총 60 개의 대추 품종에 대하여 어린잎을 수집하였으며 충청북도 농업기술원 (36°34′38.7″N, 127°44′52.9″E)에서 42 개, 국립산림품종관리센터 (36°87′70.1″N, 127°97′35.9″E)에서 16 개, 보은군 대추 농가로부터 알려지지 않은 품종의 대추 유전자원 2 개를 수집하였다 (Table 1). 샘플 수집은 질병이나 해충 피해가 없는 건강한 잎으로 채집되었고 수집된 잎은 -70℃의 초저온 냉동고에 보관하였다.

NGS 분석을 위한 genomic DNA (이하 gDNA)는 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였으며 PCR 분석용 gDNA는 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 방법을 사용하여 추출하였다 (Doyle and Doyle, 1990). 추출한 DNA는 DeNovix^® DS-11+ spectrophotometer (DeNovix Inc., Wilmington, DE, USA)를 사용하여 측정하고 polymerase chain reaction (PCR)에 사용할 DNA 농도를 정량하였다.

국내 대추 품종 6 종에 대한 NGS 분석을 Illumina HiSeq 2500 platform (Illumina, San Diego, CA, USA)의 151 bp paired-end sequencing을 사용하여 Macrogen사 (Seoul, Korea)에 의뢰하여 수행하였다.

복조 (Bokjo), 보은 (Boeun), 추석 (Chuseok), 무등 (Mudeung), 금성 (Geumseong), 월출 (Wolchul) 등 6 개의 대추 품종에 대한 NGS data는 National Agricultural Biotechnology Information Center (NABIC) Sequence Read Archive (BioProject ID: NN-7295, NN-7296, NN-7297, NN-7298, NN-7299, NN-7300)에 등록하였고, InDel 구간 탐색은 CLC Genomics Workbench (ver. 11.0, Qiagen, Aarhus, Denmark)을 이용하였다. NGS 분석 결과로 얻은 read들을 trimming 과정을 통해 유전체의 품질을 높인 후 assembly 과정을 통하여 contig를 작성하였다. 각 6 종의 품종의 contig들을 상호비교 하여 InDel이 예상되는 구간을 탐색하였다.

프라이머는 CLC Main Workbench (ver. 8, Qiagen, Aarhus, Denmark)를 사용하여 설계하였으며 InDel 부위를 포함하도록 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 각각 디자인 하였다.

프라이머 디자인의 매개 변수는 프라이머 길이를 18 bp - 28 bp, G + C 함량은 0.4 - 0.6, annealing 온도는 48℃ - 58℃, 프라이머 쌍 사이의 annealing 온도 차이 5℃ 이하, 증폭 산물 길이 500 bp 이하로 하였다.

PCR은 T100™ Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하였고 PCR 반응은 10 ng/㎕ 농도의 gDNA 2㎕, Taq mix (0.25 U/㎕ Taq DNA polymerase, 2 × PCR buffer, 0.4 mM dNTPs, 3.2 mM MgCl₂, 0.02% bromophenol blue) 10 ㎕, 정방향 프라이머 (5 μM) 2 ㎕, 역방향 프라이머 (5 μM) 2 ㎕, 3 차 증류수 4 ㎕ 로 총 용량 20 ㎕ 으로 PCR 증폭을 수행하였다.

PCR 조건은 95℃에서 pre-denaturation 3 분, 95℃에서 denaturation 30 초, 51℃에서 annealing 30 초, 72℃에서 extension 1 분으로 총 35 회 반복하였으며, 72℃에서 final extension 10 분을 실시하였고, PCR 산물은 -20℃의 냉동고에 보관하였다.

분석된 유전자원간 염기서열 크기의 차이가 10 bp 이상으로 큰 경우 전기영동을 이용하여 다형성을 관찰하였고 10 bp 이하의 작은 사이즈 경우에는 fragment analyzer로 분석하였다.

전기영동에 사용된 gel은 3% 아가로스로 만들었으며 EtBr (ethidium bromide)를 사용하여 DNA를 염색하였다. Gel은 1 × TAE 용액에 넣고 PCR product를 분주하였으며 밴드의 크기를 비교하기 위하여 1 kb ladder plus (Dongshengbio Company Ltd., Guangdong, China)를 함께 분주하였다. 전기 영동은 120 V에서 30 분 동안 수행하였고 Gel Doc™ XR+System (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)을 사용하여 밴드를 시각화하였다.

전기영동으로 구별이 어려운 작은 사이즈의 다형성을 분석하기 위해서는 DNA Fragment Analyzer™ Automated CE System (Advanced Analytical Technologies, Ames, IA, USA)를 사용하였다. Fragment 분석에는 PCR product, TE buffer, 930 dsDNA Inlet buffer, dsDNA 905 gel, capillary conditioning soln, intercalating dye, 35 - 400 bp DNA ladder, 1 bp lower and 500 bp upper markers가 사용되었다.

클로닝을 위하여 정제된 PCR product를 TOPcloner™ TA Kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용하여 pTOP TA V2 vector와 ligation 반응을 수행하였다. Ligation 산물을 Escherichia coli DH5α competent cells에 형질전환 시킨 후 ampicillin 함유 (50 ㎍/㎖) LB 고체 배지에 도말하였다. 형성된 콜로니를 ampicillin 함유 (50 ㎍/㎖) LB 액체 배지에 접종한 후 하룻밤 동안 진탕배양한 후 Biomedic^® Plasmid DNA Miniprep Kit (Medico Co., Ltd., Ansan, Korea)를 사용하여 plasmid DNA를 정제하였다. 정제한 plasmid DNA의 염기서열분석은 벡터의 프라이머 (M13-F, M13-R)를 사용하여 수행하였다.

염기서열 분석은 Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 염기서열 분석용 PCR 반응을 수행한 후, ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열 결정 결과는 Lasergene SeqMan (ver. 7.0.0, DNASTAR, Madison, WI, USA) 프로그램을 이용하여 정리하였다.

CLC Genomics Workbench와 CLC Main Workbench를 이용하여 NGS 데이터로부터 얻은 품종별로 조립된 contig들을 비교하여 InDel locus를 탐색하였고 (Fig. 1), 해당 locus를 증폭하기 위한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 각각 디자인하였다 (Table 2).

Fig. 1.  InDel locus sequence of the developed markers. A; Zj-InDel-1, B; Zj-InDel-2.

In silico에서 발견한 InDel locus가 실제 실험결과와 일치하는지 여부와 디자인된 프라이머가 정상적으로 작동하는지 확인하기 위해 PCR 분석을 수행하였고 전기영동과 fragment analyzer를 이용하여 다형성을 분석하였다. 그 결과 두 개의 프라이머 세트가 모두 성공적으로 증폭되었으며 무등, 금성, 월출, 천상 품종으로부터 복조, 보은, 추석을 구분하는 Zj-InDel-1 마커와 무등, 금성, 월출, 천상, 복조 품종으로부터 추석, 보은 품종을 구분하는 Zj-InDel-2 두 개의 InDel 마커가 개발되었다.

개발된 Zj-InDel-1 마커와 Zj-InDel-2 마커를 이용하여 58 개의 품종과 보은군에서 수집한 2 개의 대추자원을 대상으로 genotyping을 실시하였다. 전기영동을 실시하여 다형성을 분석하였고 fragment analyzer를 이용하여 10 bp 이하의 작은 염기서열의 차이를 분석하였다.

전기영동 분석 결과 Zj-InDel-1 마커에서는 천상, 취조왕, 금성, 호대추, 화전대추, 이부, Jd-12, Jh-9, 령조, 매추, 무등, 설조, 의성-C, 월출, 월광 품종이 444 bp 크기의 밴드를 형성하였고, 6월선조, 보은, 복조, 보로호조, 봉산취조, 차이나브라운, 차전조, 첨화동조, 춘향17호, 추석, 대백조, 대립종, 대설조, 금창1호, 금사, 금사1호, 홍안, 홍조, 화전옥조, 일본, Je-1, 제남고대실조, Jg-10, Jj-1, Jk-4, 조취왕조, 중대립종, 국광, 마반조, 미조, 무핵홍조, 산동복조, 상왕, 센터미, 태상왕, 티벳대과종, 티벳왕, 왕대추, 월광조, 월령, 양내조 품종은 341 bp 크기의 밴드를 형성하였다. 또한 Market-1, Market-2는 545 bp 크기의 밴드를 형성하였으며 동조, 산조 품종은 349 bp 크기의 밴드를 형성하여 Zj-InDel-1 마커에서 총 4 개의 유전자형을 나타냈다 (Fig. 2-A).

Fig. 2.  Results of electrophoresis performed on 60 Z. jujuba genetic resources using two Z. jujuba InDel markers.

A; Zj-InDel-1, B; Zj-InDel-2.

Zj-InDel-2 마커에서는 보은, 취조왕, 화전대추, 이부, Jk-4, 령조, 매추, 산조, 월광 품종이 188 bp 크기의 밴드를 형성하였고 복조, 봉산취조, 차전조, 금성, 호대추, 홍안, Jd-12, Jg-10, 조취왕조, 마반조, 무등, 설조, 티벳대과종, 의성-C, 월출, Market-1, Market-2 품종이 222 bp 크기의 밴드를 형성하였으며 보로호조, 차이나브라운, 첨화동조, 춘향17호, 추석, 대백조, 대립종, 대설조, 동조, 금사, 금사1호, 홍조, 화전옥조, Je-1, 제남고대실조, Jh-9, Jj-1, 중대립종, 국광, 미조, 무핵홍조, 산동복조, 상왕, 센터미, 태상왕, 티벳왕, 월광조, 월령, 양내조 품종은 188 bp와 222 bp 두 개의 밴드를 모두 갖는 유전자형을 나타냈다. 6월선조, 금창1호, 일본, 왕대추 품종은 fragment analyzer 분석 결과 188 bp와 213 bp 사이즈의 밴드를 나타내어 앞서 나타난 유전자형과는 다른 유형을 나타냈다 (Fig. 2B).

본 연구에서 개발한 두 마커 Zj-InDel-1, Zj-InDel-2를 60 개의 대추 유전자원에 적용하여 분석한 결과를 바탕으로 각 마커의 통계적 분석을 실시하였다. 분석은 PowerMarker version 3.25를 사용하여 major alleles frequency (MAF), genotype number (GN), allele number (AN), gene diversity (GD), heterozygosity (H), polymorphism information content (PIC)를 분석하였다 (Liu and Muse, 2005).

MAF 값은 Zj-InDel-1에서 0.683, Zj-InDel-2에서 0.542, 평균 0.613의 값을 나타냈다. GN값은 Zj-InDel-1과 Zj-InDel-2 모두 4 개로 나타났다. GD는 Zj-InDel-1에서 0.468, Zj-InDel-2에서 0.525, 평균 0.497의 값을 나타냈다. H는 Zj-InDel-1는 0, Zj-InDel-2는 0.55값을 나타냈으며 PIC는 Zj-InDel-1가 0.408, Zj-InDel-2가 0.418, 평균이 0.413값을 나타냈다 (Table 3).

Zj-InDel-1 마커로 genotyping한 결과 in silico에서 발견되지 않은 유전자형이 나타남에 따라 유전자형 분석에서 발견된 서로 다른 4 가지 크기의 밴드의 염기서열을 확인하기 위하여 무등, 동조, 추석, Market-1에 대하여 PCR product를 클로닝 하여 염기서열 분석을 수행하였다. 무등과 동조는 13 개의 클론, 추석은 14 개의 클론, Market-1은 10 개의 클론에 대하여 성공적으로 염기서열 분석을 수행하였다. 품종별로 분석한 염기서열 결과는 CLC Main Workbench를 이용하여 assembly 작업을 거친 뒤 consensus를 형성하였으며 alignment 툴을 사용하여 비교하였다.

그 결과 해당 InDel locus에서 CAATTATTTTGAATTGAAAAAGGTTTCATCCTATTTTTATTTTATCATATATAGAGAAGAGATACTCCGGATTCTCGCAAGGGATAATCACTTTTTTTTTT의 서열을 가지는 101 bp 길이의 반복구간을 확인할 수 있었다. 341 bp를 형성하였던 추석은 InDel locus에서 101 bp 크기의 반복 염기서열이 1 회 반복되어 있었으며, 444 bp를 형성하던 무등은 101 bp 크기의 반복 염기서열이 2 회 반복되어 있었고, 545 bp 크기의 서열이 나타난 Market-1의 경우 101 bp 크기의 반복 염기서열이 3 회 반복되어 있는 것을 알 수 있었다. 349 bp를 형성하였던 동조의 경우 추석과 비교하였을 때 증폭 부위에 A, T, T, TAAAT 등의 InDel 부위가 추가로 있는 것이 확인되었다.

본 연구에서 개발된 Zj-InDel-1와 Zj-InDel-2 마커를 이용하여 60 개의 대추 유전자원을 분석한 결과를 이용하여 계통수 분석을 수행했다. 유전적 유사성 계수는 분자 진화 유전분석 프로그램인 MEGA version 7을 사용하여 계산되었고 유전적 거리는 PowerMarker version 3.25를 이용하여 shared allele distance 방법으로 계산되었다 (Liu and Muse, 2005; Kumar et al., 2016).

계통수는 unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) 방식으로 작성하였으며 분석 결과 60 개의 품종에 Zj-InDel-1, Zj-InDel-2 두 개의 마커를 적용해 보면 총 10 개의 그룹으로 나누어짐을 볼 수 있었다. 동조, 산조, Jh-9는 두 개의 마커로 나머지 품종들로부터 각각의 품종이 구분되었으며 나머지 57 개의 품종은 7 개의 그룹을 형성하였다. 첫 번째 그룹은 보은, Jk-4가 속하였다. 두 번째 그룹은 6 월선조, 금창1호, 일본, 왕대추 품종이 속하였다. 세 번째 그룹은 복조, 봉산취조, 차전조, 홍안, Jg-10, 조취왕조, 마반조, 티벳대과종 품종이 속하였다. 네 번째 그룹은 태상왕, 티벳왕, 월광조, 월령, 양내조, 보로호조, 차이나브라운, 첨화동조, 춘향17 호, 추석, 대백조, 대립종, 대설조, 금사, 금사1호, 홍조, 화전옥조, Je-1, 제남고대실조, Jj-1, 중대립종, 국광, 미조, 무핵홍조, 산동복조, 상왕, 센터미가 속하였다. 다섯 번째 그룹은 Market-1, Market-2가 속하였다. 여섯 번째 그룹은 천상, 금성, 호대추, Jd-12, 무등, 설조, 의성-C, 월출 품종이 속하였다. 일곱번째 그룹은 매추, 월광, 취조왕, 화전대추, 이부, 령조가 속하였다 (Fig. 3).

Fig. 3.  Phylogenetic analysis of 60 Z. jujuba genetic resources analyzed using 2 InDel markers.

Arrows indicate the major Korean jujube cultivars.