경북 춘양산에서 수집한 자연산 지실을 운곡한약품에서 2013년 6월에 구입하였고 최고야 박사로부터 기원의 진위와 품질상태를 검증받았다. 건조 지실은 Mixer (HMF-3000s, Hanil, Korea)로 분쇄한 후 70 mesh의 체로 쳐서 기밀용기에 보관하여 사용하였다. 지실의 지표성분인 poncirin (≥ 96.0%) 은 Fluka사 (USA), naringin (≥ 96.8%)은 Chromadex사 (USA) 에서 구입하였으며 (Fig. 1), 시료의 추출 및 분석에 사용된 용매인 acetonitrile, distilled water, ethyl alcohol, methanol은 Burdick & Jackson사 (USA)의 HPLC급 제품을 사용하였다.

지실의 지표성분인 poncirin, naringin에 대한 동시 정량 분 석법을 확립하고자 KP 10 (MFDS Notification No. 2013- 103, 2013) 기준을 참고하여 다양한 용매와 용매조성에 대하 여 분석조건을 변화시킨 결과 Water :Methanol : Acetonitrile (70 : 15 : 15→50 : 25 : 25) 기울기 용리조건을 확립하여 분석 하였다. 기존의 방법으로 분석한 크로마토그램 (Fig. 2a)에서 는 naringin은 추출물에서 피크의 겹침이 심해 분리능이 좋지 않았는데 새로 정립한 분석조건에서는 높은 분리능과 좋은 크 로마토그램 (b)을 보였다 (Fig. 2b).

지실의 지표성분인 poncirin (R²= 1), naringin (R²= 0.999) 은 모두 양호한 직선성을 보였다. 농도범위와 LOD, LOQ 값 은 poncirin은 10.2 ~ 203.0µg/ml농도범위에서 0.019µg/ml, 0.056µg/ml이고, naringin은 10.3 ~ 205.0µg/ml 농도범위에서, 0.016µg/ml, 0.049µg/ml으로 미량의 성분까지 검출 가능하였 다 (Table 2).

분석법의 정밀성 평가를 위해 두 지표물질의 직선성이 확인 된 농도 구간 중 3가지 농도를 기준으로 일간 (inter-day) 정 밀도와 일내 (intra-day) 정밀도를 3회 반복 측정하였는데 일간 정밀도는 0.02 ~ 0.11%, 일내 정밀도는 0.01 ~ 0.07%의 상대표 준편차 (RSD%) 값을 보여주었다 (Table 3).

분석법의 정확성 평가를 위하여 회수율 실험을 진행한 결 과 poncirin은 98.77%, naringin은 100.80%의 회수율을 나타 내었고 각각 0.082, 0.023% 상대표준편차를 보였다 (Table 4).

추출용매 조건의 변화에 따른 추출효율을 알아보기 위하여 지실 분말 0.5 g, 용매 50ml, 60 min, 상온에서 flavonoid glycoside계 화합물은 alcohol, 물 또는 이들의 혼합용매로 추 출하는 것이 일반적이라는 것을 참고하여 (Kim et al., 1989) 에탄올, 물, 메탄올로 추출하였다. 평균 함량은 에탄올, 물, 메탄올에서 각각 poncirin 1.40%, 1.97%, 2.01%, naringin 0.86%, 1.55%, 1.28%로 poncirin은 메탄올에서 naringin은 물 에서 높은 수율을 보였다. 메탄올은 극성용매와 비극성용매에 서 용출되는 물질 모두가 잘 용출되고 용해도가 크고 가격이 저렴하고 추출 조작이 편리하여 식물추출 용매로 자주 사용 되어진다 (Shin and Lee, 2011). 가장 추출 수율이 높은 메탄 올과 물을 혼합하여 비교한 결과, 물과 메탄올 추출물보다 혼 합용매에서 더 높은 수율을 보였고 혼합용매에서 추출효율이 더 높은 것은 일정비율의 물이 함유될 때 건조된 시료의 조직 을 팽창시켜 용매가 시료공극내부로 부터 많이 침출되어 추출 효과가 좋다는 보고가 있었다 (Kim et al., 2010). 70% 메탄 올 추출물에서 poncirin 함량은 2.18%로 통계적으로 유의성 있 게 함량이 가장 높았고, naringin은 50, 70% 메탄올에서 유의 적으로 높은 결과를 보였지만 평균수율이 50% 메탄올은 1.57%, 70% 메탄올은 1.59%로 산술적으로 높은 값을 보였다 (Fig. 3).

용매 조성 추출수율이 가장 높은 70% 메탄올 50ml와 60 min, 상온에서 각 시료용매 비율별 지실 분말을 사용하여 추출수율 변화를 비교해 보았다. 시료와 용매의 비율을 1 : 50, 1 : 100, 1 : 300, 1 : 500, 1 : 1000으로 설정하여 추출한 결과, 각각 1 : 300에서 poncirin 2.19%, naringin 1.64%으로 높은 수율을 보였고, 통계 결과는 두 성분 모두 1 : 300에서 유의적 으로 높은 결과를 보였다 (Fig. 4).

추출수율이 가장 높은 70% 메탄올 50ml, 지실 분말 0.167 g과 상온에서 다른 초음파 시간 (5, 10, 20, 40, 60, 80 min)을 설정하여 추출하였을 때, 각각 10 min에서 poncirin 2.15%, naringin 1.65%으로 높은 수율을 보였다. Tukey 사후 검정 결과 poncirin은 10분에서 유의적으로 높았고 naringin은 5, 10, 20분에서 유의적으로 높았지만 10분에서 산술적으로 높 은 평균 수율을 보였으며 시간이 길수록 추출수율이 떨어지는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 5).

추출수율이 가장 높은 70% 메탄올 50ml, 지실 분말 0.167 g, 초음파 시간 10 min과 온도에 따른 함량변화를 알아 보기 위해 30, 40, 50, 60, 70°C의 조건에서 추출하였을 때, 각각 40°C에서 poncirin 2.22%, naringin 1.68%으로 높은 수 율을 보였다. 통계 결과는 두 성분 모두 40°C에서 유의적으로 높은 결과를 보였고 40°C 이후로 온도가 올라갈수록 추출수율 이 떨어지는 경향이 나타났다 (Fig. 6).

본 연구를 통하여 지실의 poncirin, naringin에 대한 동시분 석 정량법과 초음파를 이용하여 최적의 추출법을 확립하고 검 증하였다. 지실의 poncirin, naringin은 70% methanol로 1 : 300의 시료용매비율, 10 min 동안 40°C에서 추출효율이 가 장 좋은 최적의 추출조건을 확립하였다. 조건별로 살펴본 결 과 용매와 용매비율별로 비교하였을 때 추출수율이 poncirin 1.40 ~ 2.18%, naringin 0.86 ~ 1.59%로 가장 많은 차이를 보 였는데 이는 초음파 추출에서 용매가 추출효율에 가장 효과적 인 영향을 미친다는 기존의 연구결과 (Ma et al., 2008)와 비 슷한 결과를 보였다. 또한 초음파 추출법은 낮은 온도에서 추 출하여 유용성분의 파괴를 줄일 수 있고 짧은 시간에도 높은 추출수율과 생리활성을 기대할 수 있다는 결과 (Woo et al., 2009)와 같이 10분이라는 짧은 추출시간과 40°C의 온도에서 높은 추출수율을 보였다.

새롭게 개발된 분석방법을 검증하고자 직선성, 특이성, 정밀 성, 정확성의 검증하여 신뢰성을 높이고자 하였고, 2가지 성분 을 동시 분석할 수 있도록 그 조건을 확립함으로써 경제적, 시간적 및 인력에 대한 효율을 증대시킬 수 있었다. 기존의 KP 10 (MFDS Notification No. 2013-103, 2013)의 추출법 과 정립된 추출법과 비교하였을 때 poncirin 함량은 2.12%와 2.15%로 최적화된 추출법에서 더 높은 함량을 보였다. Naingin은 약전 추출법에서 1.49%와 최적화된 추출법에서 1.60% 함량을 보였고, t-test결과 p-value가 0.05이하로 나타나 유의적인 차이를 보이는 것을 확인 할 수 있었다.

지실의 유효성분인 poncirin, naringin의 동시 분석법과 최적 의 추출조건 확립을 위하여 실험을 진행하였고, 정립된 분석 법과 초음파를 이용한 최적의 추출조건이 지실의 품질관리에 신속하고 효율적으로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.