본 실험에 사용한 황기 (Astragalus membranaceus Bunge) 는 막협황기 (膜莢黃耆)로서 태백수집종을 선발하여 1999년 작 물과학원에서 육성한 품종인 “풍성황기”이며 정선군농업기술 센터에서 2년 동안 재배된 것의 전초를 채취하였다 (2012. 7. 23). 황기 지상부로부터 다당체를 획득하고 이들의 장관면 역 증강활성 및 단회 경구 투여 독성시험을 위하여 지상부 (AMA, 잎과 줄기)의 시료를 잘게 잘라 50°C의 dry oven에서 5시간 동안 건조하여 분쇄한 후 40 mesh 이하의 체에 통과시 켜 분말시료로 준비하였다.

황기 지상부의 조다당 획분의 제조에서는 분말화된 황기 지 상부 시료 1㎏에 대해 20배 부피의 증류수를 첨가하고 교반 후 처음 첨가된 증류수의 절반이 되는 양까지 가열하였다. 다 시 동일한 양의 증류수를 이용해 2회 반복 추출하고 추출액을 합하여 흡인 여과한 후 여과액을 합하여 감압농축하고 농축된 양의 5배의 EtOH을 첨가하여 침전시키고 4°C에서 30분간 7,000 rpm으로 원심분리하여 상등액과 잔사로 분리하였다. 남 은 잔사를 대상으로 투석을 실시한 후 다시 −70°C 조건에서 동결한 후 동결 건조하여 황기 지상부 조다당 획분을 얻었다.

황기 지상부 열수 추출물로부터 제조된 황기 지상부 조다당 획분이 당구조를 가진 고분자 화합물인지의 여부와 이들이 실 제 장관면역활성을 물질을 포함하고 있는지의 여부를 판단하 기 위하여 황기 지상부 조다당 획분을 대상으로 하여 NaIO₄ 에 의한 산화 처리와 pronase에 의한 가수분해 처리를 수행하 고 처리 전• 후의 장관면역 활성을 검정하였다. 장관면역 활 성검정은 하기 기술하는 분리된 장관면역 활성 다당체 활성검 정과 동일한 방법을 적용하였으며 NaIO₄에 의한 산화 처리와 pronase 효소에 의한 가수분해 처리는 Yamada 등 (1990)의 방법에 의거하여 실시하였다. 즉 조다당 획분 (AMA-0) 50㎎ 에 25 mM NaIO₄가 함유된 50 mM acetate buffer (pH 4.5) 50ml를 첨가하고 암실, 4°C에서 96시간 교반하였다. 잔여 periodate를 제거하기 위해 ethylene glycol을 첨가하고 투석을 행하여 얻은 비투석액에 NaBH₄를 첨가하여 환원시키고 초산 으로 중화 후 투석, 동결 건조하여 AMA-0의 NaIO₄ 산화물 (periodate-oxidized AMA-0, 수율; 56.2%)을 조제하였다. Pronase 효소에 의한 가수분해 처리는 조다당 획분 (AMA-0) 20㎎을 10㎎ CaCl2가 함유된 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9) 20ml에 용해시킨 후 4,000 units/ml의 pronase (30㎎, Actinase E, Kaken Pharmaceutical Co., Tokyo, Japan)를 가 하여 37°C에서 48시간 가수분해 시켰다. 효소반응은 0.1 N HCl로 중지시키고 투석 후 동결 건조하여 AMA-0의 단백 질 분해물 (pronase-digested AMA-0, 수율; 64.3%)로 조제하 였다.

본 시험 결과는 평균값과 표준편차로 표기하였으며 통계학 적 분석은 SPSS 14.0K를 이용하였고 측정 항목 중 황기 지 상부 열수 추출물로부터 획득된 다당체의 장관면역 활성관 련 결과 및 단회 경구 투여 독성시험 중 체중 결과에 대하여 oneway analysis of variance (ANOVA) 검정법을 사용하였고, 이때 p-value가 0.05 이하일 경우 유의한 것으로 판정하였다. 단회 경구 투여 독성시험에서 사망동물이 관찰되지 않아 반수 치사량 (LD50)의 산출을 위한 통계는 실시하지 않았다.

분말화된 황기 지상부 시료로부터 얻은 조다당 분획을 대상 으로 하여 장관면역 활성을 검정한 결과 AMA-0 획분은 10µg/ml를 처리한 경우 F. I. 값이 786.5 ± 28.8를 나타내어 대조구 [F. I. (Fluorescence intensity): 602.0 ± 12.4]보다 높은 활성을 나타내었으며 100µg/ml를 처리한 경우 F. I. 값이 1145.8 ± 62.6를 나타내어 대조구에 비하여 1.9배 이상 증가된 활성을 나타내었다 (Table 1). 이러한 결과는 장관면역 활성을 나타내는 물질들은 저분자 물질들이 주로 추출되는 MeOH나 EtOH 추출보다 열수 추출과 주로 고분자류가 침전되는 에탄 올 침전을 통해 얻을 수 있다는 보고 (Yang et al., 2004)와 인삼 잎에서부터 면역활성이 높은 다당체를 얻기 위해서는 냉 수나 열수의 추출조건이 다당이나 단백질 및 고분자류의 추출 에 적합한 조건이고 이 고분자가 macrophage의 활성을 자극 하는 활성물질이라는 보고 (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, 2002)와도 유사하였으며 황기 지상부를 대 상으로 열수추출과 에탄올 침전을 통해 얻어지는 조다당 획분 인 AMA-0 중에 장관면역 활성을 가지는 물질이 포함되어져 있는 것으로 추정하였다.

황기 지상부를 대상으로 열수추출과 에탄올 침전을 통해 얻 어지는 조다당 획분인 AMA-0에 포함된 활성물질을 검토하기 위하여 AMA-0를 periodate (NaIO₄) 산화 및 단백질 분해효 소인 pronase로 가수분해한 이후 그 반응산물들에 대하여 골 수세포 증식능을 통한 장관면역 활성을 비교 검토하였다. Table 1에서 보이는 것처럼 periodate 산화 및 pronase에 의한 가수분해로 처리군에서 모든 농도의 AMA-0의 장관면역 활성 이 감소하였으나 황기 지상부 조다당 획분 100µg/ml에 pronase를 처리한 경우에의 장관면역 활성 감소는 통계적으로 유의한 수준이 아니었다. periodate 산화 및 pronase에 의한 가수분해에 의한 황기 지상부 조다당 획분의 장관면역 활성 감소 비율 중 특히 periodate에 의한 산화가 가장 많은 활성 감소 비율을 나타내었다 (시료농도 100µg/ml, AMA-0 활성의 47.4% 감소). Periodate는 당의 구조에서 인접한 hydroxyl기를 갖는 탄소와 탄소 사이를 산화시키는 특성을 갖는다고 보고되 고 있으므로 (Goldstein et al., 1965) 황기 지상부 조다당 획 분이 장관면역 활성을 나타내는데 있어 중요하게 관여하는 물 질이 당류일 가능성을 높게 해주고 있으며, 결과적으로 periodate 처리에 의한 산화에 따라 황기 지상부 조다당 획분 의 장관면역 활성이 감소한 것은 황기 지상부에 포함되어진 장관면역 활성 다당체의 다당류의 당 구조가 파괴되어 활성이 감소된 것으로 생각된다. 반면, pronase 처리에 의한 장관면역 활성 감소의 변화가 periodate 산화와 비교하여 상대적으로 크 지 않았고 통계적으로도 유의한 수준이 아니었다 (시료농도 100µg/ml, AMA-0 활성의 10.5% 감소). 이러한 결과로 미루 어 황기 지상부 조다당 획분 AMA-0에 포함된 여러 물질 중 황기 지상부에서 장관면역 활성에 중요하게 관여하는 고분자 획분의 활성물질은 단백질보다는 다당체일 것으로 추정되며 이러한 활성물질을 밝히기 위하여 조다당 획분의 분리를 진행 하였다.

황기의 지상부로부터 얻어진 조다당 획분으로부터 총 6개의 다당성분을 분리하고 총당량, 분자량, 우론산 함량, 단백질 함 량, 산성당 함량을 검정한 결과는 Table 2와 같다.

황기 지상부로부터 분리된 6개의 다당체 중 AMA-1-a-PS1 의 분자량은 75,000 Da으로 당함량은 96.2%를 나타내었고 당 표준물질인 arabinose, mannnose, galactose, glucose의 mol 비가 1.4 : 1.3 : 2.6 : 1.0 (Ara :Man : Gal :Glc = 1.4 : 1.3 : 2.6 : 1.0)을 나타내었으며 산성당은 1.3% 단백질은 0.3%, 우론산 함량은 3.5%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분이었다.

DEAE-Sepharose FF의 0.115 M NaCl 용출액을 통하여 얻은 활성 획분인 AMA-1-b 분획에서 gel filtration chromatogrphay 를 행하여 얻은 2개의 획분 (AMA-1-b-PS2, AMA-1-b-PS3) 중 AMA-1-b-PS2의 분자량은 345000 Da, 당함량은 92.1%, 당표준 물질 당표준물질인 arabinose, mannnose, galactose, gucose의 mol 비가 0.5 : 1.1 : 1.1 : 1.0로 나타났고 산성당은 2.9%, 단백질 은 4.7%, 우론산 함량은 3.2%로 구성된 다당류가 주 구성성 분인 획분으로 확인되었다. AMA-1-b-PS3 획분은 모분획인 AMA-1-b로 부터 PS-2를 얻는 과정과 동일하게 적용하여 분자 량 87000 Da의 다당체 획분을 획득하였다, AMA-1-b-PS3는 당표준물질인 arabinose, galactose mol 비가 1.3 : 1로 나타났 고 산성당은 3.0%, 단백질은 4.6%, 우론산 함량은 3.6%로 구 성된 다당류가 주 구성성분으로 나타났다.

AMA-1-c-PS4의 분자량은 345000 Da, 당표준물질 arabinose, mannnose, galactose, glucose mol 비가 0.9 : 1.6 : 1.4 : 1로 나타 났고 산성당은 4.9%, 단백질은 5.2%, 우론산 함량은 3.3%로 구성된 다당류가 주 구성성분으로 확인되었다.

DEAE-Sepharose FF의 0.582 M NaCl 용출액을 통하여 얻은 활성 획분인 AMA-1-d 분획으로부터 gel filtration chromatogrphay를 행하여 얻은 2개의 획분 (AMA-1-d-PS5, AMA-1-d-PS6) 중 AMA-1-d-PS5의 분자량은 129000 Da, 당표준물질 arabinose, galactose, glalacturonic acid mol 비가 1.0 : 1.0: 1.0로 나타났고 산성당은 28.4%, 단백질은 2.4%, 우 론산 함량은 25.0%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분으 로 나타났다. AMA-1-d-PS6 획분은 모분획인 AMA-1-b로 부터 PS-5를 얻는 과정과 동일하게 적용하여 분자량 88000 Da의 PS-6를 획득하였다. AMA-1-d-PS6의 galactose, galacturonic acid mol 비는 5.0:1.0으로 나타났고 산성당은 61.7%, 단백질은 2.6%, 우론산 함량은 43.2%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분으로 나타났다.

골수는 다양한 면역세포들이 유래하고 성숙하는 장소이며 면역계의 백혈구를 포함한 적혈구, 혈소판 등 혈액 내 대부분 의 세포들은 궁극적으로 골수 내 조혈모세포 (hematopoietic stem cell) 라는 동일한 전구세포에서 생성되어 진식을 순환하 며 각종 생체반응을 유도하기 때문에 골수세포의 증식은 면역 계에서 매우 중요하다고 할 수 있으며 (Charles et al., 1994) 황기 지상부로부터 분리된 6종류의 다당체에 대하여 골수세포 증식효과를 통해 면역 증강 활성을 검정하여 본 결과 다당체 6개 모두 50µg/ml의 농도 이상에서 골수세포 증식효과를 나 타내었으며 특히 DEAE-Sepharose FF의 0.115 M NaCl 용출 액을 통하여 얻은 활성 획분인 AMA-1-b 분획에서 Sephacryl S-200 (1.7 × 82cm)의 gel filtration chromatogrphay를 통하여 분리된 AMA-1-b-PS2 (100µg/ml 처리 시, 대조군에 2.42배) 와 DEAE-Sepharose FF의 0.582 M NaCl 용출액을 통하여 얻은 활성 획분인 AMA-1-d 분획으로부터 Sepharose CL-6B column chromatography과 Sephacryl S-300 (2.6 × 90cm)를 이용한 gel filtration chromatogrphay를 수행하여 분리된 2개의 획분, AMA-1-d-PS5 (100µg/ml 처리 시, 대조군에 1.98배)과 AMA-1-d-PS6 (100µg/ml 처리 시, 대조군에 2.26배)에서 높 은 활성을 나타내었다 (Fig. 1).

AMA-1-b-PS2 다당체는 총당 92.1%와 산성당 3.9%, 단백 질 4.7%로 구성되어있으며 중성당으로는 arabinose, mannnose, galactose, glucose mol 비가 0.5 : 1.1 : 1.1 : 1.0로 포함되었고, glucuronic acid와 galacturonic acid로 구성된 산성당이 2.9% 로 구성되어 중성당이 주 구성물질인 반면 AMA-1-d-PS5과 AMA-1-d-PS6는 총당이 각각 72.6%, 54.1%, 단백질이 2.4, 2.6%, 우론산 함량이 25.3, 43.2로 구성되어 있고 산성당이 28.4, 61.7%로 구성되어 주로 산성당이 활성에 관여하는 물질 로서 함유되어진 다당체인 것으로 추정된다.

AMA-1-b-PS2 다당체가 분리된 모분획 AMA-1-b의 경우 arabinose와 galactose의 중성당이 주 구성당으로 구성되어 있 었고 (자료 미제시) 골수세포 증식능이 가장 높았던 AMA-1- b-PS2와 동일한 모분획으로 분리된 AMA-1-b-PS3의 경우 backbone 및 framework에 galactosyl residue와 arabinosyl residue가 풍부하게 존재하는 특정 polysaccharide일 것으로 생 각된다. 자연계에는 이러한 galactosyl residue와 arabinosyl residue가 풍부하게 존재하는 다당체로서 arabinogalactan과 단 백질의 복합체가 존재하는데 (Bacic et al., 1996) 식물에서 이들은 세포의 정체성 (cell identity) 이나 세포와 세포 신호 전달 (cell-to-cell signaling), 세포의 증식 (cell proliferation), 체세포배 형성 (somatic embryogenesis) 및 화분관 생장 (pollen tube growth) 등의 생리적 기능을 수행하는 것으로 알 려져 있다 (Kreuger and Holst, 1996). 뿐만 아니라 일당귀의 뿌리로부터 분리된 arabino-3-6-galactan이 고전적 경로 (classical pathway) 및 부경로 (alternative pathway) 모두에서 보체계를 활성화시킨다고 보고하였으며 (Yamada et al., 1985) lack wood에서 분리한 arabinogalactan의 경우 NK (natural killer) 세포를 활성화 시키거나 macrophage에서 세포활성화 cytokinie인 TNF-α의 생성을 촉진시키는 기능이 있다고 보고 (Kelly, 1999) 하고 있어 황기 지상부로부터 분리된 AMA-1- b-PS2 다당체는 식물의 arabinogalactan backbone을 가지고 있는 면역증강 활성 다당체로서 활용할 수 있을 것으로 생각 된다.

AMA-1-d 분획으로부터 분리된 2개의 다당체, AMA-1-d- PS5와 AMA-1-d-PS6의 경우 galacturonic acid가 각각 24.9, 58.6%의 수준으로 함유되어 있고 산성의 복합 다당류로 분류 되어 질 수 있으며 arbinose와 galactose의 비율이 다른 중성 다의 비율보다 높게 나타나 galactosyl residue와 arabinosyl residue가 비교적 풍부하게 존재하는 다당체로 높은 골수세포 증식효능 및 면역증강 효과를 나타내는 것으로 생각되어진다. 이러한 결과는 계피나무의 어린 가지인 계지 (桂枝)에서 분리 한 보체계 활성화 다당체가 산성당이 중심이 된 산성 복합다 당으로 비환원말단의 galctopyranose와 glucopyranose가 확인 되었고 직접적인 보체계 증식과 면역능 증대에 이러한 산성 복합 다당성분이 작용한다고 한 보고 (Ra et al., 1997)와 유 사하였으며 병풀 (Centella asiatica)로부터 분리된 수용성의 산성 복합다당이 T세포와 B세포를 활성화 시켜 면역능을 증 가시킬 수 있다는 결과 (Wang et al., 2005)와도 유사하였다.

골수세포 증식에 관계된 활성소재의 평가에 있어 골수세포 의 증식이 직접적인 시료와 반응에서 기인된 것인지, 장관면 역계를 통한 증식활성인지를 구분하여 평가하는 것이 중요하 다고 할 수 있다. 황기 지상부로부터 분리된 6개의 다당체를 대상으로 장관면역 활성을 peyer’s patch를 매개로 하는 기작 을 이용하는 지를 동시에 확인할 수 있는 활성 측정방법을 통 하여 비교하였다. 그 결과, AMA-1-b-PS2에서 peyer’s patch 를 매개로 한 기작을 통하여 가장 높은 활성 (시료농도 10µg/ml, 대조군의 11배, 시료농도 50µg/ml 이상의 경우, 대 조군의 60배)을 나타내었으므로 AMA-1-b-PS2의 경우 직접적 으로 다당체가 골수세포의 증식에 직접적으로 영향을 미칠 뿐 만 아니라 peyer’s patch의 세포를 자극하고 활성화 시켜 세 포로 하여금 cytokine 및 lymphokine류의 생산을 증대시킴으 로 골수세포 증식에 영향을 미칠 수도 있음을 나타내었다 (Fig. 2). 반면 AMA-1-c-PS4 의 경우, 상기 기술한 바와 같 이 직접적인 골수세포에 미치는 영향은 크지 않으나 peyer’s patch를 매개로 하는 골수세포 증식비율이 시료농도 10µg/ml 에서는 대조군의 11배, 시료농도 50µg/ml 이상의 경우, 대조 군의 45배로 높게 나타났기 때문에 장관면역의 활성기작이 직 접적으로 활성획분이 골수세포의 증식에 영향을 미치는 것이 아닌 장관점막림프조직 peyer’s patch의 세포만을 경유하여 골 수세포 증식에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다 (Fig. F2). 반면 산성당 함량이 높게 나타난 AMA-1-d-PS5과 AMA-1- d-PS6의 경우에서는 peyer’s patch를 매개로 하는 기작을 이 용하지 않고 직접적인 골수세포증식효과를 나타내는 것으로 생각되어진다.

이러한 결과는 GALT의 peyer’s patch에 존재하는 림프구는 장간막 림프절 (mesenteric lymph nodes)를 통하여 이동하고 체순환계 (systemic circulation)를 통해 말초 림프절, 신장 (spleen), 및 다른 장점막 부위에 도달하여 작용하기 때문에 장 관면역시스템은 점막면역 뿐만 아니라 전신면역계 (systemic immune system)을 조절하는 역할을 수행한다고 알려져 있고 창출 (Atractylodes lancea DC.)의 뿌리에서 분리한 다당체인 arabino-3,6-galactan (ALR5IIa-1-1)이 그 구조적 특성에 의하 여 peyer’s patch를 경유하여 장관면역을 조절할 수 있는 능력 을 가지게 되며 대부분의 전통적으로 질병 치료를 위해 경구 투여로 사용하는 생약재 및 한약재는 이러한 장관면역시스템 을 경유하여 임상적 효과를 나타낼 수 있다고 보고 (Yu et al., 2001) 되어지고 있으므로 황기 지상부의 경구투여는 그들 이 가지고 있는 다당체에 의해 peyer’s patch를 경유하는 장관 면역시스템을 활성화 하여 점막면역 뿐만 아니라 진신면역 면 역증강에 효과를 나타낼 수 있을 것으로 생각된다.

황기 지상부 다당체 중 peyer’s patch를 매개로 하는 골수 세포증식 기작이 예상되어지는 AMA-1-b-PS2와 AMA-1-c- PS4의 경우 단백질 함량은 매우 낮았고, 중성당을 주 구성당 으로서 하고 있으며 arabinose와, galactose 간의 교호적인 결 합으로 이루어진 주쇄에 다양한 종류의 중성당이 측쇄로 결합 되어 있는 형태의 갈락탄 계통의 다당류일 것으로 추정되나, 보다 확실한 활성 획분의 구조를 밝히기 위한 구조분석이 필 요할 것으로 생각된다.

Cytokine은 면역세포에서 분비되는 용해성 단백질로 자신이 나 타 세포의 특성과 작용을 변화시킬 수 있는 활성물질이며 면역세포에서 분비되는 각종 cytokine은 타 면역세포의 기능 조절과 신호전달에 중요한 열활을 하며 면역세포 상호간에 복 합한 cytokine network를 형성하여 전체 면역계 반응과 효휼 화에 공헌한다고 알려져 있고 (Charles et al., 1994). 한약재 로부터 추출한 면역 활성성분에 의해 peyer's patch의 T cell 을 활성화 시켜 IL-6 및 GM-CSF와 같은 조혈계 세포의 성 숙 및 분화에 필요한 cytokine을 생산함으로써 골수세포를 증 식시킨다는 연구결과 (Hong et al., 1998)에 근거하여 황기 지상부에서 분리된 다당체의 장관면역 활성을 통한 전신 면역 계 활성 증대에 대한 가능성 예측과 골수세포 증식 활성의 원 인을 구명하기 위하여 6종의 황기 지상부 기원의 다당체 처리 에 따른 장관 peyer’s patch 면역담당세포에서 interlekin-6 (IL-6) 등의 골수세포증식촉진인자의 생성 촉진 여부를 검정하 였다. 그 결과 peyer’s patch를 매개로 하는 골수세포증식 효 과를 나타내었던 AMA-1-b-PS2와 AMA-1-c-PS4 처리구에서 IL-6의 세포증식 촉진인자를 높은 수준으로 생성하였다. AMA- 1-b-PS2의 경우, IL-6의 생성 증대비율은 대조군에 비하여 시 료농도 100µg/ml 처리 시 약 3.5배, AMA-1-c-PS4의 경우 시료농도 100µg/ml 처리 시 대조군에 비해 4.2배를 나타낸 반면 골수세포 증식에 있어 직접처리 효과를 나타내었던 AMA-1-d-PS5과 AMA-1-d-PS6는 IL-6의 생성증대에 크게 영 향을 미치지 못하였다 (Fig. 3). 이러한 것은 황기 지상부 다 당체인 AMA-1-b-PS2 및 AMA-1-c-PS4와 반응시킨 peyer’s patch 배양 상등액이 높은 골수세포 증식능력을 보인 결과가 황기 지상부 다당체와 반응한 peyer’s patch 세포에서 골수세 포의 증식을 유도하는 cytokine인 IL-6의 분비가 증대되었음을 의미하는 것으로서 황기 지상부 다당체 AMA-1-b-PS2 및 AMA-1-c-PS4는 장관면역계 peyer’s patch로부터 IL-6 등의 hematopoietic growth factor로서의 cytokine류의 분비를 촉진 한다고 할 수 있겠다.

Peyer’s patch를 매개로 하는 림프구 활성 측정에서 AMA- 1-b-PS2가 AMA-1-c-PS4 보다 높은 활성을 나타낸 반면 세포 증식촉진인자 중 IL-6의 생성에 있어서는 AMA-1-c-PS4가 AMA-1-b-PS2 보다 더 높은 효과를 나타내었다. 이러한 결과 는 peyer’s patch가 T세포와 B세포로 구성되어 있고 특히, T 세포는 IL-6 등의 cytokine에 중요한 공급원으로 알려져 있는 사실을 고려하여 볼 때 AMA-1-b-PS2 보다는 AMA-1-c-PS4 가 T 세포의 활성화에 더 특이적인 효능을 나타내는 것으로 생각되고 반대로 AMA-1-b-PS2의 경우 다른 IL-6 이외에 다 른 세포증식촉진인자를 활성화 및 T 세포 이외의 다른 면역 세포의 활성화를 통한 골수세포 증식효과가 기대되어진다.

뿐만 아니라 interlekin-6 (IL-6)와 같은 cytokine류의 분비 는 순환계 면역세포에서도 중요한 역할을 수행하기 때문에 (Lotz et al., 1988) 황기 지상부 다당체 처리에 의한 장관 peyer's patch의 활성화는 골수세포 증식 유도 뿐만 아니라 이들 cytokine이 전신을 순환하며 타 면역세포를 자극하여 결국 전신면역계의 활성화를 유도할 수 있을것으로 생각되어 진다.