커피나무 잎은 제주 지역에서 재배되고 있는 아라비카 (Coffea arabica L.) 종에서 2020년에 채취한 것을 60℃에서 48 시간 동안 건조시킨 후 진공포장하여 보관하면서 사용하였으며, 분쇄기를 사용하여 60 mesh 이하의 크기로 균일하게 분쇄한 것을 추출에 사용하였다.

커피나무 잎 열수 추출물은 분쇄 시료 15 g에 정제수 250 ㎖를 혼합한 후 100℃로 환류 추출을 실시하였다. 가열을 시작한 후 최초 100℃에 도달한 시각부터 10 분, 20 분, 30 분, 60 분, 120 분까지 5 종의 열수 추출을 제조하였으며, 상온으로 냉각시킨 후 여과를 실시한 후 4℃ 이하로 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.

커피나무 잎 에탄올 추출물은 분쇄 시료 15 g에 5%, 10%, 20%, 40%, 80% 에탄올 250 ㎖를 혼합한 후 상온에서 진탕 추출을 실시하였다. 진탕 추출은 분당 180 회의 속도를 적용하여 24 시간 동안 실시하였으며, 추출 후 여과를 실시한 후 4℃ 이하로 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.

커피나무 잎 추출물 시료의 LC 분리 및 radical 소거능 동시 측정을 위해 LC-30A (Shimadzu Co., Kyoto, Japan) 액체크로마토그래피와 column으로서 Kinetex C18 (2.1 mm × 150 mm, 2.6 μm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 기본 장비 구성으로 하여 분석을 실시하였다.

시료 주입량은 5 ㎕, column oven은 40℃를 유지하였으며, 이동상으로 0.1% formic acid (A)와 methanol (B)을 사용하여 유속은 0.25 ㎖/min으로 유지하였다. 이동상은 초기 5 분까지 2% B, 5 분에서 47 분까지 40% B가 되도록 하였고, 47 분에서 48 분까지 100% B가 되도록 하여 54 분까지 유지한 후 다시 2% B로 낮춰서 60 분간 측정 및 분석을 실시하였다.

전체적인 시스템의 구성은 Fig. 1과 같이 구성하였으며, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 용액을 공급하기 위해 추가로 LC-20AD pump (Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 설치하였다. Column에서 분리된 시료액과 radical 용액이 혼합된 이후 radical 소거 반응을 위해 길이 1 m의 reaction tubing을 설치하였다. Methanol에 50 μM로 용해시킨 DPPH 용액을 사용하였으며, 유속은 0.15 ㎖/min으로 유지하면서 검출기 (SPD-10Avp, Shimadzu Co., Kyoto, Japan) 파장은 517 nm로 설정하였다. DPPH radical 소거 반응 특성으로 인해 활성 성분과 radical 용액이 반응하여 흡광도가 낮아지는 것을 검출해야 하므로 측정 후 결과 판독 용이성을 위해 검출기의 polarity를 반대 (negative mode)로 설정하였다. 활성 성분의 정성 분석을 위한 LC profile 분석은 DPPH radical 용액을 정지한 상태에서 검출기를 정상 (positive mode)으로 재설정한 후 280 nm에서 실시하였다.

Fig. 1.  Scheme of online-LC–DPPH radical scavenging ability measurement system.

DPPH radical 소거 활성 성분에 대한 질량분석에는 LC-30A (Shimadzu Co., Kyoto, Japan) 액체크로마토그래피와 연동된 LCMS-8050 (Shimadzu Co., Kyoto, Japan) 삼중사중극자 질량분석기 (triple quadrupole mass spectroscopy)를 사용하였으며, LC profile과 radical 소거 활성 동시 측정 조건과 동일한 분리 조건을 적용하였으며, Table 1과 같은 세부 조건을 적용하여 분석을 실시하였다.

모분자 이온 (molecular ion)과 생성 이온 (product ion) 확인 분석 결과를 바탕으로 활성 성분의 신속하고 정확한 분석을 위한 multiple reaction monitoring (MRM) mode 조건적용을 위한 분석에는 이동상과 유속은 동일하게 유지하였으며, 시료 주입량은 1 ㎕로 설정하였다. 이동상은 초기 5 분까지 2% B, 2 분에서 19 분까지 40% B가 되도록 하였고, 19 분에서 20 분까지 100% B가 되도록 하여 25분까지 유지한 후 다시 2% B로 낮춰서 30 분간 분석을 실시하였다.

항산화 활성을 측정하는 다양한 방법 중 식물 추출물 시료의 항산화 활성 측정에 가장 일반적으로 활용되고 있는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능은 radical의 환원에 따른 색상 변화를 측정하여 결과의 비교가 용이한 장점을 가지고 있다 (Blois, 1958; Cha, 2015; Im et al., 2017).

일반적으로 spectrophotometer 기반의 분광학적 장비를 이용하는 DPPH radical 소거능 측정 실험법에서 식물 추출물과 같이 매우 많은 성분이 혼합되어 있는 시료일 경우 실험 결과로 확인할 수 있는 활성이 특정 성분의 활성이라기보다는 여러 성분의 병합적인 활성일 수밖에 없다. 따라서 항산화 활성 성분에 대한 탐색 효율을 증진시키기 위해 액체크로마토그래피 (liquid chromatography; LC)를 이용하여 성분 분리한 후 연속적으로 분리된 성분의 항산화 활성을 검토하기 위한 연구가 다양하게 진행되고 있다 (Hong et al., 2014; Zhang et al., 2015; Im et al., 2017).

Online-LC-DPPH radical 소거능 측정 시스템에서는 column 분리 이후 검출기로 연결되는 중간에 radical 용액을 일정하게 공급하게 되므로 항산화 활성 성분이 분리되어 나오는 시간에만 radical 소거 반응이 나타나게 된다. DPPH radical은 자색을 나타내지만 항산화 활성을 가지는 성분과 반응하면 탈색되어 흡광도가 감소하게 된다. 따라서 검출기의 polarity를 반대 (negative mode)로 설정하여 일반적인 LC 분석 결과 chromatogram과 동일한 형태로 변환함으로써 판독을 용이하게 할 수 있다. 이와 관련된 세부 조건들은 선행 연구들에서 검토된 내용을 반영하였다 (Im et al., 2017; Kim et al., 2019; Im and Lee, 2020).

사전 연구를 통해 가장 항산화 활성이 우수한 것으로 확인된 커피나무 (Coffea arabica L.) 잎 80% 에탄올 추출물을 대상으로 Fig. 1과 같은 시스템을 활용한 online-LC-DPPH radical 소거능을 측정한 결과에서 Fig. 2와 같이 a부터 g까지 7 개의 주요 radical 소거 활성 peak를 확인할 수 있었다. 본 연구에서 활용된 측정 시스템의 결과에서 peak를 나타낸 것은 해당 머무름 시간에 항산화 활성을 가지는 성분이 분리되어 나왔음을 의미하며, peak의 면적이 클수록 항산화 활성이 상대적으로 강한 성분이거나 함량이 높을 수 있음을 나타낸다.

Fig. 2.  On-line LC radical scavenging effects and major active peaks of the extract of Coffea arabica leaves.

Different superscripts (a - g) are major active peaks.

Fig. 1에 제시한 측정 시스템 중 DPPH radical 용액의 공급을 정지한 상태에서 동일한 LC 분리 조건을 적용하여 positive mode의 280 nm 검출 조건에서 Fig. 3과 같은 성분 profile 결과를 얻을 수 있었으며, a부터 g까지의 각 활성 peak 머무름 시간을 기준으로 질량분석을 실시하였다.

Fig. 3.  LC profile of the extract of Coffea arabica leaves.

Different superscripts (a - g) are major active peaks.

질량분석은 online-DPPH-radical 소거능 측정 및 LC profile 분석과 동일한 분리 조건을 적용하였으며, 이에 따라 머무름 시간을 기준으로 각 활성 peak의 질량분석 결과를 검토하였다. 일반적으로 electrospray ionization (ESI) 이온화 장치를 기반으로 하는 질량분석기에서는 positive mode에서 나타나는 모분자량 패턴인 [M+H]⁺, [M+Na]⁺와 negative mode 에서 나타나는 모분자의 형태 [M-H]^-를 상호 대조하여 모분자량을 추정할 수 있다.

한편, 열수나 에탄올 추출물처럼 다른 용매에 비해 극성도가 높은 식물 추출물 중에 존재하는 radical 소거 활성 성분은 phenolic acid 계열의 분자처럼 구조 내에 hydroxyl group(-OH)을 포함하는 경우가 많아서 negative mode 질량분석 결과에서 positive mode보다 단순한 모분자량 패턴을 가진다.

커피나무 잎 80% 에탄올 추출물을 분석하여 Fig. 4와 같은 질량분석 결과를 얻을 수 있었으며, LC profile 분석과 DPPH radical 소거능 측정 결과의 활성 peak 머무름 시간 대조를 통해 해당하는 a - g의 모분자량을 Fig. 5(A, B) - Fig. 11(A, B)과 같이 확인할 수 있었다.

Fig. 4.  LC-MS total ion chromatograms of the extract of Coffea arabica leaves.

Different superscripts (a - g) are major active peaks.

Fig. 5에 제시한 활성 peak a의 MS spectra를 보면 negative mode에서 [M-H]^- 형태로 볼 수 있는 353.1 m/z와 positive mode에서 [M+H]⁺ 형태로 볼 수 있는 355.1 m/z가 확인됨에 따라 모분자량이 354인 성분임을 확인할 수 있었다. 상대적으로 molecular ion이 강하게 나타난 negative mode에서 353.1 m/z로부터 생성된 MS² spectra를 보면 특징적으로 191.1, 179.1, 135.1 m/z 등의 ion이 생성됨을 알 수 있었는데 이와 같은 MS spectra는 기존의 문헌을 참고하여 caffeoyl quinic acid 계열의 성분에서 나타나는 전형적인 형태임을 알 수 있었다 (Bajko et al., 2016).

Fig. 5.  LC-MS analysis results of the major active peak a.

(A) positive mode MS spectra of the major peak a, (B) negative mode MS spectra of the major peak A, (C) MS² spectra of m/z 353.1([M-H]^-).

Fig. 6에 나타낸 활성 peak b의 MS spectra에서도 활성 peak a와 유사한 패턴의 MS 및 MS² spectra를 나타냄에 따라 caffeoyl quinic acid 계열의 성분임을 추정할 수 있었다. Caffeoyl quinic acid 계열에서 일반적으로 나타날 수 있는 화학구조와 기존 연구 보고를 검토하여 3-, 5- 위치에 caffeoyl 기를 포함하는 caffeoyl quinic acid임을 확인할 수 있었으며, 활성 peak a, b가 각각 5-caffeoylquinic acid, 3-caffeoylquinic acid임을 확인하였다 (Zhang et al., 2015; Chen et al., 2018).

Fig. 6.  LC-MS analysis results of the major active peak b.

(A) positive mode MS spectra of the major peak b, (B) negative mode MS spectra of the major peak B, (C) MS² spectra of m/z 353.1 ([M-H]^-).

Fig. 7에 제시한 활성 peak c의 MS spectra를 보면 negative mode에서 [M-H]^- 형태로 볼 수 있는 863.1 m/z와 positive mode에서 [M+H]⁺ 형태로 볼 수 있는 865.1 m/z가 확인됨에 따라 모분자량이 864인 성분임을 알 수 있었다. 상대적으로 molecular ion이 강하게 나타난 negative mode에서 863.1 m/z로부터 생성된 MS² spectra를 보면 특징적으로 711.1, 411.1, 451.1, 573.1 m/z 등의 ion이 생성됨을 알 수 있었는데 이와 같은 MS spectra는 catechin이나 epicatechin의 trimer 형태에서 파생된 분자 구조에서 나타나는 형태임을 알 수 있었으며, procyanidin 화합물에 대한 질량분석 연구에 관한 기존 문헌과 비교하여 cinnamtannin B-1임을 확인하였다 (Rue et al., 2018; Rush et al., 2018).

Fig. 7.  LC-MS analysis results of the major active peak c.

(A) positive mode MS spectra of the major peak c, (B) negative mode MS spectra of the major peak C, (C) MS² spectra of m/z 863.1 ([M-H]^-).

Cinnamtannin B-1은 A형 proanthocyanidin으로서 기존 연구에서는 B형 proanthocyanidin의 일종인 procyanidin C가 커피나무 잎에 존재하는 것으로 보고되었었다 (Ngamsuk et al., 2019). Cinnamtannin B-1은 고비 (Osmunda japonica)와 같은 식물에 존재하는 것으로 보고되었으며, 높은 항산화 활성을 가지는 것으로 확인되었으나 (Kim et al., 2016; Woo et al., 2017), 아직 국내에서 재배된 커피나무 잎에서 확인된 바는 없었다.

Fig. 8에 제시한 활성 peak d의 MS spectra를 보면 negative mode에서 [M-H]^- 형태로 볼 수 있는 421.1 m/z와 positive mode에서 [M+H]⁺ 형태로 볼 수 있는 423.1 m/z가 확인됨에 따라 모분자량이 422인 성분임을 알 수 있었다. 상대적으로 molecular ion이 강하게 나타난 negative mode에서 421.1 m/z로부터 생성된 MS² spectra를 보면 특징적으로 301.1, 271.1, 331.1 m/z 등의 ion이 생성됨을 알 수 있었는데 이와 같은 MS spectra는 커피나무 잎 등에 존재하는 mangiferin에서 나타나는 형태임을 알 수 있었으며, 다양한 연구에서 커피나무의 잎에 존재하는 항산화 활성 성분 중 하나로 보고하고 있다 (Campa et al., 2012; Chen et al., 2019; Ngamsuk et al., 2019; Monteiro et al., 2020).

Fig. 8.  LC-MS analysis results of the major active peak d.

(A) positive mode MS spectra of the major peak d, (B) negative mode MS spectra of the major peak D, (C) MS² spectra of m/z 421.1 ([M-H]^-).

Mangiferin은 국내에서 생약으로 사용되는 지모 (Anemarrhena asphodeloides) 뿌리 추출물의 지표 성분으로서 항균 및 항산화 작용과 세포보호 효과 등이 있는 것으로 보고되고 있다 (Lee et al., 2018).

Fig. 9에 제시한 활성 peak e의 MS spectra를 보면 negative mode에서 [M-H]^- 형태로 볼 수 있는 515.1 m/z와 positive mode에서 [M+H]⁺ 형태로 볼 수 있는 517.1 m/z가 확인됨에 따라 모분자량이 516인 성분임을 확인할 수 있었다. 상대적으로 molecular ion이 강하게 나타난 negative mode에서 515.1 m/z로부터 생성된 MS² spectra를 측정한 결과에서 353.1, 179.1, 191.1 m/z 등의 ion이 생성되었으며, 이와 같은 MS spectra는 기존의 문헌을 참고하여 caffeoyl group 2개와 quinic acid가 결합된 형태의 dicaffeoyl quinic acid 구조를 가지는 성분에서 나타나는 형태임을 알 수 있었다 (Clifford et al., 2005).

Fig. 9.  LC-MS analysis results of the major active peak e.

(A) positive mode MS spectra of the major peak e, (B) negative mode MS spectra of the major peak E, (C) MS2 spectra of m/z 515.1 ([M-H]^-).

Fig. 10과 11에 나타낸 활성 peak f와 g의 MS spectra에서도 활성 peak e와 동일한 패턴의 MS 및 MS² spectra를 나타냄에 따라 dicaffeoyl quinic acid 구조를 가지는 성분들임을 알 수 있었다. 커피나무 잎의 성분에 관한 기존 연구들을 검토하여 활성 peak e, f, g가 각각 3,4-dicaffeoyl quinic acid, 3,5-dicaffeoyl quinic acid, 4,5-dicaffeoyl quinic acid임을 확인하였다 (Campa et al., 2012; Chen et al., 2018; Monteiro et al., 2020).

Fig. 10.  LC-MS analysis results of the major active peak f.

(A) positive mode MS spectra of the major peak f, (B) negative mode MS spectra of the major peak F, (C) MS2 spectra of m/z 515.1 ([M-H]^-).

Fig. 11.  LC-MS analysis results of the major active peak g.

(A) positive mode MS spectra of the major peak g, (B) negative mode MS spectra of the major peak G, (C) MS2 spectra of m/z 515.1 ([M-H]^-).

주요 활성 peak의 LC-MS 분석 결과를 바탕으로 모분자 이온과 생성 이온을 선정하였으며, 분석 방법의 정성 및 정량성 확보를 위해 Table 2와 같이 성분별로 2 가지 multiple reaction monitoring (MRM) 조건을 설정하였다. 또한 머무름 시간 겹침이나 간섭에 관계없이 분석이 가능한 MRM mode의 질량분석 특성을 감안하여 30 분에 분석이 완료되도록 이동상 조건을 설정하였다.

설정된 MRM mode 분석 방법의 유용성을 확인하기 위해 추출 시간별 열수 추출물 및 농도별 에탄올 추출물을 제조하여 비교 분석을 실시하였다. Fig. 12에 제시된 MRM mode의 LC-MS/MS chromatogram과 같이 추출 조건별로 각 활성 성분의 함량 차이가 존재함을 확인할 수 있었으며, 추출물별로 각 성분의 peak 면적을 비교하여 Table 3에 나타낸 상대 함량 결과를 산출할 수 있었다. 60 분간 실시한 Fig. 3의 LC profile 분석 결과에 비해 각 성분의 머무름 시간 간격이 짧아졌으나 머무름 시간이 겹치더라도 분석이 가능한 MRM mode 분석을 이용하면 분석 시간을 60 분에서 30 분으로 줄이더라도 커피나무 잎에 존재하는 항산화 활성 성분 분석에 문제가 없음을 확인하였다. 또한 분석 대상 성분을 제외한 성분에 대한 검출이 배제되므로 일반적인 LC 분석의 자외선 (ultraviolet; UV) 검출기를 적용한 chromatogram에 비해 간결하고 명확한 비교가 가능하였다.

Fig. 12.  MRM mode LC-MS/MS chromatograms of active compounds by extraction conditions.

(A) ethanol extract by concentration (5 - 80%), (B) hot water extract by extraction time (10 - 120 min). Different superscripts (a - g) are major active peaks.

Table 3에 제시한 결과와 같이 농도별 에탄올 추출물의 분석 결과에서 에탄올 농도가 높아지면 전반적으로 활성 성분의 함량도 증가됨을 확인할 수 있었다. 다만, 5-caffeoyl quinic acid와 3-caffeoyl quinic acid는 20% 에탄올 추출에서도 추출이 충분히 이루어지는 것으로 나타났으며, 3,4-dicaffeoyl quinic acid와 4,5-dicaffeoyl quinic acid는 40% 에탄올 추출에서 80% 에탄올 추출과 유사한 수준의 함량을 보였다. Cinnamtannin B-1의 경우 40% 이상의 에탄올 농도에서 추출이 원활히 이루어지는 특성을 나타냈으며, 10% 이하의 에탄올 농도에서는 전반적으로 활성 성분들의 추출 효율이 낮은 것으로 확인되었다.

열수 추출물에서는 추출 시간별로 5-caffeoyl quinic acid가 80% 에탄올 추출물 대비 34.0% - 70.5%, 3-caffeoyl quinic acid는 36.9% - 58.9% 수준의 상대 함량을 나타내었다. 두 가지 성분을 제외한 성분들은 열수 추출 조건에서는 효과적인 추출이 어려운 것을 확인할 수 있었다. 전반적으로 추출 시간이 늘어날수록 함량이 증가되는 것으로 나타났으나 cinnamtannin B-1, 3,4-dicaffeoyl quinic acid, 3,5-dicaffeoyl quinic acid, 4,5-dicaffeoyl quinic acid는 추출시간에 관계없이 추출이 거의 되지 않거나 증가율이 낮은 것으로 나타났다.

이와 같은 결과는 국내에서 재배된 커피나무 잎의 활성 성분에 대한 관련 연구에서 neo-chlorogenic acid, chlorogenic acid, caffeine 등 3 가지 성분 함량이 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 전반적으로 높게 나타난 것으로 보고한 것과 유사한 경향으로 보이지만 (Im and Doo, 2021a), 품종이나 재배 지역 및 채취 시기, 세부적인 추출 방법의 차이 등을 반영한 추가적인 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것으로 판단된다.

커피나무는 우리나라의 제주도, 전남, 경남 지역 등에서 시설재배 방식을 활용하여 재배가 점차 늘어나고 있으므로 관련된 제품 개발을 위한 다양한 연구가 필요하다. 국내에서 재배된 커피나무 잎에 존재하는 항산화 활성 성분에 대한 탐색을 위해 DPPH radical 소거 활성을 LC 분석과 동시에 측정한 후 확인된 radical 소거 활성 성분 peak의 질량분석을 실시하여 5-caffeoyl quinic acid, 3-caffeoyl quinic acid, cinnamtannin B-1, mangiferin, 3,4-dicaffeoyl quinic acid, 3,5-dicaffeoyl quinic acid, 4,5-dicaffeoyl quinic acid 등 7 종의 활성 성분을 확인하였다.

질량분석 결과를 바탕으로 MRM mode 분석 조건을 설정하여 LC-MS/MS를 활용한 커피나무 잎 추출물 중 radical 소거 활성 성분 분석 방법을 설정하였으며, 추출 시간별 열수 추출물과 농도별 에탄올 추출물을 대상으로 비교 분석을 실시하여 유용성을 확인하였다.

전통적인 LC 분석에서는 동시 분석 대상 성분이 많아질수록 성분들간의 간섭을 줄이기 위해 분석 시간이 증가될 수밖에 없으며, 일반적인 식물 추출물은 다양한 성분이 혼재되어 있기 때문에 60 분 이내에 여러 성분을 동시에 분석하기가 어려운 경우가 빈번히 발생된다. 본 연구에서는 30 분의 분석 조건을 적용하였으나 머무름 시간이 중복되더라도 분석이 가능한 LC-MS/MS MRM mode의 특성을 적용하면 20 분 이하의 분석 조건 설정도 가능하며, column 조건 등을 개선하면 보다 짧은 분석도 가능할 것으로 판단된다. 이와 같은 분석 방법과 연구 결과는 최근 증가되고 있는 국내 커피나무 재배 관련 품종 및 산지별 특성 연구나 식품, 화장품, 의약품 등 관련 산업 분야에서의 제품 개발이나 품질관리 등을 위한 기초 자료로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.