분비된 collagen의 함량을 측정한 결과 100 ㎍/㎖ 농도의 70% EtOH 추출물에서 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 7.62%의 가장 높은 collagen 생성능 증가를 보였으며, 농도 의존적으로 collagen이 촉진됨을 확인하였다고 보고한 바 있다. 이러한 보고와 본 연구에서의 collagenase와 elastase 저해활성을 동시에 만족하는 잣나무 잎 80% EtOH 추출물은 주름 개선 기능성 소재로의 사용 가능성이 있는 것으로 기대된다.