HepG2 세포를 6 well 3 × 10⁵ cells/ml로 분주하여 48시간 배양 후, 복분자 열매, 잎, 줄기 물 추출물을 처리하여 LDL 및 HDL 관련 유전자 발현 변화를 확인하였다. RNA 추출은 total RNA extraction reagent인 Tri-reagent (RNAiso PLUS, TAKARA, Otsu, Japan)를 사용하여 1ml을 세포에 넣은 후 15초 동안 vortex하여 15분간 상온에 방치하였다. 이후 chloroform 200µl를 넣고 20초간 vortex하여 다시 상온에서 5분 동안 방치하여 15,000 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 상 층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 동량의 isopropanol를 넣고 상 온에서 10분 동안 방치하였다. 이를 15,000 rpm에서 10분 간 원심 분리하여 RNA 침전물을 얻었다. RNA 침전물을 75% 에탄올로 씻은 후, 침전물을 실온에서 건조시켜 0.1% diethyl pyrocarbonate (DEPC) water에 녹였다. RNA 농도 (1 OD=40µg/ml)는 spectrophotometer (DU^R730spectrophotometer, Beckman, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 260㎚에서 측정하 였다.

First strand cDNA을 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 U/µl RNasin (Invitrogen), 1mM each dNTP, oligo (dT)₂₀ 100 ng과 MMLV reverse transcriptase (Invitrogen) 200U가 함유된 20µl의 용액에서 총 RNA 2µg으로부터 합 성하였다. cDNA를 합성 한 뒤, LDL 생성 관련 인자인 LDL 수용체와 전사인자인 sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP-1), sterol regulatory element binding protein-2 (SREBP-2), HMG-CoA reductase mRNA 발현 정 도와 HDL 관련 인자인 콜레스테롤 transporter ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1), scavenger receptor class B, type I (SR-B1) mRNA의 발현 정도를 확인 하였다. 실시 간 역전사 중합효소 연쇄반응은 Fast Start DNA Master SYBR Green I kit (Roche, Mannheim, Germany)를 이용하 여 Light Cycler 2.0 (Roche, Mannheim, Germany)에서 증 폭하였다. 실험에 사용된 primer와 PCR 조건은 Table 2, 3와 같으며 유전자의 정량분석은 Light Cycler Software 4.0 (Mannheim, Germany, Roche)을 이용하였다.

일산화질소 (Nitric oxide, NO)는 혈관내막 (endothelium)에 서 생산되는 물질로서 혈관을 확장시키는 물질로 알려져 있다.

양성대조군으로 동맥과 정맥 평활근에 강력히 작용하여 혈관 이완제로 쓰이는 약물인 sodium nitroprusside (SNP, Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다. HUVEC 세포를 12 well culture dish에 1 × 10⁵ cells/ml의 농도로 분주하여 24시간 배양한 뒤 복분자 열매, 잎, 줄기를 처리하였고, 24시간 뒤 세포배양액을 획득하였다. 대조군인 SNP 또한 같은 방법으로 배양액을 획 득하였다. 처리군의 세포 배양액 상층액 150µl와 20µl의 griess reagent 시약과 130µl의 H₂O 혼합물을 상온에서 30분 간 반응시켰다. 이후 반응물의 흡광도는 microplate reader (Bio-Tek)을 사용하여 흡광도 548㎚에서 측정하였다. 아질산 염 (NO₂)의 농도 정도는 아질산염의 표준곡선으로부터 계산 하였다. 복분자 잎과 줄기 추출물별, 추출물의 농도별로 NO 생성을 확인하였고, 폴리페놀 단일물질과도 비교하였다.

HUVEC 세포를 60㎜ dish에 6 × 10⁵ cells/ml의 농도로 24 시간 동안 배양 후 복분자의 angiotensin converting enzyme (ACE) 억제능력과 endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) 발현능을 확인하였다. 실험에 사용된 추출물은 NO 생 성 결과를 바탕으로 잎 물 추출물과, 줄기 물 추출물, 그리고 복분자 완숙과 50% 에탄올 추출물을 200µg/ml의 농도로 사 용하였다. 양성대조군으로 ACE inhibitor로 알려져 있는 captopril을 처리하였다. 복분자 열매, 잎, 줄기 추출물과 captopril 처리 24시간 후 차가운 PBS로 dish를 washing하고 lysis buffer를 dish에 뿌린 후 스크래퍼를 이용하여 세포를 획 득 하였다. 단백질 추출을 위해 30분 동안 5분에 한번씩 vortex mixing을 하였고, 13,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 를 하여 상층액을 획득 하였다. Bradford 정량법 (Bradford, 1976)을 이용하여 단백질 정량을 시행하였고, SDS-page gel에 loading 하였다. Loading을 마친 후 trans-Blot® Turbo™ (Biorad, Hercules, CA, USA)를 이용해 PVDF membrane (Biorad) 에 단백질을 transfer 시킨 후 5% blocking buffer (Sigma- Aldrich Co.)를 사용해 blocking 과정을 진행하였다. Transfer된 membrane을 1 × TBS-T로 washing 후 5% blocking buffer에 1차 antibody (ACE, eNOS; Santacruz, Dallas, TS, USA)를 희석하여 4°C에서 overnight 시켰다. 다음날 1 × TBS-T로 membrane을 washing 한 뒤 2차 antibody (Santacruz)를 4°C 에서 1시간 반응 시켰다. 이를 다시 1 × TBS-T로 washing 후 ECL western blotting substrate (Promega, Gaithersburg, MD, USA)로 단백질의 발현정도를 확인하였다.

모든 분석 자료는 평균±표준오차 (mean ± SE)로 나타내었 으며 실험결과는 SPSS 12.0K (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 p < 0.05 수준에서 통계처리 하였고 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 검증하였다.

복분자 열매, 잎 및 줄기 추출물의 콜레스테롤 생성 억제 효과를 비교하기 위하여 간세포주인 HepG2 세포를 이용하였 다. 실험결과, 복분자 열매의 경우 100µg/ml의 농도에서 미 숙과와 완숙과 추출물을 비교하였을 때 완숙과에 비해 미숙과 추출물이 보다 높은 콜레스테롤 합성 억제 효과를 나타내었다 (Fig. 2). 복분자 부산물인 잎과 줄기의 물 및 에탄올 추출물 의 콜레스테롤 생성효과를 비교한 결과, 잎의 물과 에탄올 추 출물은 콜레스테롤 합성 억제 효과가 약하였지만, 줄기는 물 추출물과 75% 에탄올 추출물에서 35% 정도로 가장 높은 콜 레스테롤 생성 억제 효과를 나타내었고, 제조공정상의 재료비 절감과 추출수율을 고려하였을 때 향후 수행될 연구에 복분자 열매, 잎 및 줄기의 물 추출물을 이용하였다 (data not shown). 복분자 미숙과, 잎 및 줄기 물 추출물의 농도별 콜레 스테롤 생성 억제효과를 측정한 결과, 100µg/ml의 농도에서 미숙과, 잎, 줄기 추출물이 각각 35%, 20%, 44% 억제효과를 보여 줄기가 콜레스테롤 합성 억제 효과가 더 뛰어난 것으로 밝혀졌다 (Fig. 2).

복분자 열매, 잎, 줄기 추출물들의 총 폴리페놀과 총 플라보 노이드 함량을 조사하였다 (Table 4). 총 폴리페놀과 총 플라 보노이드 함량은 줄기 물 추출물 >잎 물 추출물 >미숙과 물 추출물 >완숙과 50% 에탄올 추출물 순으로 동일하게 확인되 었다. Kwon 등 (2011)의 연구 결과와 비슷한 함량을 나타내 었다. 복분자 부위별 추출물에 대한 페놀성 화합물을 분석한 결과 ellagic acid와 gallic acid의 함량이 높게 나타났으며, rutin, quercetin, ferulic acid, p-coumaric acid, caffeic acid, luteolin, myricetin 등 다양한 페놀 화합물이 분석되었다 (Table 5).

식물체에 존재하는 많은 생리 활성 물질 중 페놀 화합물은 2차 대사산물로서 분자 내에 하나 이상의 phenolic hydroxyl기 를 가지고 있어서 단백질 및 거대분자들과 결합하는 성질이 있으며 2가 금속 이온과의 결합력과 수소 공여 작용을 통해 free radical을 제거함으로써 높은 항산화 효과를 가지는 것으 로 알려져 있다 (Lee et al., 2008; Kwak et al., 2010). 복 분자 열매, 잎, 줄기 추출물 중에서는 줄기 물 추출물이 가장 높은 항산화 효과가 있는 것으로 사료된다.

HMG-CoA reductase는 콜레스테롤 생합성 과정에 중요하게 작용하는 효소로 현재 동맥경화 치료에 사용되어지고 있는 statin 계열의 약물들은 HMG-CoA reductase의 저해제로 작용 하고 있다. 따라서 HMG-CoA reductase의 활성을 조절하면 혈중 콜레스테롤의 수치를 조절할 수 있다는 사실을 바탕으 로 복분자 미숙과, 잎 및 줄기 물 추출물의 HMG-CoA reductase 억제활성을 비교한 결과, 양성대조군이자 HMG-CoA reductase 저해제인 pravastatin은 약 55%의 억제활성을 보였 고, 미숙과, 잎 및 줄기 물 추출물은 각각 70%, 51%, 60% 의 억제효과를 보였다 (Fig. 3).

결과적으로 HMG-CoA reductase activity 억제 활성 비교 에서는 복분자 미숙과가 가장 높은 억제활성을 보였고, 다음 으로 줄기, 잎 추출물 순으로 억제 효과를 보였다.

복분자는 폴리페놀 성분이 풍부하다고 알려져 있는데, 10가 지의 폴리페놀 단일물질을 이용하여 HMG-CoA reductase 활 성 억제효과를 조사한 결과, 10가지 폴리페놀 단일물질 중에 서 caffeic acid 40%, ellagic acid 40%, gallic acid 34%, ferulic acid 30%의 억제효과를 나타내었다. 나머지 6가지의 단일물질은 HMG-CoA reductase 활성 억제에 미치는 영향이 적은 것으로 나타났다. 다른 연구 결과에서도 포도씨에 함유 된 폴리페놀 중 gallic acid가 혈중 콜레스테롤 억제에 효과가 있음을 증명하였고 (Ngamukote et al., 2011), 녹차와 홍차 추출물이 HMG-CoA reductase 활성 및 콜레스테롤 합성 억 제 효과가 있다고 밝혔지만, 녹차의 단일물질인 epicatechin, ECG, EGC, ellagic acid, gallic acid에서는 콜레스테롤 합성 억제 효과는 보이지 않는다고 보고하였다 (Singh et al., 2009).

이상의 콜레스테롤 합성 억제 효과와 HMG-CoA reductase 활성 억제 효과를 종합해 보면, 복분자 미숙과와 줄기 물 추 출물이 가장 높은 콜레스테롤 개선효과가 있음을 확인할 수 있었고, 이러한 결과를 바탕으로 복분자 부산물인 잎, 줄기 또 한 혈중지질 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

인간간암세포주인 HepG2 세포에서 복분자 열매, 잎 및 줄 기 추출물을 배지 내에 첨가한 뒤 48시간 동안 배양하여 real-time PCR을 통해 LDL 및 HDL 유전자 발현을 조사하 였다 (Fig. 4). LDL 관련 유전자를 확인해본 결과 HMG-CoA reductase mRNA 발현은 복분자 미숙과, 잎, 줄기 물 추출물이 각각 2.2배, 2배, 2.6배로 줄기가 가장 많이 증가 하 였다.

HMG-CoA reductase 억제제인 statin 계열의 약물들은 HMG-CoA reductase의 활성은 감소시키지만, 감소된 콜레스 테롤에 대한 항상성 유지를 위해 HMG-CoA reductase 유전 자의 발현은 증가하게 된다 (Pal et al., 2003).

복분자 미숙과, 잎, 줄기 물 추출물을 100µg/ml 처리했을 때 LDL receptor (LDLR)의 발현을 각각 1.6배, 1.5배, 1.8배, SREBP-2는 각각 2.0배, 1.5배, 2.2배, SREBP-1은 3.6배, 3.7 배, 7.4배 증가시켜, 줄기, 미숙과, 잎 물 추출물 순으로 높은 유전자 발현양상을 보였다 (Fig. 4).

간세포는 콜레스테롤 양이 많아지면 콜레스테롤 생산을 줄 이거나 느리게 진행시켜 혈중 콜레스테롤 합성을 조절한다. 혈 중 지단백질은 크게 LDL과 HDL로 나뉘는데 LDL은 혈관에 쌓이는 지질단백질로서, 혈중 콜레스테롤의 약 3/4를 형성하 고 (Mahley et al., 1984), 간에서 조직과 세포로 콜레스테롤 을 운반한다. 콜레스테롤 자체로는 인간 건강에 크게 위협적 이지 않지만 LDL에 같이 포함되어 있어서 건강지표로 이용 된다. HDL은 세포에서 소모되지 않은 과량의 콜레스테롤을 조직에서 다시 간으로 운반해주며, 운반된 콜레스테롤은 간에 서 분해되어 담즙산으로 분비되고 산화 LDL의 결합 수용체 로 알려졌던 SR-B1에 결합한다 (Steinberg, 1996). 주로 LDL 에 붙어 있는 콜레스테롤이 동맥경화를 유발시키는 반면 HDL 은 동맥경화를 지연시키거나 감소시킨다. 세포 내 콜레스테롤 의 생합성은 acetyl-CoA 3개 분자가 결합하여 HMG-CoA, mevalonic acid 등의 과정을 거쳐 이루어지는데, 이때 HMGCoA reductase가 효소로 쓰이게 된다. 콜레스테롤 합성을 조 절하는 HMG-CoA reductase가 세포 내 콜레스테롤 농도에 따라 상호 발현을 조절함으로써 균형이 결정된다 (Taniguchi et al., 1994). LDL receptor는 혈중 콜레스테롤을 제거하고 세포 내 콜레스테롤 양에 따라 발현이 조절되어 균형을 유지 하는데 중요한 역할을 한다. 혈중 콜레스테롤이 증가하면 LDLR 유전자 발현을 조절하는 SREBPs의 발현이 증가하고, 증가된 SREBPs 유전자는 LDLR의 발현을 증가시켜 세포 내 로의 콜레스테롤 흡수를 촉진하여 혈중 콜레스테롤 농도를 낮 춘다. 또한, LDLR의 발현은 콜레스테롤 농도를 낮출뿐만 아 니라 세포 내 콜레스테롤 항상성을 유지하기 위해 HMG-CoA reductase의 발현을 증가시킨다고 알려져 있다 (Pal et al., 2003).

SREBP isoform은 SREBP-1a, 1c, 2의 세 가지가 있으며, SREBP-1a와 SREBP-1c는 주로 지방산 합성에 관여하며 (Brown and Goldstein, 1997), 간세포에서의 중성지방 합성과 관련된 유전자의 발현을 조절하고 (Horton et al., 2002), SREBP-2는 콜레스테롤 합성과 대사에 관여한다고 알려져 있 다 (Han et al., 2002). HepG2 세포에 적포도주나 이소플라 본을 함유하는 콩 추출물을 처리하였을 때 LDLR와 SREBPs 발현을 증가시켜 혈중 콜레스테롤의 농도를 낮추는데 효과를 나타내었다 (Pal et al., 2003; Mullen et al., 2004).

HDL 관련 유전자인 ABCA1 및 SR-B1 mRNA 발현에 미 치는 영향을 HepG2 세포에 추출물별로 100µg/ml의 농도로 처리하여 조사한 결과, 복분자 미숙과, 잎, 줄기 모두 ABCA1 은 약 2.5배, SR-B1은 1.5배로 증가하여 비슷한 효과를 보였 다 (Fig. 4). ABCA1은 HDL 콜레스테롤 운송에 관여하는 것 으로 보고되어졌으며 (Aiello et al., 2003; Joyce et al., 2003), 세포의 콜레스테롤과 인지질의 항상성을 조절한다. 따 라서 ABCA1의 발현이 증가하게 되면 혈중 HDL의 농도가 증가하여 콜레스테롤이 체외로 배출되어 체내의 콜레스테롤이 낮아진다. SR-B1은 체내 콜레스테롤 대사에 있어서 HDL의 선택적 흡수에 관여하고 간과 지방대사 조직에 가장 많이 분포 하고 있으며 콜레스테롤을 간을 통해 체외로 배출하여 동맥경 화에 대응하는 기작을 가지고 있다고 알려져 있다 (Krause and Auerbach, 2001; Brundert et al., 2006). 커피의 caffeic acid, ferulic acid에서 ABCG1과 SR-B1의 발현이 증가함으로써 HDL 콜레스테롤이 증가한다고 보고하였다 (Uto-Kondo et al., 2010). 즉 LDL 및 HDL 관련 mRNA 발현능을 확인한 결과, 복 분자 줄기, 미숙과, 잎 물 추출물 순으로 혈중지질 개선에 효 과가 높은 것으로 사료된다.

HUVEC 세포에서 복분자 열매, 잎 및 줄기의 NO 생성능 을 비교하였다 (Fig. 5). 예비실험 결과, 복분자 열매인 완숙과 와 미숙과의 물과 에탄올 추출물의 NO 생성을 비교해 보았을 때 완숙과 50% 에탄올 추출물에서 높은 NO 생성을 보여 열 매는 50% 에탄올 추출물을 사용하였다 (data not shown). 그 리고 복분자 부산물인 잎과 줄기의 물과 에탄올 추출물의 NO 생성을 비교한 결과, 줄기가 잎 보다는 높은 NO 생성을 보였 고, 물과 에탄올 추출물간 큰 차이를 보이지 않아 물 추출물 을 선택하여 연구를 진행하였다.

복분자 완숙과, 잎, 줄기 추출물 농도별로 생성되는 NO의 양 을 측정해본 결과, 잎과 줄기 추출물 모두에서 25 ~ 200µg/ml 로 추출물의 처리 농도가 증가함에 따라 NO의 생성량이 증가 되었다. 그 중에서도 특히 줄기 물 추출물의 NO 생성량이 가 장 높게 측정 되었고 (5.5배), 복분자 완숙과 50% 에탄올 추 출물 (4.3배), 잎 물 추출물 (2.3배)의 순으로 높은 NO 생성 효과를 나타내었다. 폴리페놀 단일물질은 caffeic acid, ellagic acid, ferulic acid, gallic acid, kaempferol, luteolin, myricetin, p-coumaric acid, quercetin, rutin 총 10가지를 이용하여 10µg/ml의 농도로 처리하여 NO 생성을 확인한 결과, gallic acid는 control 그룹과 비교하여 4.9배, myricetin은 2.8배의 NO 생성을 나타내었고 그 밖의 8가지 단일물질의 NO 생성 효과는 미미하였다.

내피의존성이완물질은 NO로 알려져 있으며, 혈관내피세포 에서 eNOS에 의하여 L-arginine으로부터 합성되고, 이에 합성 된 NO는 혈관 평활근에서 soluble guanylyl cyclase를 활성화 시켜 3’, 5’-cyclic guanosine monophosphate를 증가시킴으로 써 세포 내 Ca2+ 농도를 감소시켜 혈관을 이완시킨다고 알려 져 있다 (Busse et al., 1993; Horowits et al., 1997).

Godse 등 (2010)은 fructose 유도 고혈압 동물모델에서 angiotensin II를 억제하여 myricetin이 혈압을 감소시킨다고 보고하였고, Sarr 등 (2006)의 연구 결과에서는 gallic acid 및 caffeic acid를 함유하는 적포도주 추출물을 이용하여, angiotensin II로 유도된 고혈압 동물에서 적포도주 추출물이 내 피세포의 기능장애를 억제하고 NADPH 산화 효소의 유도를 억 제하지만 혈압의 변화에는 영향을 미치지 않았다고 보고하였다.

복분자 완숙과 50% 에탄올 추출물과 잎과 줄기 물 추출물 을 200µg/ml의 농도로 사용하여 ACE와 eNOS 단백질 발현 를 조사하였다. 그 결과, 줄기 물 추출물을 처리한 그룹에서 ACE 단백질 발현이 가장 큰 억제효과를 보였으며, 복분자 열 매와 잎 추출물을 처리한 그룹에서는 비슷한 ACE 단백질 발 현 억제 효과를 보였다 (Fig. 6).

ACE는 신장 또는 폐에서 분비되며, angiotensin I을 angiotensin II로 전환시키는 효소로 혈압조절에 가장 중요하게 작용하고 있고 (Atlas, 2007), eNOS는 칼슘의존성으로 국소적 혈류, 동맥혈압, 혈관장력 조절에 관련되어 평활근을 확장시키 고, 혈소판 응축을 억제시키는 유용한 인자이다 (Thomsen et al., 1995). 10가지의 폴리페놀 단일 물질 중 NO 생성효과가 뛰어난 gallic acid와 myricetin 20µg/ml를 처리하여 eNOS 발현을 확인하였다. 복분자 완숙과, gallic acid, myricetin 모 두 비슷하게 eNOS 발현이 증가함을 확인 할 수 있었고, eNOS 발현 증가가 NO 생성을 증가시켜 혈압에 개선 효과를 나타내는 것으로 사료된다.

위 결과를 종합해보면, 복분자 완숙과, 잎 및 줄기 추출물의 혈압개선 효과를 비교한 결과, 줄기, 완숙과, 잎의 순으로 NO 생성, ACE 단백질 발현 억제 및 eNOS 증가 효과가 뛰어났 을 뿐만 아니라, 단일 물질인 gallic acid와 myricetin 또한 혈 압 개선에 효과가 있음을 확인하였다.