인삼은 두릅나무과 식물인 Panax ginseng C. A. Meyer의 뿌리로서 한국에서 재배되는 인삼은 해외에서 생산되는 인삼 들보다 품질 및 약효가 뛰어난 것으로 인지되어 동서양에서 주로 약재로 널리 사용되어 왔다 (Jo et al., 2014; Kim and Lee, 2011; Park et al., 2007). 그러나 국내에서 인삼은 일반 식품 또는 건강기능식품으로도 널리 소비되고 있다. 인삼의 지 상부는 꽃, 열매, 잎, 줄기로 지하부는 뇌두, 주근, 지근, 세근 으로 이루어져 있으며, 뇌두를 제거한 주근과 지근을 주로 약 용이나 식용으로 많이 사용하고 있으나 (Kim and Lee, 2011), 근피 비율이 높아서 무게단위당 사포닌 함량이 높은 세 근도 많이 이용되고 있는데, 세근에서 사포닌 함량이 높은 것 은 사포닌 성분이 주로 근피에 많이 분포하기 때문으로 알려 져 있다. 최근에는 인삼 열매 또는 잎에서도 특이 사포닌을 분리하여 이용하는 제품이 소개되고 있으며, 열매나 잎도 식 품 원료로 인정되고 있기 때문에 점차 인삼 열매나 잎의 소비 도 증가할 전망이다.

인삼의 효능으로는 항산화 및 항균작용, 항암 작용, 항당뇨 작용, 항스트레스 작용, 면역력 증대, 항피로 작용, 간기능 회 복 및 항진 작용, 신경세포보호, 조혈작용, 신경세포보호, 당과 콜레스테롤 흡수 억제 및 체내 지방대사 촉진, 혈압조절 등의 활성이 보고되었다 (Jo et al., 2011; Kim et al., 2010; Kim and Lee, 2011). 주요 성분으로는 인삼 사포닌인 ginsenoside 성분을 비롯하여 polyacetylene, 산성다당체, 인삼 단백질, 유 리당, 알카로이드, 페놀성분, 지방산, 정유성분 등이 알려져 있 으며, 그 이외에 비타민, 무기질 같은 영양성분들이 보고되어 있다 (Jo et al., 2011, 2014; Park et al., 2007). 인삼의 ginsenoside 성분은 다른 식물 사포닌과 달리 과량 투여에 의 한 독성이 없으며, 동맥경화 예방, 간기능 촉진, 함암작용, 항 산화 및 항당뇨 작용, 두뇌활동 촉진 등의 활성을 나타낸다 (Kim and Lee, 2011; Tark et al., 2009). 지금까지 약 66종 의 ginsenoside가 발견되었으며 고려인삼 (Panax ginseng)에서 38종 (홍삼 31종, 백삼 25종), 미국삼 (Panax quinquefolius L.)에서 19종, 삼칠삼 (Panax notoginseng Burkill)에서 29종 의 ginsenoside 화학 구조가 밝혀졌다 (Kim et al., 2014). 건강기능식품 전체 생산량의 약 절반을 차지할 정도로 인삼에 대한 관심과 소비가 지속되고 국외 인지도가 높은 만큼 새로 운 ginsenoside 분리, 구조분석 및 효능에 대한 연구는 지속적 으로 활발히 진행되고 있다.

인삼의 품질관리 기준은 제도적으로 현재 ⌈인삼 산업법⌋ 의 시행규칙에 인삼 성분의 검사를 위해 진세노사이드 Rb1과 Rg1 성분에 대한 함량기준이 설정되어 있고, 진세노사이드 성 분의 검사방법은 식품의약품안전처장이 고시한 ⌈건강기능식 품의 기준 및 규격⌋ 및 국가기술표준원장이 고시한⌈한국산 업표준 (KS)⌋의 ‘건조인삼’ 시험방법을 준용하는 것으로 국 립농산물품질관리원에서 고시하고 있다.⌈ 한국산업표준 (KS)⌋ 에 제시된 HPLC에 의한 진세노사이드 성분 분석시간은 90분 으로 다양한 ginsenoside를 동시 분석 가능하고,⌈건강기능식 품의 기준 및 규격⌋에서 제시하고 있는 HPLC 분석시간은 70분으로 ginsenoside Rb1과 Rg1의 함량만 정량하도록 되어 있는데 이 두 분석법들은 모두 분석시간이 너무 길다는 단점 이 있다. 또한 HPLC 분석을 위한 진세노사이드의 효율적인 추출 방법이 매우 중요한데 (Kim et al., 2008), ⌈한국산업표 준 (KS)⌋와⌈건강기능식품의 기준 및 규격⌋에서 사용되고 있는 추출법은 시료와 용매의 양이 많이 필요하며 특히 건강 기능식품의 기준 및 규격에서는 환류추출 방법을 사용하여 실 험 시간이 길며 실험하는 과정이 복잡하다. 따라서 본 연구에 서는 짧은 시간 안에 다양한 ginsenoside의 분리능이 양호한 분석법을 확립하고, 동시에 기존의 공정서에 제시한 추출방법 과 비교하여 인삼의 주요성분인 ginsenoside를 보다 더 효율적 으로 추출할 수 있는 새로운 방법을 제시하고자 하였다.

인삼의 주요 ginsenoside 성분을 정량하기 위한 새로운 HPLC 조건을 설정하기 위해, 50°C에서 Halo^® RP-Amide (4.6 × 150㎜, 2.7㎛, DE, USA) 컬럼을 사용하여 acetonitrile과 H₂O 혼합용매로 기울기 용리하여 Fig. 1에서와 같이 ginsenoside Re, Rg1, Rf, Rb1, Rg2, Rh1, Rc, Rb2, Rb3, Rd의 분리능이 양호한 분석조건을 확립하였다. KS에서 소개한 기존 ginsenoside 분석법에는 주요 진세노사이드 성분 인 ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1를 C18 컬럼을 사용하여 90분 동안 분석하는 조건 을 제시하고 있으며, 건강기능성식품의 기준 및 규격의 분석 법에는 분석시간 70분 동안 ginsenoside Rb1, Rg1, Rg3의 함량만을 정량하도록 분석 조건이 제시되어 있다. Hong 등 (2009)은 KS와 건강기능식품의 기준 및 규격에서 제시된 분 석법을 비교하여 새로운 신속분석 방법을 제시하였는데, 약 50 분의 분석시간을 제시하였다. 그 외에도 Jia 등 (2013)은 Gemini 5 ㎛ C18 column (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛)과 LCCAD를 사용하여 78분, Li 등 (2010)은 ProntoSIL CN (4.6 × 250㎜) column, HPLC-ELSD로 130분, Lee 등 (2012)은 HPLC-UV와 YMC-Pack ODS AM (4.6 × 250㎜, 5㎛) 컬럼을 사용하여 68분, Shin (2010)은 HPLC-UV, μ- Bondapak^™ C18 column (3.9 × 300㎜, 10㎛) 컬럼 조건에서 90분간 분석하는 조건을 보고한 바 있다. 반면에, 이번에 새롭 게 제안한 HPLC 분석법은 Halo^® RP-Amide 컬럼을 이용하 여 35분 이내에 10개 ginsenoside 성분 (ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1) 정량 분석이 가능하였다. 즉, 새롭게 제안한 HPLC 분석법은 KS와 건강기 능식품의 기준 및 규격에서 제시한 기존 분석법들 보다 분석 시간이 짧고 다양한 ginsenoside 성분의 정성 및 정량 분석이 가능한 방법이었다.

Fig. 1.  HPLC profiles of ginsenosides.

1; ginsenoside Re, 2; ginsenoside Rg1, 3; ginsenoside Rf, 4; ginsenoside Rb1, 5; ginsenoside Rg2, 6; ginsenoside Rh1, 7; ginsenoside Rc, 8; ginsenoside Rb2, 9; ginsenoside Rb3, 10; ginsenoside Rd.

새롭게 제안한 HPLC 분석법의 분석 조건을 validation 하 기 위해, 2.5 - 80 ng • ㎕^–1 농도 범위내에서 HPLC 분석하여 회귀식과 상관계수를 각각 구하였다. 이때 ginsenoside Re, Rg1, Rf, Rb1, Rg2, Rh1, Rc, Rb2, Rb3, Rd 성분의 회귀 식은 Table 1에 나타내었으며, 상관계수 (r²) 값이 각각 0.9989, 0.9994, 0.9997, 0.9998, 0.9999, 0.9997, 0.9996, 0.9998, 0.9997, 0.9997로서 넓은 농도 범위에서 높은 선형성 을 나타내었다. 인삼 ginsenoside Re, Rg1, Rf, Rb1, Rg2, Rh1, Rc, Rb2, Rb3, Rd 성분의 S/N비에 의한 검출한계 (LOD)는 각각 3.37, 3.10, 3.27, 3.71, 3.09, 2.41, 3.33, 3.32, 3.52, 2.86 ng • ㎕^–1이었고, 정량한계농도 (LOQ)는 각각 5.57, 4.75, 6.17, 8.32, 5.79, 3.95, 7.42, 7.42, 8.02, 6.48 ng • ㎕^–1로 측정되어 (Table 1), 실질적인 백삼 시료에 함 유한 주요 10종의 ginsenoside 성분의 정량분석을 위한 적용 에는 문제가 없었다.

Ginsenoside Rb1, Rg1를 비롯한 총 10종의 ginsenoside 동 시분석법인 새롭게 제안한 HPLC 분석법의 재현성을 검토하 기 위해 각 성분에 대한 3종의 농도조건을 하루 동안 5회 분 석 (intra-day) 및 5일 동안 반복 분석 (inter-day)으로 정밀도 (precision) 및 정확도 (accuracy)는 각각 상대표준오차 값과 회수율로서 구하여 Table 2에 나타내었다. Intra-day 정밀도는 5.09 - 7.59% 범위였으며, 정확도는 96.40 - 102.48% 범위를 나 타내었다. 또한 inter-day 정밀도와 정확도는 각각 0.36 - 2.11%, 93.58 - 05.64 범위로 측정되었다 (Table 2). Intra-day 와 inter-day 결과는 주어진 농도 범위 내에서 약 15%를 벗 어나지 않는 정확성을 보여주었다. Park 등 (2013)은 UPLCPDA 시스템으로 홍삼분말, 홍삼 농축액, 홍삼 발효추출물 등 에서 ginsenoside Ro 성분을 비롯한 총 30종의 ginsenoside 성분을 동시 분석하는 분석법을 제시하였는데, LOD, LOQ 값 은 각각 0.04 - 1.91, 0.43 - 6.37㎎• ℓ^–1로서 본 연구의 분석 법보다는 저농도까지 검출이 가능하였으나, 회수율은 89 -118% 로서 본 연구의 분석법보다는 정확도와 정밀도가 다소 떨어지 는 경향이었다. HPLC 분석법 validation 결과는 새로운 HPLC 분석법이 인삼의 주요 ginsenoside 성분의 정량 분석에 적합하고 재현성이 우수한 방법임을 입증하였다. 따라서 새로 운 HPLC 분석법을 이용한 인삼의 주요 ginsenoside 성분의 분석을 통해 인삼 사포닌 추출법, method A, B, C를 비교하 여 새롭게 개선된 추출조건을 제시하는데 활용하였다.

기존 공정서상의 추출법인 KS 추출법 및 건강기능식품의 기준 및 규격의 추출법에 기초한 각각의 시료 추출 및 전처리 법 method B, C는 1 g의 시료와 10㎖의 용매를 사용하여 인삼시료를 추출하였는데, 새로운 시료 추출 및 전처리법인 method A는 0.2 g의 시료와 2㎖의 추출용매를 사용하였다. Method A는 method B와 같은 초음파 추출법을 사용하여 추 출을 하였지만 초음파 추출시 온도를 50°C로 설정해 주었다는 차이가 있으며, method C 방법보다는 추출방법이 간단하다. Hou 등 (2010)은 초음파 추출을 비롯하여, 초고압추출, 가속 용매추출, 전자파 추출, 환류추출, 펄스전기장 추출 방법별 인 삼의 ginsenoside 성분 함량을 비교 분석하였는데, 이때 전기 장 추출과 초고압 추출에서 가장 함량이 높았다. 그러나, 전기 장 추출의 경우는 분석 시료량과 용매가 많이 소요되는 단점 이 있었다. 초고압 추출의 경우는 고가의 초고압 추출장비가 필요한 점을 고려할 때, 비교적 간편한 초음파 추출이 품질분 석을 위한 소량 시료 추출방법으로는 적합할 것으로 판단된다. 선행연구에서 추출 용매 및 조건별 인삼의 ginsenoside 성분의 추출효율을 비교하여 초음파추출 효율성에 대해 보고하였는데 (Kim et al., 2008), 이는 본 연구의 추출 조건 확립에 바탕 이 되었다. Method A와 기존 공정서상의 추출법에 기초한 method B, C를 이용하여 백삼시료 2종 (white ginseng 1, 2) 을 추출한 후 ginsenoside를 새로운 HPLC 방법으로 분석한 결과, white ginseng 1에서 각각 추출물의 분리능은 Fig. 2와 같았으며, white ginseng 1, 2의 ginsenoside 함량은 Fig. 3과 같았다. White ginseng 1, 2를 method A 방법으로 추출한 결 과, 각각 ginsenoside Rg1은 0.274 ± 0.003, 0.271 ± 0.0102%, Rb1은 0.283 ± 0.004, 0.252 ± 0.011%를 나타내었고, method B 방법으로 추출한 결과, 각각 ginsenoside Rg1은 0.276 ± 0.004, 0.252 ± 0.010%, Rb1은 0.229 ± 0.008, 0.163 ±0.005%를 나 타내었으며, method C 방법으로 추출한 경우는 각각 ginsenoside Rg1은 0.245 ± 0.004, 0.248 ± 0.002%, Rb1은 0.257 ± 0.003, 0.244 ± 0.005%를 나타내었다. 즉, method A 방법이 기존 추출 및 전처리법 method B, C와 비교하여, ginsenoside Rb1, Rg1 두 성분 함량이 유의성 있게 높거나 비슷한 경향을 나타내었다. 특히, white ginseng 2 시료의 경 우는 method B 방법에 의해서만 ginsenoside Rb1의 함량이 인삼 산업법에서 정한 인삼 성분 검사기준인 0.20%에 미달되 었는데, 이것은 method A, C 방법이 추출시 가온조건이 들어 가는 것에 반해 method B 방법은 가온조건 없이 초음파 추 출을 하기 때문에 추출효율이 상대적으로 떨어지는 것에 기인 하는 것으로 해석되었다. 또한, 추출단계의 가온조건은 malonylginsenoside Rb1의 분해를 촉진하여 ginsenoside Rb1의 함량을 증가시킬 수 있음을 추정할 수 있었다 (Choi et al., 2010).

Fig. 2.  HPLC profiles of ginsenosides from white ginseng 1 by different extraction.

A; method A extraction, B; method B extraction, C; method C extraction. 1; ginsenoside Re, 2; ginsenoside Rg1, 3; ginsenoside Rf, 4; ginsenoside Rb1, 5; ginsenoside Rg2, 6; ginsenoside Rc, 7; ginsenoside Rb2, 8; ginsenoside Rb3, 9; ginsenoside Rd.

Fig. 3.  Contents of ginsenoside compounds in the extracts from ginseng radix by different extraction conditions.

I; white ginseng 1, II; white ginseng 2, A; method A, B; method B, C; method C. All values are means ± SD (n = 3). Means with different letter (a - c) within same compound are significantly different at p < 0.05.

Method A, B, C 방법으로 추출된 추출물의 total ginsenoside 의 함량 값은 Table 3에 나타내었다. White ginseng 1, 2의 total ginsenoside의 함량은 method A 방법로 추출시 각각 1.187 ± 0.006%, 1.133 ± 0.037%, method B 방법으로 추출시 각각 1.078 ± 0.028%, 0.943 ± 0.027%, method C 방법으로 추출시 각각 1.056 ± 0.014%, 1.054 ± 0.017%를 나타내었는데, white ginseng 1, 2 시료 모두 method A 방법을 적용한 것 이 다른 두 추출, 전처리 방법을 적용한 것보다 유의성 있게 높은 함량을 보였다.

이상의 결과들로부터, 새롭게 확립된 새로운 HPLC 분석방 법이 기존의 KS 또는 건강기능식품의 기준 및 규격과 같은 공 정서에서 제시하는 ginsenoside 분석방법과 비교하여 ginsenoside 를 보다 신속하게 분석, 정량 할 수 있는 분석방법이었으며, 또 한 새로운 가온 초음파 추출법은 두 공정서에 제시한 추출법 보 다 ginsenoside 추출효율이 증진되어 ginsenoside 함량이 유의성 있게 높거나 비슷한 경향을 나타내었다. 더욱이 새로운 추출 방법은 시료와 용매의 양을 절감할 수 있고 실험 방법이 간단 하여 높은 재현성을 기대할 수 있을 뿐 아니라 분석시간을 단 축할 수 있는 장점이 있는 것으로 판단되었다. 현재 인삼 산 업법에 근거하여, 인삼 (백삼)의 품질검사를 위한 지표성분으 로 ginsenoside Rb1, Rg1의 함량기준이 각각 0.20, 0.10%로 설정되어 있는데, 한 때 ginsenoside Rb1의 함량 기준이 미달 되는 제품이 많아 ginsenoside 함량 기준의 개선에 대한 논란 이 제기되기도 하였다. 그러나, ginsenoside Rb1, Rg1의 함량 0.20, 0.10% 이상의 기준은 대한약전 뿐 아니라 일본 등 외국 의 약전에도 적용되는 보편적인 기준으로, 이 기준보다 더 낮 은 함량으로 인삼 성분 검사기준을 적용시 국내 인삼의 품질 관리 기준이 하향 조정되기 때문에 품질관리가 허술해질 수 있다는 우려가 있다. 본 연구결과는 동일한 인삼 시료일지라 도 추출방법에 따라서 ginsenoside Rb1의 함량이 인삼 성분 검사기준에 미달되는 사례가 있을 수 있음을 시사하고 있다. Ginsenoside 성분 추출에는 최소한 50°C 이상의 가온 조건을 추가하여 ginsenoside 성분의 추출효율을 증진시키는 과정이 매우 중요함을 알 수 있었다. 즉, 현재 인삼 성분 검사시 추 출방법으로 사용되는 방법 중에서, KS 추출방법 보다는 건강 기능식품의 기준 및 규격에서 제시하는 인삼 추출방법이 더 적절하다고 판단되어진다. 또한, 새롭게 제안된 가온 초음파 추출법도 ginsenoside 함량이 건강기능식품의 기준 및 규격의 방법보다 떨어지지 않고, 분석 시간도 더 단축되고 실험과정 이 간편한 것을 고려하면 매우 효율적인 시료 추출법이라고 판단되었다.

본 연구에서 확립된 새로운 인삼 추출법과 새로운 HPLC 분석법은 백삼 뿐 아니라 다양한 인삼의 품질관리를 위한 ginsenoside 성분검사 방법으로서 매우 효율적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.