APP Swedish 유전자가 과잉 발현되는 생쥐유래 신경세포주인 Neuro2a (APP_swe)는 5% fetal bovine serum (FBS, Capricorn scientific, Ebsdorfergrund, Germany), penicillin streptomycin (P/S, Lonza, Walkersville, MD, USA), L-glutamine (GE healthcare Hycolone, Logan, UT, USA), hygromycin B (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)가 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM, Lonza, Walkersville, MD, USA) and Opti-MEM (Gibco, Grand Island, NY, USA)의 혼합 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하여 사용하였다.

박태기나무 (Cercis chinensis Bunge) 씨앗은 ㈜다농 (Namyangju, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 시료는 증류수로 세척 하여 건조한 뒤 분쇄하였다. 분쇄한 시료 (400 g)의 10 배 (v/w)에 해당하는 50% ethanol을 이용하여 50℃에서 2회 진탕 추출하였다. 추출액은 5μm 필터로 여과한 후 감압농축 (rotary evaporator: R100+B100, Lab scitech, Corona, CA, USA) 하고 7 일간 동결 건조하여 추출물 약 31.9 g (수율: 8.0%)을 얻었다. 일정량의 dimethyl sulfoxide (DMSO, Biolife solution Inc, Bothel, WA, USA)에 추출물을 용해하여 실험에 사용하였다.

사용한 시약은 다음과 같다. β-secretase inhibitor Ⅳ, γ-secretase inhibitor Ⅸ (Calbiochem, Darmstadt, Germany), galantamine (Cayman chemical, Ann Arbor, MI, USA), acetylcholinesterase from Electrophorus electricus, protease inhibitor (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), antihuman sAPPα monoclonal antibody 2B3 (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan), rabbit anti-amyloid precursor protein polyclonal antibody CT20 (Calbiochem, Darmstadt, Germany), rabbit anti-actin polyclonal antibody (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), rabbit APP369 polyclonal antibody (Sam et al., 2020) human amyloid β (1-40), human amyloid β (1-42), human APP β-CTF ELISA kit (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan), cell viability EZ-cytox assay kit (CCK-8), acetylcholinesterase activity colormetric assay kit (Dogen bio Co., Ltd., Seoul, Korea)를 사용하였으며, 그 밖의 시약은 특급을 사용하였다.

APP_swe 세포주로부터 분비되는 Aβ의 양을 측정하기 위해 sandwich ELISA를 수행하였다. 6 well plate (SPL life science Inc., Pocheon, Korea)에 세포 농도가 1×10⁶ cells/well이 되게 배양한 뒤 serum-free DMEM으로 희석한 CCS를 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 16 시간동안 처리한 후 배양액을 protease inhibitor의 존재 하에 회수하여 시료로 사용하였으며 양성대조군으로 β-secretase inhibitor Ⅳ 10 μM를 사용하였다.

Aβ (35-40) 특이적 monoclonal antibody 또는 Aβ (38-42) 특이적 polyclonal antibody가 각각 coating된 plate에 100 ㎕ 의 시료를 넣고 4℃에서 16 시간 동안 반응시키고 7 회 세척한 후, horseradish peroxidase (HRP) conjugation된 Aβ (11-28) 특이적 monoclonal antibody를 4℃에서 1 시간 동안 반응 시켰다. 다시 9 회 세척한 후 tetramethyl benzidine (TMB) 기질액을 넣고 실온에서 30 분 동안 반응시킨 후 정지액 100 ㎕를 첨가하여 450 ㎚에서 microplate reader (Model 680, Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

EZ-cytox kit를 사용하여 CCS의 APP_swe 세포주에 대한 세포독성을 측정하였다. 96 well plate (SPL life science Inc., Pocheon, Korea)에 5×10³ cells/well이 되게 배양한 뒤 CCS을 1, 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 16 시간 처리하였다. Water-soluble tetrazolium 용액 10 ㎕를 첨가하여 1 시간 배양한 후, 450 ㎚에서 microplate reader (Model 680, Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

APP_swe 세포주를 6 well plate (SPL life science Inc., Pocheon, Korea)에 1 × 10⁶ cells/well이 되도록 배양한 뒤 serum-free DMEM으로 희석한 CCS 10, 50, 100 ㎍/㎖ 또는 양성대조군인 β-secretase inhibitor Ⅳ 10 μM을 16 시간 처리하였다. Protease inhibitor가 포함된 cell lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.5% sodium deoxycholate, 0.5% NP-40, 5 mM EDTA)를 넣고 초음파 분쇄하여 시료로 사용하였다.

Bicinchonic acid (BCA) protein assay reagent (Thermo Fisher Inc., San Jose, CA, USA)를 이용하여 정량한 뒤, 단백질 50 ㎍을 7%, 10% tris-glycine 또는 16.5% tris-tricine SDS-PAGE로 분리한 후, immunoblotting에 의해 APP, sAPPα, APP carboxy terminal fragment (CTF) 등의 단백질 양상을 Azure C-600 (Azure Biosystems, Dublin, CA, USA)을 이용하여 측정하였다 (Smith et al., 1985).

3 회 반복 실험으로 얻어진 단백질 밴드를 Image J software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)에 의해 정량하였으며 actin 밴드를 기준으로 보정하였다 (Leem et al., 2002).

APP_swe 세포주를 6 well plate (SPL life science Inc., Pocheon, Korea)에 1×10⁶ cells/well이 되도록 배양한 뒤 serum-free DMEM으로 희석한 CCS를 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, β-secretase inhibitor Ⅳ 10 μM을 양성대조군으로 16 시간 동안 처리하였다.

Protease inhibitor가 포함된 Tris-NaCl-EDTA (TNE) buffer [50 mM Tris-HCL (pH 7.5), 140 mM NaCl, 5 mM EDTA], 0.5% NP-40를 넣은 후 1 분간 강하게 vortexing 하였으며 4℃에서 10,000 rpm으로 10 분간 원심분리한 뒤 상층액을 사용하였다. 상층액은 BCA protein assay regent를 이용하여 정량한 뒤 human APP β-CTF ELISA kit를 사용하여 그 양을 정량하였다.

AChE는 신경 반응과 기능에 관련하여 중요한 효소 중 하나로서 신경 전달 물질인 acetylcholine을 가수분해하는 serine protease이다. CCS의 AChE 억제 활성을 측정하기 위해 acetylcholinesterase activity colorimetric assay kit (Dogen bio Co., Ltd., Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다.

96 well plate에 DMSO 또는 CCS를 1, 10, 50, 100㎍/㎖의 농도로 첨가하고, AChE (Electrophorus electricus)를 각각 30 ㎕와 10 ㎕씩 넣은 후 reaction mixture (1 assay 기준, AChE assay buffer; 45 ㎕, AChE enzyme mix; 2㎕, AChE probe; 2㎕, AChE substrate; 1㎕)를 50 ㎕씩 넣고 차광하여 실온에서 20 분 반응 후 microplate reader (Model 680, Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

대조 약물로 galantamine 10 μM을 사용하였으며, 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 AChE의 활성 100%로 하여, 각 시료에 대한 억제 활성을 백분율로 3 회 반복하여 분석한 후 통계 처리하였다 (Kim et al., 2014; Lee et al., 2021).

모든 생리활성 실험은 3 회 반복 실험을 통해 mean ± standard error 값으로 나타내었다. 통계분석은 S tudent’s t-test와 One-way ANOVA test (Graph Pad Prism 5 software, La Jolla, CA, USA)를 실시한 후 0.1%, 1% 및 5%의 유의수준으로 검정하였다 (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

CCS의 활성을 평가하기 전 APP_swe 세포주에서 추출물이 갖는 세포독성을 확인하였다 (Fig. 1). 그 결과 CCS 50, 100㎍/㎖에서 각각 16.9, 32.1%의 세포독성을 나타내었다.

Fig. 1.  Effects of 50% ethanol extract of Cercis chinensis Bunge seed on the APP_swe cell viability.

APP_swe cells were cultured at confluency in a 96-well plate with various concentrations (1, 10, 50, 100 ㎍/㎖) of 50% ethanol extract of Cercis chinensis Bunge seed (CCS) for 16 h. Cells were added to the EZ-Cytox reagent and incubated for 1 h. The absorbance at 450 ㎚ was measured using a microplate reader. Data are means ± SE of three independent experiments. [*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 between treated and control cells by One-way ANOVA test using Graph Pad Prism 5 software. C; negative control, treatment of 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO)].

식용 가능한 소재로 인정받기 위해서는 식품의약품안전처에 해당 원료가 인체에 위해가 없음을 확인할 수 있는 과학적 자료를 제출하여야 한다 (MFDS, 2016). 한편, CCS는 이미 식용 가능한 소재로 고시되어있다. APP_swe 세포주에서 농도가 증가함에 따라 세포독성이 있었으나 CCS를 천연물 의약품이나 건강기능식품 소재로 사용하는 데 있어, 제한이 되지 않을 것이라 사료된다. 더불어 CCS는 뒤에 언급되는 효능검정 단계에서 독성이 거의 보이지 않는 10 ㎍/㎖의 농도에서도 유의적인 효능을 확인할 수 있었다. 또한, 50, 100 ㎍/㎖에서도 세포독성을 고려하여도 더 강한 활성을 나타내었다.

Aβ의 증가는 AD의 중요한 병리 현상 중 하나이다. APP 단백질의 대사에 관여하는 효소는 α-secretase, β-secretase, γ-secretase가 있으며 α-secretase와 β-secretase는 서로 경쟁적으로 작용한다. Aβ는 β-secretase 및 γ-secretase에 의해 생성되며, Aβ의 생성을 감소시키기 위해 β-secretase 또는 γ-secretase를 표적으로 하는 것이 바람직하다.

정상인의 경우 Aβ는 정상적으로 분해되거나 central nervous system (CNS) 밖으로 배설되어 체내 항상성을 유지하나, AD 환자의 뇌 조직 내 Aβ 농도는 정상보다 100 배 또는 1,000 배 높아져 있다. 이는 생성이 비정상적으로 증가하거나, 배출 기능이 저하되어 있음을 시사하는 것이다 (Han, 2009). Aβ 중에는 Aβ_1-40과 Aβ_1-42가 대부분이며 특히, Aβ_1-42의 경우 Aβ_1-40에 비해 뇌에 축적되기 쉽고 더 많은 독성을 나타낸다고 보고되어 있다 (Eum et. al., 2008; Cuppus et al, 2012).

본 연구에서는 α-secretase, β-secretase, γ-secretase를 표적으로 하여 APP 대사 및 Aβ 억제 활성에 대한 CCS의 효과를 확인하고자 하였다.

첫 번째로 Aβ_1-40, Aβ_1-42 ELISA를 수행하여 APP_swe 세포에서 Aβ 분비에 대한 CCS의 효과를 확인하였다. 그 결과, CCS는 10, 50 및 100 ㎍/㎖에서 Aβ_1-40 및 Aβ_1-42 분비를 감소시켰으며 특히, Aβ_1-42를 농도 의존적으로 감소시켰다. 양성대조군으로 사용한 B-SI (β-secretase inhibitor)와 CCS 100㎍/㎖의 Aβ_1-42 억제 활성을 비교하였을 때 더 강한 활성을 나타내었다. 10 μM 양성대조군을 농도로 환산하면 5.97 ㎍/㎖에 해당한다. 단일 성분인 양성대조군에 비하여 천연물인 CCS의 경우 더 높은 농도에서 동등한 활성을 나타내지만, 천연물의 경우 여러 성분의 상호작용으로 활성을 나타내며 천연물에서 추출한 물질의 경우 화학 의약품보다 안전성과 유효성이 우수한 것이 입증되었다 (Kim, 2006).

50% 억제율을 나타내는 IC₅₀값은 Aβ_1-40에서 45.02 ㎍/㎖, Aβ_1-42에서 43.48 ㎍/㎖을 나타내었으며, 이는 앞에서 기술한 세포독성을 고려하더라도 현저한 억제 활성을 나타내었다 (Fig. 2).

Fig. 2.  Effects of 50% ethanol extract of Cercis chinensis Bunge seed on the secretion of β-amyloid.

APP_swe cells were treated with DMSO (control) or various concentrations (10, 50, 100 ㎍/㎖) of 50% ethanol extract of Cercis chinensis Bunge seed (CCS) for 16 h. The supernatant was used for Aβ40/42 ELISA. Data are means ± SE of three independent experiments. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 between treated and control cells by One-way ANOVA test using Graph Pad Prism 5 software. C; negative control, treatment of 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO), β-secretase inhibitor 10 μM (β-si); positive control, treatment of 10 μM of β-secretase inhibitor, Aβ40; β-amyloid 40, Aβ42; β-amyloid 42).

APP의 대사과정에서 아밀로이드 생성경로로서 β-secretase가 작용하면 APP는 s APPβ와 β-CTF로 분해된다. β-CTF는 γ-secretase의 작용으로 Aβ와 ACID (P6)로 분해된다. 반면 비아밀로이드 생성경로에서 α-secretase가 작용하면 s APPα와 α-CTF로 분해되며, α-CTF는 γ-secretase의 작용으로 P3와 ACID (P6)로 분해된다 (Soriano et al, 2001; Epis et al., 2012). Fig. 2의 결과를 바탕으로 CCS가 Aβ의 분비를 억제하는 데 있어 어떠한 경로로 작용하는지 확인하기 위해 β-CTF를 ELISA 방법으로 정량하였다. 그 결과 CCS는 농도 의존적으로 β-CTF 대사량을 증가시켰다 (Fig. 3).

Fig. 3.  Effects of 50% ethanol extract of Cercis chinensis Bunge seed on the β-carboxy-terminal fragment (β-CTF).

APP_swe cells were treated with DMSO (control) or 50% ethanol extract of Cercis chinensis Bunge seed (CCS) for 16 h. The cells were lysed using TNF buffer, and the lysate was analyzed using ELISA. (A) β-CTF level after CCS treatment. (B) The concentration of β-CTF after CCS treatment. Data are means ± SE of three independent experiments. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 between treated and control cells by One-way ANOVA test using Graph Pad Prism 5 software. C; negative control, treatment of 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO), β-secretase inhibitor 10 μM (β-si); positive control, treatment of 10 μM of β-secretase inhibitor).

한편, CCS가 APP 대사에 미치는 영향을 확인하기 위해 APP, sAPPα, CTF 단백질 발현 수준을 western blot으로 확인하였다. CCS의 농도가 증가함에 따라 APP 단백질 발현이 감소하는 경향을 보였으나, sAPPα 분비량은 증가시켰다 (Fig. 4A and B). 또한, tris-tricine gel로 CTF 발현 양상을 확인하였을 때, CCS는 α-CTF와 β-CTF를 모두 증가시키는 경향을 나타내었으며 양성대조군으로 사용한 γ-SI (γ-secretase inhibitor)와 유사한 경향을 나타내었다 (Fig. 4C). β-CTF가 감소하지 않고 증가하는 것은 CCS가 β-secretase를 억제하지 않는다는 것을 알 수 있다.

Fig. 4.  Effects of 50% ethanol extract of Cercis chinensis Bunge seed on the metabolism of amyloid precursor protein.

APP_swe cells were treated with DMSO (control) or 50% ethanol extract of Cercis chinensis Bunge seed (CCS) for 16 h and lysed with a cell lysis buffer. The cell lysate or condition media was loaded on 7% SDS-PAGE and 16.5% Tris-tricine gel analyzed by immunoblotting. (A) mouse anti-sAPPα (2B3) monoclonal antibody (1 : 400) (B) rabbit anti-APP polyclonal antibody (1 : 10,000) (C) rabbit APP369 polyclonal antibody (1 : 1,000). Protein levels were quantified by the relative expression to actin using ImageJ 1.37 software. Data are means ± SE of three independent experiments.

CCS가 β-secretase와 경쟁적으로 작용하는 α-secretase를 표적으로 하여 효소 활성의 증가로 Aβ의 생성을 줄인다면 β-CTF는 감소하고 sAPPα와 α-CTF만 증가하는 경향을 나타내야 하지만, CCS는 α-CTF와 β-CTF를 모두 증가시켰다. 위의 결과를 종합하면, CCS가 γ-secretase를 억제하여 Aβ를 감소시키는 것으로 제안한다. 이러한 결과는 Fig. 3에서 얻어진 β-CTF의 ELISA 정량 결과와 일치한다 (Chasseigneaux and Allinquant, 2012). 추후 각 secretase의 효소 활성을 측정하는 실험을 통해 CCS가 각 효소의 활성에 미치는 영향을 확인할 필요가 있다.

AChE 억제제는 donepezil, galantamine, rivastigmine 등이 임상에서 AD 치료제로 사용되고 있으며 그 중, galantamine은 수선화과 구근과 꽃에서 분리된 알칼로이드이며 그 외에도 다양한 식물의 플라보노이드가 AChE의 활성을 억제하는 것으로 보고 되어있다 (Park, 2018).

본 연구에서 CCS의 AChE 억제 활성을 확인하기 위해 다양한 농도 (1, 10, 50 및 100 ㎍/㎖)에서 AChE 억제 활성을 평가하였다.

그 결과 CCS는 강한 AChE 억제 활성을 보였으며 양성대조군으로 사용한 galantamine 10 μM의 활성과 비교하였을 때 CCS의 농도 10 ㎍/㎖을 처리한 경우와 비슷한 수준의 억제 활성을 나타내었다. CCS의 IC₅₀값은 8.37 ㎍/㎖이었으며 양성대조군인 galantamine의 경우 IC₅₀값은 5.53 μM(1.6 ㎍/㎖)이었다 (Fig. 5).

Fig. 5.  Effects of 50% ethanol extract of Cercis chinensis Bunge seed on acetylcholinesterase activity

50% ethanol extract of Cercis chinensis Bunge seed (CCS) was prepared at final concentrations of 1, 10, 50, and 100 ㎍/㎖ with the acetylcholinesterase (AChE) assay buffer. Galantamine was used as a positive control. Data are means ± SE of three independent experiments [***p < 0.001 between treated and control cells by One-way ANOVA test using Graph Pad Prism 5 software. C; negative control, treatment of 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO), Galantamine 10 μM (Gal); acetylcholinesterase inhibitor].

CCS는 추출물 수준에서 비교적 강한 AChE 억제 활성을 나타내었고 천연소재의 추출물에는 수많은 화학물질이 존재하고 이러한 물질의 상호작용 등을 통해서 활성을 나타낸다는 것을 고려할 때 (KFDA, 2008), 천연소재에 존재하는 특이적 활성을 나타내는 단일 성분을 동정하면 galantamine과 같은 천연물 의약품을 개발하는 것이 가능할 것이다.

본 연구결과, 박태기나무 (Cercic chinensis Bunge) 씨 추출물은 비교적 저농도에서 강한 AChE 억제 활성을 나타내었기 때문에 AChE를 억제할 수 있는 특이적 성분이 포함돼 있을 것으로 예측되며 유효성분을 동정하고 항염증, 항산화 메커니즘, in vivo 상태에서의 기억력 개선 효능 등을 검정함으로써 알츠하이머 질환의 치료제 및 건강기능 식품의 후보 소재로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

천연물에서 AChE 저해제를 치료제로 개발하는 데 있어 특이적 유효성분을 동정한다면, 기존의 단일 성분의 AChE 저해제처럼 개발하는 것이 가능할 것이며, 추출물이나 분획물로서 천연물 의약품으로 개발할 수 있다. 더불어 건강기능식품 식용 소재로서 박태기 씨 기름을 식품첨가물이나, 식단에 활용 할 수 있을 것이다.