상심자 (Morus alba L.)는 전라북도 부안군 농업기술센터에 서 1kg 구입하였다. 상심자 생과를 식품용 분쇄기를 이용하 여 700 rpm으로 5분간 분쇄 후 분쇄된 상심자 즙에 3배량 (w/v)의 40% 에탄올 수용액으로 50°C에서 4시간, 총 3회 추 출한 다음 냉각하고 0.125mm (80 mesh) 규격의 스테인레스 스틸 거름망을 사용하여 여과하고 여기에서 얻은 여과액을 다 시 여과지(Whatman No. 2)를 사용하여 재여과하였다. 얻어 진 여액을 60°C에서 60 brix까지 감압 농축하고 여기서 얻 어진 농축액을 동결건조하여 상심자 추출분말을 113.2 g 수 득하였다.

상엽 추출물은 상엽을 전라북도 부안군 농업기술센터에서 1kg 구입하여 다음과 같이 제조하였다. 상엽을 정제수로 세척 후 50°C, 24시간 건조하고 식품용 분쇄기를 이용하여 700 rpm 으로 5분간 분쇄 후 분쇄된 분말에 4배량 (w/v)의 50% 에탄 올 수용액으로 60°C에서 4시간, 총 3회 추출한 다음 냉각하고 0.125mm (80 mesh) 규격의 스테인레스 스틸 거름망을 사용하 여 여과하고 여기에서 얻은 여과액을 다시 여과지 (Whatman No. 2)를 사용하여 여과하였다. 얻어진 여액을 60°C에서 30 brix까지 감압 농축하고 여기서 얻어진 농축액을 동결건조하여 상엽 추출분말을 76.4 g 수득하였다.

서리태 (Glycine max (L.) Merr.)추출물은 서리태를 경상남 도 함양농협에서 1kg 구입하여 다음과 같이 제조하였다. 서 리태를 세척 후 서리태의 4배량 (w/v)의 30% 에탄올 수용액 으로 60°C에서 4시간, 총 3회 추출한 다음 냉각하고 0.125mm (80 mesh) 규격의 스테인레스 스틸 거름망을 사용하여 여과하 고 여기에서 얻은 여과액을 다시 여과지 (Whatman No. 2)를 사용하여 여과하였다. 얻어진 여액을 60°C에서 30 brix까지 감압 농축하고 여기서 얻어진 농축액을 동결건조하여 서리태 추출분말을 134.7 g 수득하였다.

상심자추출물, 상엽추출물 및 서리태추출물 중 퇴행성관절 염 개선에 필요한 항염증효과물질들의 함량을 고려하여 상 심자추출물 등 복합물을 제조하였다. 상심자추출물 중 안토 시아닌 (ca. 1%), 서리태 추출물 중 이소플라본 (ca. 0.2%), 상엽추출물 중 루틴 (ca. 1%)의 함량을 고려하여 상심자추출 분말 70 g, 상엽추출분말 14 g, 서리태추출분말 16 g을 혼합하 여 상심자추출물 등 복합물을 제조하였고 이를 Complex of Mulberry Extract (CME)라 명하였다.

DPPH radical 소거능의 측정은 Blios (1958)의 방법에 의해 실행되었다. 각 농도별 시료 75 µL를 에탄올에 0.2 mM의 농 도로 녹인 DPPH (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA)용액 750 µL에 첨가하고 다시 3차 정제수 675 µL를 넣 고 혼합하였다. 상온에서 30분간 반응하고 96 well plate에 반 응액 200 µL를 옮긴 후, ELISA reader (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, California, USA)를 사용하여 520nm의 파 장에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 EGCG (epigallocatechin gallate)와 Vitamin C를 사용하였다. DPPH 라디칼 소거활성 (%)은 (1-시료 첨가구의 흡광도/시료 무첨가 구의 흡광도) × 100의 계산식을 사용하였다. SC₅₀값은 발생한 라디칼을 50% 소거하는데 필요한 최소농도를 µg/mL 단위로 표시한 것이다.

마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 인간 간세포주인 HepG2 세포는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 분양받았으 며, 세포배양을 위해 penicillin (100 IU/mL)과 streptomycin (100µg/mL) 및 10% FBS (Fetal Bovine Serum)를 포함하는 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California, USA)배지를 사용하 였다 (Bao et al., 2009). 세포는 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양 (SANYO Electric Co., Ltd., Osaka, Japan)하였다.

Raw264.7 세포와 HepG2 세포에 대한 CME의 독성 측정 은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)법을 실시하여 측정하였다 (Sladowski et al., 1993). Raw 264.7 세포를 96well plate에 5 × 10^４ cells/well로 분주한 다음, 37°C, 5% CO₂에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 시료를 각 농도별로 용해한 배지를 분주한 후 37°C, 5% CO₂에서 24시간 동안 배 양하였다. 24시간 후 각 well 당 0.2% MTT용액 (in PBS)을 20 µL씩 첨가하여 37°C, 5% CO₂의 조건으로 배양기에서 3시 간 동안 반응시켰다. 반응 후 배지를 모두 제거하고 생성된 formazan을 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 200 µL로 10분간 녹인 다음 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도의 변 화를 측정하였다. 세포 생존율 (%)은 (시료 처리군의 흡광도/ 시료 무처리군의 흡광도) × 100의 식을 사용하였다.

각 시료가 염증유발 물질인 NO의 생성을 억제하는 효과는 마우스 대식세포 유래의 Raw 264.7 세포에 Lipopolysaccharide (LPS)를 처리함으로써 배양액에서 생성되는 NO의 안정화된 형 태인 NO₂⁻의 농도를 Griess 반응을 이용하여 측정하였다 (Kwak et al., 2008). 먼저, FBS와 항생제가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 96well plate에 1 × 10^４cells/well로 세포를 분 주 후 37°C, 5% CO₂항온기에서 24시간동안 배양하였다. 24시 간 후, 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 FBS와 항생제가 함유되지 않은 새로운 배지를 분주한 후 CME를 200µg/mL 의 농도로 처리하였다. 1시간 후 1µg/mL의 농도로 LPS를 첨 가하여 24시간 배양하였다. 세포배양액 50 µL와 Griess시약 50 µL를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitric oxide 소 거능 (%)은 (1-시료를 첨가한 반응군의 흡광도/시료를 첨가하 지 않은 대조군의 흡광도) × 100의 계산식을 이용하여 나타내 었다.

Cell culture dish (100mm)에 5 × 10^４ cells/mL로 Raw 264.7 세포를 분주하고 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간동안 배양한 후, 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 FBS와 항생 제가 함유되지 않은 새로운 배지를 분주하고 CME를 200µg/ mL 및 1,000µg/mL의 농도로 Raw 264.7 세포에 1시간 처리 한 후 LPS를 1µg/mL의 농도로 추가로 처리하여 COX-2의 발현을 유도하였다. 24시간 후, 세포를 Lysis buffer (20 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.05 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, pH 7.5)로 용해시키고 4°C에서 20분간 4,000 g로 원심분리한 후 총 단백질을 정량하였다. 동 일한 농도로 희석한 각 단백질을 Western blotting하였다. 각 well당 1mg의 총 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기영동한 후 nitro-cellulose 막에 옮긴 다음, Blocking 완충용액 (5% Skim milk, 0.5% Tween in PBS)에 넣고 상온에서 1시간 교반한 후, TBS-T 완충용액 (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.4)에 1/1,000으로 희석한 anti-COX-2 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, Massachusetts, USA) 용액에서 4°C, 24시간 반응시켰다. TBS-T 완충용액으로 3회 세척하고 TBS-T 완충용액에 1/2,000으로 희석한 이차 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, Texas, USA)로 상 온에서 1시간 반응시킨 후 TBS-T 완충용액으로 3회 세척하 고 화학발광키트 (Pierce, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, Illinois, USA)를 이용하여 X-ray필름에 현상하였고 총 단백질량의 동일성은 β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, Texas, USA)의 양으로 검증하였다. 각 단백질의 발현량은 ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA) 프로그램을 이용하여 정량하였다.

Spraugue Dauley계 흰쥐에 MIA (Mono sodium iodoacetate, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA)를 무릎 관절강 내 intra-articular injection함으로써 chondrocyte의 metabolism를 저해하고 이로 인해 cartilage, ligament 및 tendon의 손상을 유 발시켜 골관절염을 발생시키는 원리를 이용하였다 (Janusz et al., 2001). 즉, 실험동물 수는 각 군당 10 마리로 하여 체중 300 g-350 g의 흰쥐의 무릎 관절강내로 1 mL 주사기를 사용하 여 실험군 (CME 400mg/ 체중 kg 경구투여), 음성대조군 (정 제수 경구투여), 양성대조군 (Ibuprofen 20mg/ 체중 kg 경구 투여)에는 MIA (40mg/mL)를 50 µL씩 주사하고 Sham군에는 MIA 대신 PBS를 주사하였다. 24시간 후부터 Table 1에 나타 낸 바와 같이 각 군별로 정제수 또는 CME 또는 ibuprofen을 14일간 매일 정해진 투여량으로 경구투여하였다.

MIA유도 퇴행성관절염 동물모델을 대상으로 TNF-α 또는 IL-1β sandwich ELISA kit (eBiosience, Inc., San Diego, California, USA)을 사용하여 측정하였다. 즉, 각 시료를 경구 투여한 MIA유도 퇴행성관절염 동물모델을 희생하고 채혈 및 혈장분리를 한 다음 혈장내에 존재하는 TNF-α 또는 IL-1β의 농도를 ELISA kit의 제조회사가 제시한 방법을 응용하여 측 정하였다. 먼저, 96 well plate에 코팅 되어 있는 anti-rat TNF-α 또는 IL-1β antibody에 혈장에 존재하는 TNF-α 또는 IL-1β를 4°C, 24시간 결합시키고 각 well을 5번 세척한 후 biotin-conjugated anti-rat TNF-α 또는 IL-1β antibody를 상온 에서 1시간 반응시킨 후 각 well을 5번 세척하고 streptavidin- HRP를 40분간 처리하고 최종적으로 tetramethyl-benzidine으로 발색하여 ELISA reader를 이용해서 450 nm의 파장에서 흡광 도를 측정하였다. TNF-α 또는 IL-1β의 양은 ELISA kit에 포 함된 표준 재조합 TNF-α 또는 IL-1β의 반응표준곡선을 이용 하여 산술비례적으로 구하였다.

Carrageenan 유도 족부 부종억제 실험은 Winter 등 (1962) 의 방법을 응용하여 실험하였다. 즉, SD계 흰쥐를 대상으로 Table 2에 나타낸 바와 같이 각 군의 개체수를 10마리로 하여 시료를 각 농도별로 1일 1회 3일간 경구투여하고 마지막 경구 투여 1시간 후 Digimatic micrometer (Mitutoyo Corporation, Kanagawa, Japan)를 사용하여 족부종을 유발하기 전의 족부 두께를 측정하고 1% Carrageenan을 용해한 생리식염수를 100 µL의 양으로 좌측 족저부에 주사하여 족부 부종을 유도하 고 5시간 후 다시 족부 두께를 측정하였다.

실험결과는 3회 반복하여 평균 ±표준오차 (Mean ± SE)로 나타냈으며, SPSS (version 21) 통계프로그램으로 Student’s ttest를 이용하여 p < 0.05일 때 유의한 것으로 판정하였고, one-way ANOVA를 실시한 후 p < 0.05의 유의수준에서 Duncan’s Multiple Range Text (DMRT)에 의하여 각 실험군의 평균치 간의 유의성을 검증하였다.

CME가 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 SC₅₀값을 µg/mL 단 위로 Table 3에 나타내었다. DPPH는 비교적 안정한 자유라디 칼로서, 항산화 물질에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화능을 측정할 때 DPPH 라디칼 포착능 측정법이 많이 이용된다. CME의 SC₅₀값은 158.49 ± 11.35µg/mL으로 양성대조군으로 사용한 단일물질인 EGCG 및 비타민 C의 SC₅₀값인 6.24 ± 1.10µg/mL 및 5.88 ± 0.69µg/mL보다 높았다. CME의 원료인 상심자, 상엽 및 서리태에서 항산화 효과에 기여할 것 으로 예상되는 polyphenol에는 anthocyanin, rutin, quercetin 및 isoflavone 등이 있을 것으로 기존의 연구를 통하여 예측할 수 있다 (Ryu and Kwon, 2012; Bae et al., 2011; Oh et al., 2002).

RAW 264.7 세포와 HepG2에 대한 CME의 세포독성을 알아 보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. CME를 농도별 (312.5, 625, 1,250, 2,500, 5,000µg/mL)로 24시간 동안 각각 처리한 결과는 Fig. 1에 나타내었다. CME를 5,000µg/mL 처리한 경 우, RAW 264.7 세포의 생존율은 90.42 ± 3.11%이었으며 HepG2세포의 생존율은 90.21 ± 1.14%로 약간의 생존율 저하가 있었으나 2500µg/mL이하의 농도를 처리한 경우, 세포독성을 보이지 않았다. 이는 식품의약품안전처에서 식용이 허용된 대 부분의 천연물보다 안전한 수준이다. 또한, 이는 CME의 원료 인 상심자, 상엽 및 서리태의 세포안전성에 관한 기존의 연구 (Lee, 2013; Park, 2009; Jeon et al., 2011)와 일치되며 이러한 원료를 혼합한 CME의 세포안전성도 확인한 결과라 할 수 있다.

RAW 264.7 세포에서 LPS를 처리하여 생성된 염증유발물 질인 NO는 LPS 처리 후 PBS를 처리한 음성대조군의 경우 144.22 ± 16.48 µM이었으며 LPS 처리 후 CME를 200µg/mL 처리한 경우 45.79 ± 4.81 µM로 나타나 음성대조군에 대비 하여 약 68.25% NO 생성억제 효과를 보였다 (Table 4). Park 등 (2013)은 동결건조 상엽 에탄올추출물을 50µg/mL의 농도로 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때 NO 생성이 약 44% 감소되었다고 보고하였다. Korhonen 등 (2005)에 의하면 pro-inflammatory cytokine이나 염증성 자극에 의해 iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase)의 발현이 증가되면 NO가 과량 분비되어 정상세포를 손상시키고 염증에 악화시킨다. CME 처리가 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 NO의 생 성을 억제하는 것은 iNOS의 발현을 저해하여 나타난 결과라 고 사료된다.

CME가 MIA유도 퇴행성관절염 동물모델에서 염증유발 사 이토카인인 TNF-α 및 IL-1β의 생체내 발현을 감소시키는 효 과는 Fig. 2 및 Fig. 3에 나타내었다. 즉, MIA를 처리하고 정제수를 14일간 경구투여한 음성대조군의 경우, 혈중 TNF-α 및 IL-1β는 각각 2.57 ± 0.15 ng/mL 및 1.33 ± 0.25 ng/mL이 었으며 관절염 치료제로 사용되는 합성의약품인 ibuprofen 을 20mg/kg체중의 투여량으로 14일간 경구투여한 경우, 1.93 ± 0.16 ng/mL 및 1.34 ± 0.14 ng/mL으로 미미한 TNF-α 및 IL-1β 감소효과를 보였으나 CME를 400mg/kg체중의 투여 량으로 14일간 경구투여한 경우, 각각 0.82 ± 0.03 ng/mL 및 0.29 ± 0.09 ng/mL으로 현저한 TNF-α 및 IL-1β 감소효과를 보 였다. CME 100mg/kg체중 투여군의 TNF-α는 1.13 ± 0.14 ng/ mL로서 대조군에 비해 63.7% 억제된 것으로 나타났다. Park 등 (2013)은 상엽 에탄올 추출물을 LPS로 염증이 유도된 마 우스 대식세포에 처리한 결과 TNF-α의 발현을 20%, IL-1β 발현을 35%이상 감소시켰다고 보고하였다. 급성 또는 만성 염증반응에서 TNF-α 및 IL-1β와 같은 pro-inflammatory cytokine은 림프구간의 신호를 서로 전달하여 면역세포를 활성 화시키고 lymphokine과 같은 면역인자들의 생산 및 분비를 유 도하여 염증반응을 활성화한다 (Feghali and Wright, 1997; Dinarello, 2000). 본 연구의 퇴행성관절염 동물모델에서 CME 의 TNF-α 및 IL-1β 생성억제 효과는 이러한 cytokine에 의 해 유도되는 염증반응의 활성화를 CME에 의해 억제시키는 효과를 기대할 수 있게 한다.

Fig. 4는 LPS에 의하여 활성화된 RAW 264.7 세포에서 발 현이 증가된 COX-2를 ibuprofen을 10µg/mL 처리한 경우, COX-2의 발현을 거의 감소시키지 못했지만 CME를 각각 200µg/mL 및 1,000µg/mL 처리한 경우, COX-2를 농도 의 존적으로 현저하게 감소시켰다. 이는 Park 등 (2013)이 동결건 조 상엽 에탄올추출물 (50µg/mL)을 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때 COX-2의 생성을 저해한다 고 보고한 것과 비슷한 결과이다. Botting (2006)에 의하면 활 성화된 macrophages에서 발현이 증가된 COX-2에 의해 생성 된 PGE2가 혈관확장, 발열 및 통증을 유발하고 관절염이나 다 발성 경화증과 같은 질병을 야기하거나 악화시킨다. CME는 이러한 COX-2의 발현을 억제함으로써 PGE2의 생성을 감소 시켜 관절염과 같은 염증성 질환의 악화를 방지할 것으로 기 대된다.

Fig. 5에 나타낸 바와 같이 정제수를 3일간 경구투여하고 Carrageenan으로 급성염증을 유도한 음성대조군의 경우, Carrageenan 주사 5시간 후 족부 부종율은 149.20 ± 7.50%이 었으며 ibuprofen을 20mg/kg체중, 3일간 경구투여한 양성대조 군의 경우, 족부 부종율은 110.15 ± 8.07%이었고 CME를 100 또는 400 mg/kg체중, 3일간 경구투여한 실험군의 경우, 족 부 부종율은 각각 118.14 ± 5.76% 및 106.94 ± 6.26%로 나타났다. Anandakumar 등 (2014)은 강황추출물의 경구투여 가 carrageenan으로 급성염증이 유도된 동물의 족부 부종 억 제에 효과가 있음을 보고하였다. 부종은 histamine, serotonin, bradykinin 및 prostaglandins와 같은 염증 매개체에 의한 혈관 투과성 증가와 혈관확장 증상의 급성염증 반응이다 (Vane and Botting, 1987). 대표적인 소염진통제로 사용되는 단일성분인 Ibuprofen보다는 CME의 부종억제율이 우수하지 않지만 CME 가 정제되지 않은 복합물질임을 고려할 때, 매우 우수한 급성 염증성 부종억제 효과가 있다고 사료된다.