천마 (Gastrodia elata Blume)는 무주농협 (Muju, Korea)에서 건조물을 구매해 사용하였고 추출을 위해 99.5% (v/v) 에탄올과 1차 증류수를 혼합하여 용매로 사용하였다.

천마로부터 생리활성 물질 추출을 위해 천마 1.0 g에 50% 에탄올 10 ㎖를 가하고 초음파 추출기 (SD-D250H, JAC Ultrasonic, Hwaseng, Korea)를 이용해 40.0 ㎑의 연속파로 60℃에서 30분간 추출을 진행하였다.

추출물의 고액분리를 위해 원심분리기 (LoboGene 1236R, Gyrozen, Gimpo, Korea)를 이용하여 4℃에서 5 분간 10,000 rpm 으로 상등액을 분리한 후 냉동 보관하여 필요에 따라 희석하여 사용하였다.

천마 추출물이 암세포에 미치는 영향을 평가하기 위해 인간신장 세포 (HEK-293)와 인간 간암 세포 (Hep3B)를 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며 세포 배양을 위해 Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin은 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구매하여 사용하였다.

세포 배양기에는 1% (v/v)의 penicillin과 10% (v/v)의 FBS가 혼합된 DMEM을 사용하였고 온도는 37℃로 고정하였으며 5% CO₂가 공급되는 CO₂ 배양기 (MCO-18AIC, Sanyo Electric Co., Ltd., Osaka, Japan)를 사용하여 배양하였다. 세포 배양 진행은 세포 배양 플라스크에 간암 세포를 5.0 × 10⁴ cells/well로 분주한 후 24 시간 주기로 세포를 확인하고 계대배양을 진행하였다.

천마 추출물이 간암 세포 성장 저해에 미치는 영향을 확인하기 위해 간암 세포주를 180 ㎕씩 96 well plate에 1.0 × 10⁴ cells/well 분주 후 CO₂ 배양기에서 상기 조건으로 24 시간 배양하였다. 이후 DMEM을 제거한 뒤 추출물을 농도별로 희석하여 20 ㎕씩 plate에 분주하여 72 시간 배양 후에 MTT 시약 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 0.25 ㎎/㎖로 PBS에 용해시켜 DMEM와 혼합하여 플레이트 분주 후 4 시간 반응 한 뒤 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 100 ㎕를 분주하고 마이크로 플레이트 리더기 (AMR-100, Allsherng, Seoul, Korea)를 이용해 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군과 천마 추출물 첨가군의 흡광도를 계산해 아래의 식에 따라 세포 생존율을 산출하였다.

A : 천마 추출물 첨가구의 흡광도 (실험군)
B : DMEM 첨가구의 흡광도 (대조군)

천마 추출물 처리한 간암 세포 자멸사 유전자의 발현량을 분석하기 위해 간암 세포를 1.0 × 10⁶ cells/well로 96 well plate에 분주한 뒤 24 시간 배양 후 천마 추출물을 0.0 ㎎/㎖ - 0.5 ㎎/㎖의 수준으로 처리하였다.

그 후 세포를 회수하고 AccuPrep^® Universal RNA Extraction Kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 total RNA를 추출한 뒤 NanoDrop™ 2000/2000c Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)로 total RNA 양을 측정하였다. cDNA 합성은 Step One Plus™ real-time PCR system (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)에서 amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 이용하여 수행하였다.

합성한 cDNA 2.0 ㎕와 PowerUP™ SYBR^® Green Master Mix (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) 10.0 ㎕를 혼합한 뒤 β-actin과 간암 세포 자멸사 유전자인 Bcl-2, Bax와 AMPKα 프라이머를 각각 1.0 ㎕씩 첨가하고 diethylpyrocarbonate (DEPC)로 최종부피가 20.0 ㎕가 되도록 조정한 후 초기 변성 95℃에서 10 분, 변성 반응 95℃에서 15 초, 그리고 결합 반응 60℃에서 1 분, 그리고 신장 반응 72℃에서 30초로 60 회 qRT-PCR을 진행하였다.

프라이머는 최적화된 프로그램인 Primer Express 3.0.1 (Life Technologies, Framingham, MA, USA)로 설계하였고 염기서열은 Table 1에 나타내었다. 분석법은 comparative C_T method를 이용하였으며 산출된 C_T를 2-^△△CT 법을 통해 각 유전자에 대한 상대정량을 실시하였다 (Kenneth and Thomas, 2001).

목적 유전자 : Bcl-2, Bax와 AMPKα의 각 C_T와 △C_T
대조군 유전자 : β-actin의 각 C_T와 △C_T

천마 추출물에 포함된 주요물질 분석을 위해 LC-MS/MS를 이용하여 분자량 분포에 따른 정성분석을 진행하였으며 사용된 이동상인 formic acid와 acetonitrile (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)은 HPLC 등급 제품을 사용하였다.

시료 준비를 위해 천마 추출물은 10 ㎕의 샘플을 주입하고 0.22 ㎛의 공극 크기를 가진 실린지 필터 (Hyundai Micro Co., Anseong, Korea)로 여과한 후 Roc™ C18 컬럼 (3.0 ㎜ × 150 ㎜, Restek Co., Bellefonte, PA, USA)을 장착한 LC-MS/MS (Finnigan TSQ Quantum, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 주요물질 검출을 진행하였고 이동상 및 온도 등의 조건을 Table 2에 나타내었다.

질량 분석기에서는 시료에 에너지를 가하여 이온화시키는 전자분무 이온화 (electrospray ionization, ESI) 방법의 양이온 모드를 운전조건으로 설정하였으며 질량 스펙트럼 정보의 질량 대 전하 비를 50 m/z에서 800 m/z까지 설정한 전체 스캔 모드 (full scan mode)를 통해 질량 스펙트럼을 수집하였다.

모든 실험은 3 회 반복 수행하여 결과값을 평균 ± 표준편차로 표시하였으며 GraphPad Prism Software (San Diego, CA, USA)을 사용하여 통계 처리를 실시하였다. 실험군 간 유의성 평가는 One-Way ANOVA로 실험군 간의 통계적 유의성을 p < 0.05 기준으로 분석하였다.

천마 (Gastrodia elata Blume) 추출물의 간암 세포 성장 저해를 확인하기 위해 천마 추출물을 0.0 ㎎/㎖에서 4.0 ㎎/㎖까지의 농도로 처리하여 세포 성장을 비교하였을 때 신장 세포에서 처리 최대농도인 4.0 ㎎/㎖까지 세포 성장 저해가 없었으나 간암 세포에서는 농도 의존적으로 세포 성장이 저해되며 특히 1.0 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 세포 성장에 유의한 저해 효과가 확인되었다 (p < 0.05). 또한, 천마 추출물을 4.0 ㎎/㎖의 수준으로 처리 시 대조군과 비교하여 48.2%의 수준으로 간암 세포 성장을 감소시키는 것을 확인하였다 (Fig. 1).

Fig. 1.  Inhibitory effects of different concentrations of GEE extract on HEK-293 and Hep3B.

Hep3B cells were treated with indicated concentrations of GEE in DMEM for 24 hours. Cell viability was evaluated using the MTT Assay. GEE suppresses proliferation of Hep3B cells in a dose dependent manner above 1.0 ㎎/㎖. All values are expressed as means ± SD (n = 3). Each value is a means ± SE (n = 3). ^*Different letters are significantly different at 5% by One-Way ANOVA (p < 0.05).

천마 추출물 성분분석 및 in vitro 생리활성에 관한 이전 연구에 따르면 천마 추출물을 1.0 ㎎/㎖의 농도 수준으로 처리한 경우 간암 세포주 (Hep3B)를 비롯한 4 종의 암 세포주에 대한 생장을 저해할 수 있음이 확인된 바 있다 (Kim et al., 2002). 이는 본 연구에서 적용한 농도인 4.0 ㎎/㎖보다 낮은 농도로, 본 연구에서는 50% 에탄올을 용매로 한 추출물을 사용한 반면 Kim 등 (2002)의 연구에서는 천마 분말과 증류수를 1 : 10으로 혼합한 후 90℃ - 95℃에서 8 시간 환류 추출 및 동결건조 후 사용하였기 때문에 추출 용매의 변화에 따른 차이로 생각되어진다.

천마로부터 유용물질 추출에 있어 추출 부위, 건조 방법 및 증자 여부는 천마의 주요물질인 gastrodin과 4-hydroxybenzyl alcohol 함량에 많은 영향을 미치는 것으로 보고되었다 (Choi et al., 2011). 또한, 천마와 같은 약용작물은 추출용매의 종류에 따라 주요물질 추출에 영향을 받는다고 알려져있으며 Kim 등 (2007)의 연구에서는 가자, 정향 등의 약용작물은 에탄올과 아세트산에틸 등 용매와 추출법 따라 추출 효율에 유의한 차이가 있고, 동일 약용작물을 다른 용매로 추출하여 항산화 활성을 측정한 결과 열수 추출보다 에탄올을 용매로 사용하였을 때의 항산화 활성이 23% 증가하였다고 보고되었다.

따라서 본 실험은 농축하지 않은 50% 에탄올 추출물을 시료로 사용하였기에 Kim 등 (2002)의 연구에서 사용된 농축한 동결건조 시료 대비 더 높은 농도인 4.0 ㎎/㎖에서 세포 저해능이 있는 것으로 생각되어진다.

천마 추출물의 성장 저해에서 유의성이 나타나지 않는 농도에서 세포 자멸사 유전자 발현을 평가하고자 0.0 ㎎/㎖에서 0.5 ㎎/㎖의 수준으로 천마 추출물을 처리한 후 qRT-PCR을 통해, Bcl-2, Bax와 AMPKα의 발현을 확인하고자 하였다.

천마 추출물을 0.5 ㎎/㎖ 처리 시 Bcl-2는 대조군 대비 △△C_T가 -1.56이 나왔으며 동시에 Bax의 △△C_T의 수치는 -17.05로 대조군에 비해 발현량이 크게 증가함을 확인하였으며 전체적인 comparative C_T는 Fig. 2에 나타내었다. 이는 Bcl-2/Bax 이형 복합체 형성에 있어서 Kang 등 (2005)의 골육종에서 세포 자멸사 관련 유전자인 survivin, Bcl-2와 Bax 발현 연구에서 Bcl-2가 증가함에 따라 CAD의 비활성화로 Bcl-2와 비례하게 Bax의 발현량도 증가하였다는 연구 결과와 일치하며 간암 세포에서 성장 저해가 일어남에 따라 Bcl-2의 발현량이 증가함과 동시에 이에 대응하여 Bax가 Bcl-2의 발현을 억제시키는 결과로 해석된다.

Fig. 2.  The expression analysis value of each gene expression relative quantified by the comparative △C_T Methods.

Using the 2^-△△CT method of Kenneth and Thomas, (2001). △C_T, and △△C_T were calculated for the C_T values of each of the interest of genes (Bax, Bcl-2, and AMPKα), and endogenous gene (β-actin). ¹⁾NT; template was used as a control group. (A) is C_T, (B) is △C_T, and (C) is △△C_T.

또한, AMPKα는 0.125 ㎎/㎖에서 0.250 ㎎/㎖의 범위에서는 유전자 발현량이 감소하였으나 0.500 ㎎/㎖에서는 대조군대비 △△C_T –0.49가 나타났으며 이는 0.500 ㎎/㎖에서 Bcl-2 와 Bax의 발현량이 비례적으로 증가함에 따라 AMPK 에너지 생성 경로가 활성화되어 증가된 것으로 판단되어진다 (Fogarty and Hardie, 2010).

이러한 유전자 기작은 발현되면서 세포 자멸사의 자극 여부 전 · 후와 미토콘드리아 사멸이 진행되고 말기 규제 완화 단계 총 4 단계에 각 역할을 수행하며 이 단계 중 미토콘드리아 내 · 외부와 크리스테 (cristae) 소기관에 유전자 기작으로 인해 전자의 이동으로 세포 자멸사가 조절된다 (Scorrano and Korsmeyer, 2003). 이를 통한 포스파티딜셀린 (phosphatidylserine, PS)이 세포 자멸사 중 세포막 바깥으로 노출되며 아넥신 V (Annexin V) 단백질과 특이적으로 결합하는 기작을 이용한 유세포 분석법 (flow cytometric analysis)을 이용하여 향후 세포 자멸사를 분석 후 Bcl-2와 Bax의 사이토크롬 C 전자 방출 분석에 대한 연구가 추가적으로 필요할 것으로 생각된다 (Vermes et al., 2000).

간암 세포를 이용한 qRT-PCR 실험에서 간암 세포 자멸사 유전자 발현량 증감을 확인하였고 이에 간암 세포 내 천마 추출물의 영향을 주는 주요 물질을 탐색하고자 LC-MS/MS를 이용한 천마 추출물의 정성분석을 수행하였다. 양성자 모드 (positive mode)로 m/z를 측정하였을 때 3.8 및 2.9 분에서 각각 m/z 309 및 276에서 분자이온 피크가 확인되었으며 분자량 물질 탐색에 있어 m/z 309 [M+Na]⁺ gastrodin (m/z 286) 및 [M+2H]⁺ m/z 276 [M+Na]⁺ phloretin (m/z 274)이 주요 물질로 검출되었다 (Fig. 3).

Fig. 3.  Spectra of LC-MS/MS fragmentation patterns of polyphenols including gastrodin and phloretin form GEE.

The following is the spectra of LC-MS/MS, which were analyzed by GEE in positive mode, (A) is gastrodin (m/z 309), and (B) is phloretin (m/z 276).

천마의 주요 폴리페놀 화합물인 gastrodin은 식물의 뿌리에서 발견되는 폴리페놀 화합물인 gastrodigenin의 글루코사이드 화합물로서 뉴런 보호, 항염증과 항산화 등의 효능을 가지는 것으로 알려져 있다 (Liu et al., 2020). 또한, gastrodin과 동일한 생리활성을 가지는 p-hydroxybenzyl alcohol와는 달리 gastrodin은 추출을 위한 가공공정에서 높은 열 안정성을 가지면서 생리효능을 유지하는 물질로 알려져 있어 천연물 소재 항암제로 활용되기 적합한 물질이다 (Lv et al., 2021).

이는 gastrodin의 항암 효과 평가를 진행한 Shu 등 (2013)의 연구에서 95% 에탄올로 천마의 유효 성분인 gastrodin을 추출하고 감압 농축하여 시료로 사용하였다. 그 후 gastrodin 추출물 15.0 - 150.0 ㎎/㎏을 H22 간암 세포를 피하 주사하여 암화된 쥐에 투여 후 종양을 적출하여 무게를 측정하였을 때, 종양 무게가 대조군 대비 gastrodin 150.0 ㎎/㎏ 투여군에 12% 감소되었다고 보고된다.

이후 간암이 유발된 쥐에게 gastrodin 추출물을 15.0 - 150.0 ㎎/㎏ 처리한 후 간 종양을 적출하여 무게를 측정하였다. 그 결과 gastrodin 투여군에서 종양 무게가 대조군 대비 12% 감소되어 gastrodin의 항암 효과를 입증하였다.

또한, qRT-PCR 진행하여 자가 항상성 유지하여 암화를 방지하는 T 세포인 CD＋4에서 Bcl-2와 Bcl-xL의 발현을 확인한 결과 대조군 대비 gastrodin 투여군에서 Bcl-2와 Bcl-xL 발현이 각각 4 배와 5 배 증가해 CD＋4 T 세포의 생존도가 향상되었다는 연구결과가 보고되어 gastrodin의 항암 효과를 입증하였다 (Kim et al., 2007).

폴리페놀의 일종인 phloretin은 항염증에 높은 생리활성 효과가 있으며 (Huang et al., 2017), 인간 식도 편평 상피암 세포인 EC-109를 대상으로 60 ㎍/㎖에서 80 ㎍/㎖ 까지의 농도 수준으로 phloretin을 처리한 후 유세포 분석을 진행한 결과, phloretin의 농도가 높아질수록 인간 식도 편평 상피암 세포의 세포 자멸사가 농도 의존적으로 증가하며 세포 자멸사와 관련된 단백질의 발현에 있어 p53, Bax의 경우는 phloretin에 의해 단백질 발현이 증가한 반면 Bcl-2의 발현은 감소하였다는 연구 결과가 보고된 바 있다 (Duan et al., 2017).

또한, 급성염증과 만성염증은 세포 증식과 돌연변이를 유도하고 혈관신생을 촉진하여 세포 자멸사를 억제하는 등 암이나 악성 종양으로 인해 조절되지 않은 세포의 성장, 혈액과 림프계를 통한 다양한 기관들로 전이하나 phloretin을 처리하게 되면 암을 유도하는 염증을 방지하는 것은 물론 암의 전이를 방지할 수 있는 효과가 있다고 하였다 (Lee and Choi, 2013).

기존 연구자들의 보고 및 본 연구를 통해 천마 추출물의 주요 물질인 gastrodin 및 phloretin은 간암 세포 성장 저해와 세포 자멸사 주요조절 유전자인 발현에 영향을 미치며 특히 미토콘드리아 막과 세포내 소체막에 존재하는 Bcl-2가 막의 이온 통로를 형성하여 투과성 변화를 조절하여 Ca 이온의 항상성을 조절함에 따라 세포사멸을 억제하며 천마 추출물의 농도가 높아질수록 증가하는 Bcl-2의 발현도에 따라 대응 유전자인 Bax의 발현량이 높아지는 것으로 확인되었다. 또한, Bcl-2와 Bax의 발현량 증가에 따라 AMPK 에너지 생성 경로 활성으로 AMPKα의 발현에 영향을 미치는 것으로 사료된다 (Han et al., 2019).

이에 본 연구에서는 천마 추출물의 농도에 따른 Bcl-2 발현량을 확인하고자 하였으며, 그 결과 천마 추출물의 농도가 증가할수록 Bcl-2와 Bax의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, AMPKa의 발현량 증가를 확인함으로써 Bax의 발현량 증가가 AMPK 에너지 생성 경로를 활성화시켜 AMPKa의 발현을 증가시킨다는 Han 등 (2019) 등의 연구를 재입증하였다.

이러한 결과를 바탕으로 본 연구에서는 천마 열수 추출물의 세포 자멸사 유전자 및 항암능 평가를 통해 기존 합성 항암제의 부작용을 대체하기 위해 천연물 유래 항암제의 원료로써 사용 될 수 있는 가능성을 제시하였다.