본 시험에 이용한 지치 종자는 제천의 재배농가에서 증식되 고 있던 식물체를 2012년에 채종하고, 이후 실외 보관 중이던 종자를 2013년 2월 27일에 분양받아 재배하면서 수분수정후 등숙 시기가 진전됨에 따라 종피색이 갈색에서 흰색으로 되므 로 종피색을 갈색과 흰색으로 나누고 종피색별 종자의 성숙 정도를 구분하여 시험재료로 사용하였다.

지치 종자의 저장방법에 따른 종자 발아력을 검증하기 위하 여 스티로폼 박스 (가로 ×세로 ×높이: 257 × 257 × 270㎜)에 종자를 저장 하였다. 저장온도를 4℃와 25℃의 2가지 조건으 로 하였으며, 4℃는 냉장고, 25℃는 생장조절실을 이용하여 온 도를 유지하였다. 종자의 저장기간은 2월 27일부터 저장하여 155일후인 7월 29일에 1차 실험을 진행하였고, 이후 15일 간 격으로 총 5회 발아시험을 진행 하였다.

발아 시험은 저장된 지치 종자를 식물생장조절제와 프라이 밍 처리를 1일 한 후 실험을 진행하였다. 식물생장조절제 처 리는 GA₃과 Kinetin을 각각 0, 25, 50, 100 ppm 농도별로 처리를 하고, 프라이밍 처리는 Poly Ethylene Glycol (PEG) 6000과 KNO₃처리를 하였는데, PEG 6000은 각각 0, −0.5, −1.0, −2.0㎫ 농도별로 처리를 하였고, KNO₃은 각 각 0, 50, 100, 200 mM 농도별로 처리를 하였다. 식물생장조 절제와 프라이밍 처리된 종자는 1% NaOCI 용액에 10분간 소독한 다음 멸균수로 5분씩 3회 세척한 후 사용하였으며, 9㎝ petri-dish에 탈지면을 깔고 멸균수를 5㎖ 첨가한 다음 종자를 치상하였다. 지치 종자의 발아 온도는 25℃로 유지되 었고, 조사기간 중 종자가 건조되지 않도록 수분을 보충하였 다. 각 처리별 발아 시험은 25립씩 4반복으로 수행되었으며, 발아율과 평균 발아일수는 치상 직후부터 치상 후 30일까지 지치의 유근이 1㎜ 이상 자란 개체수를 조사하여 측정하였다.

발아 시험 이후 발아된 종자와 발아되지 않은 종자를 구분 하여 냉동 보관한 후 냉동 보관된 시료 0.5 g을 액화질소를 이용하여 곱게 마쇄한 후, protein extraction buffer(50 mM Tris-HCl, 5% SDS, 1 mM PMSF, 1㎛ pepstatin, 0.01% bathophenonthroline; pH 8.0)를 1㎖를 첨가하여 얼음 위에서 1시간 정도 균질화한 후, 14,000 rpm에서 10분간 2회 원심 분 리하여 상등액을 취하고, 상등액으로 수용성 단백질을 분석하 였다.

SDS-PAGE는 소형전기영동장치 (Dual gel vertical unit, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 실시하였고, 전기 영동시 gel은 15%의 running gel (30% acryl/bis-acryl, 1.5 M Tris-HCl/pH 8.8, 10% SDS, TEMED, 10% ammoniumpersulfate)과 5% stacking gel (30% acryl/bisacryl, 1 MTris-HCl/pH 6.8, 10% SDS, TEMED, 10% ammoniumpersulfate)이며, running buffer (0.192 M glycine, 25 mM Tris/HCl, 0.1% SDS)는 pH 8.3을 맞추어 사용하였다. Sample buffer로 laemmlie buffer (4% SDS, 20% glycine, 10% 2-mercaptoethanol, 0.004% bromophenol blue, 125 mM Tris HCl; pH 6.8)을 사용하여 위에서 준비한 시료 와 1 : 1로 혼합하여 끊는 물에서 5분간 진탕한 후에 전기영동 을 실시하였다. 각각의 well당 loading량은 step-view 10 Kd size marker (prestained, elpls biotech)는 7㎕, sample은 80㎍을 넣었다. 전기영동시 전압은 80㎃로 평균 5시간하였 으며, 전기영동이 끝난 후 gel은 Coomassie brilliant R250법 을 이용하여 염색을 하였다. 염색용액 (0.001% Brilliant R250, 45% methanol, 10% acetic acid, 45% DW)을 사용 하여 12시간 정도 염색과정을 거친 후 탈색용액 (40% methanol, 10% acetic acid, 50% DW)을 1시간씩 2 ~ 3회 정도 탈색한 후 단백질 밴드의 발현 양상을 비교하였다.

조사한 발아율, 평균발아일수는 SAS (Statistical Analysis System) software package (SAS 9.1.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 통계분석 하였다.

지치 종자를 수확 후 종자 등숙 정도와 무게에 따라 종피색 을 구분하여 백립중을 비교한 결과는 Fig. 1과 같다. 종피색에 따른 지치 종자의 백립중은 갈색종자는 0.81 g이었고 흰색 종 자는 1.17 g으로 갈색종자보다 흰색종자가 0.36 g 정도 더 무 거운 것으로 나타났다. 지치의 경우 개화와 수분 수정 후 종 자 등숙이 이루어지는 시기가 더 진전 될수록 종피색이 갈색 에서 흰색으로 변화되는 것으로 조사 되었는데, 지치 종자가 등숙 과정이 진전되면서 배유가 충실하여 백립중이 증가하고 종피색이 갈색에서 흰색으로 변화된 것들이 품질이 좋고 건전 한 종자들인 것으로 조사되었다.

Fig. 1.  Comparison on the weight of one hundred seed and the color of seed coat in seeds of Lithospermum erythrorhizon.

지치 종자들의 종피색, 저장온도 및 저장 기간별로 구분하 여 발아율을 조사한 결과는 Fig. 2와 같다. 지치 종자의 종피 색에 의한 발아율은 등숙이 잘된 흰색 종자가 미등숙 갈색 종 자보다 모두 높게 나타났다. 흰색 종자와 갈색종자의 발아율 차이는 3.05 ~ 5.75%로 저장기간이나 저장 조건에 따라 다르 게 측정 되었지만, 모두 흰색 종자가 높게 측정 되었다. 지치 종자의 채종 후 저장 기간을 달리하여 발아율을 조사한 결과 는 저장 기간이 길어질수록 발아율은 낮아지는 경향을 보였으 며, 저장온도 4℃와 25℃에서 큰 차이를 보이지 않았다. 벼 종자의 경우 종자 발아율은 저장기간이 길어짐에 따라 낮아졌 는데, 이는 알카리 붕괴도와 단백질 함량의 감소, 당의 함량변 화 등 종자내의 이화학적 성분이 변화함으로써 종자 발아율을 감소하는 것이라고 보고하였다 (Kim et al., 2007). 지치 종자 도 채종 후 저장기간이 경과할수록 발아율이 계속 낮아지는 것은 벼와 발아율이 낮아지는 면에서 비슷하였으며, 종자 등숙 정도로 나타나는 종피색이 발아율에 크게 영향을 미쳐 수분 수정후 채종시기를 적절히 맞추는 것이 중요한 것으로 판단 된다.

Fig. 2.  Comparison on germination rates of Lithospermum erythrorhizon seed with two different colors of seed coat and with different temperatures and durations of seed storage.

지치 종자에 GA₃와 Kinetin 식물생장조절제 처리를 하여 발아율을 조사한 결과는 Fig. 3과 같다. 식물생장조절제 GA₃ 와 Kinetin의 농도를 4개 수준으로 다르게 처리하여 발아율을 비교한 결과 대조구와 비교할 때 발아율을 높게 해주는 효과 를 나타냈다. GA₃의 경우 25 ppm 수준에서도 발아율을 뚜렷 하게 향상시키며, 농도가 높아질수록 발아율이 높아지는 경향 을 보였다. Kinetin처리에서도 농도가 높아질수록 발아율이 높 아지는 경향을 보였는데, GA₃와는 달리 25 ppm에서 100 ppm 처리 수준까지 일정한 효과를 보이며 발아율이 증가하여 Kinetin 100 ppm 수준에서 가장 높게 나타나 Kinetin 수준을 더 높이면 발아율이 더 증가할 수 있는 것으로 판단된다. 지 치 종자의 채취 후 저장기간별로 GA₃와 Kinetin효과를 비교 해 보면 두 식물생장조절제 모두 발아율 향상에 좋은 효과가 있었으며, 저장 기간이 길어질수록 그 효과는 감소되는 것으 로 나타났다. 또한 GA₃ 처리에서는 25 ppm 수준으로 처리하 여도 발아율에 좋은 효과가 나타났다. 이는 Kim 등 (1997)에 따르면 초피나무 종자의 경우 GA₃은 침지 시간과 농도가 높 을수록 발아율이 높아지는 경향 이였고, Kinetin도 발아율은 양호하였으나 GA₃보다 낮은 발아율을 보였다는 결과와 유사 한 결과이나 본 연구에서는 GA₃은 25 ppm 수준에 큰 효과가 있다는 결과와 Kinetin에서는 100 ppm 수준까지 처리 농도가 높을수록 발아율이 증가되는 결과와 다르게 나타나 초피나무 와 지치 종자의 GA₃와 Kinetin에 대한 반응이 약간 다름을 알 수 있었다.

Fig. 3.  Comparison on germination rates of Lithospermum erythrorhizon seed treated with two different plant growth regulators and five different durations of seed storage.

지치 종자에 종자 프라이밍 처리를 하여 발아율을 비교한 결과는 Fig. 4와 같다. 종자 프라이밍 처리는 PEG6000과 KNO₃의 4개 수준으로 농도를 각각 다르게 처리하여 발아율 을 비교한 결과 PEG6000과 KNO₃ 모두 대조구와 비교하였을 때 발아율이 높았으며 PEG6000은 농도가 높아질수록 발아율 이 높아지는 경향을 보였고, KNO₃은 100 mM 농도까지는 발 아율이 높아졌으나 200 mM에서는 오히려 낮아지는 것으로 나 타났다. PEG6000처리는 지치종자의 저장기간별 발아율 차이 를 보였는데, 저장 170일까지는 처리 농도가 높을수록 발아율 이 증가되었으나 185일 이후에는 처리 수준별 차이가 뚜렷하 지 않았다. KNO₃의 경우에도 저장기간별 효과는 PEG6000과 비슷하였는데, 저장기간 170일까지는 가장 높은 농도인 KNO₃ 200 mM 농도까지 발아율이 증가했고, 저장기간 185일 이후에 는 KNO₃ 200 mM농도에서 발아율이 감소했기 때문에 저장기 간에 따른 발아율 효과는 약간 다르게 나타났다.

Fig. 4.  Comparison on germination rates of Lithospermum erythrorhizon seed treated with two different seed primings and five different durations of seed storage.

수분수정후 등숙 정도에 따라 종피색이 다른 흰색과 갈색의 지치 종자를 저장기간과 온도를 달리하여 저장한 후 식물생장 조절제와 종자 프라이밍 처리를 하여 평균발아일수를 비교한 결과는 Table 1과 같다. 종피색에 따른 평균발아일수는 GA₃와 PEG6000처리구에서는 고도의 유의성을 보였으며, KNO₃처리 구에서는 유의성을 보이지 않았고, 흰색 종자의 평균발아일수 는 갈색 보다 1 ~ 2일정도 더 빠르게 나타났다. 저장기간에 따 른 평균발아일수는 종자 처리구 모두에서 고도의 유의성을 보 였으며, 저장 기간이 길수록 평균발아일수가 큰 차이는 아니 지만 길어지는 것으로 나타냈다. 저장 온도별 지치 종자의 평 균발아일수는 모든 처리구에서 유의성을 나타내지 않았으며, 뚜렷한 경향도 없었다.

지치 종자의 발아율 향상을 위한 실험결과를 요약하면 채종 의 경우 종자 품질과 직접적으로 관련되어 종피색이 흰색일 때 채종하는 것이 발아율 향상에 효과적이며, 저장온도별로는 4℃ 저장보다 25℃ 저장이 약간 높은 발아율이 나타나 저장 온도 조건에 따른 차이는 크지 않았다. 저장 기간은 길어질수 록 발아율이 낮아지므로 채종 후 다년간 저장하여 파종하는 것보다 채종 당해에 파종하는 것이 발아율을 높일 수 있는 것 으로 나타났다. 식물생장조절제 처리를 할 경우 다른 작물들 과 달리 지치는 Kinetin처리보다 GA₃처리를 하게 되면 낮은 농도에서도 발아율이 높아지고 100 ppm까지는 농도가 높을수 록 발아율도 높아지며, 프라이밍 처리를 할 경우 KNO₃ 처리 보다 PEG6000을 처리할 경우 농도가 높아질수록 발아율도 높 아졌다.

지치 종자의 종피색, 저장온도 및 저장기간에 따라 발아된 종자와 발아 전 종자의 SDS-PAGE를 이용한 단백질 발현 양 상을 조사 분석한 결과는 Fig. 5와 같다. 발아 전 종자와 발 아된 종자 사이의 단백질 발현 양상은 분리된 전 분자량에서 차이를 보였는데, 특히 20 ~ 30 kDa에서 발아된 종자가 발아 전 종자보다 더 많은 단백질 밴드가 나타났고, 같은 위치에서 4℃와 25℃는 발현 양상이 크게 차이가 나지 않지만 흰색 종 자와 갈색 종자에서는 흰색 종자에서 더 많은 단백질 밴드가 나타나 등숙 정도가 좋고 발아력이 왕성한 종자에서 단백질 발현이 더 다양함을 알 수 있었다. 저장 기간에 따른 단백질 발현 양상은 저장 기간이 길어질수록 단백질 밴드가 더 희미 하고 밴드수가 적게 나타나 저장기간이 길어질수록 발아율이 낮아지는 경향과 일치하는 것으로 판단된다.

Fig. 5.  Protein expression patterns of Lithospermum erythrorhizon seed in both seeds before germination and after germination with different colors of seed coat, two different storage temperatures and five different storage durations by SDS-PAGE.

[A] Protein expression with different storage temperatures and seed coat colors. [B] Protein expression with different storage durations. (BG: Before Germination, AG: After Germination, CG: Condition of germination, ST: Storage temperature, SCC: Seed coat color, M: Maker).

지치 종자의 식물생장조절제와 종자 프라이밍 처리에 따른 발아 전 종자와 발아 후 종자의 SDS-PAGE를 이용한 단백질 발현 양상을 조사 분석한 결과는 Fig. 6과 같다. 발아 전 종 자와 발아된 종자 사이의 단백질 발현 양상은 종자의 종피색 과 저장기간에 따라 나타났던 단백질 발현 양상과 비슷한 결 과로 나타났으며, 식물생장조절제 GA₃과 Kinetin 처리간의 단 백질 발현 양상은 GA₃처리가 Kinetin 처리보다 단백질 밴드 가 더 선명하고 밴드의 수가 다양한 것으로 나타나 지치 종자 의 발아율이 좀 더 효과적이었던 GA₃처리구에서 단백질 발현 이 더 뚜렷하고 다양함을 알 수 있었다. 종자 프라이밍 PEG6000과 KNO₃처리간의 단백질 발현 양상도 발아 종자에 서 발아 전 종자보다 밴드의 수와 밴드색이 진하게 나타나 발 아과정에서 단백질 발현이 많이 일어남을 알 수 있으며, 단백 질의 발현 정도가 지치 종자의 발아율에도 영향을 미치는 것 으로 판단된다. 지치 종자의 충실도와 발아율과 관련하여 저 장 온도 그리고 생장조절제와 프라이밍처리에 따라 단백질 발 현 차이가 나타나 이에 대한 연구는 앞으로 더 구체적으로 이 루어져야 할 것으로 사료된다.

Fig. 6.  Protein expression patterns on white seed of Lithospermum erythrorhizon in both seeds before germination and after germination with two different plant growth regulators and seed primings by SDS-PAGE.

(BG: Before Germination, AG: After Germination, CG: condition of germination, GR&SP: Plant growth regulator and seed priming, M: Maker).