본 실험에서 사용한 지유 (Sanguisorba officinalis L.)는 2013년 화림제약에서 건조된 것을 구입하여 4℃ 이하로 냉장 보관하며 실험에 사용하였다. 표품은 동신대학교 생물자원산 업화지원센터에 확인하여 보관하며 사용하였다.

건조된 지유를 마쇄한 후 추출 용매를 methanol (MeOH)로 하여 80℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 (BUCHI, Flawil, Switzerland) 및 동결 건조 (Sam Won Industry, Seoul, Korea)를 실시하여 분말화 하였고 추출물의 수율은 19.33%이었다. 추출물 중 일부를 증 류수에 분산시킨 후 순차적으로 chloroform, ethylacetate, n-butanol을 사용하여 용매분획을 실시하였으며, 획득된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험 에 사용하였다. 분획수율은 chloroform 분획물 (CF) 6.19%, ethylacetate 분획물 (EF) 34.10%, n-butanol 분획물 (BF) 26.44%, aqueous 분획물 (AF) 28.71%로 나타났다.

Folin-Denis법을 이용하여 지유 추출물 및 분획물의 polyphenol 함량을 측정하였다 (Folin and Denis, 1912). 시료 액 (1㎎/㎖ in MeOH) 80㎕와 Folin-Denis reagent (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) 80㎕를 혼합한 후 3분간 방 치한 후 10% Na2CO3 80㎕를 혼합하여 암실에서 1시간 동 안 반응시켰다. 그 후 원심분리하여 상등액 120 ㎕를 취하 여 96 well plate에 옮겨 microplate reader (BIO-TEK, Winooski, VT, USA)를 사용하여 700㎚에서 흡광도를 측정 하였다. 표준물질로 chlorogenic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 표준 검량선을 작성하고 총 polyphenol 함량을 ㎎/g로 나타내었다.

Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 flavonoid 함량을 다 음과 같이 측정하였다. 시료액 (1㎎/㎖ in MeOH) 100㎕, 10% aluminium nitrate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 20㎕, 1M potassium acetate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 20㎕를 가하여 잘 혼합한 후 MeOH 860㎕를 첨가하여 40분간 반응시킨 후 415㎚에서 흡광도를 측정하였다. 자연적으로 존재하는 대부분의 flavonoid는 대부 분 배당체로 존재하기 때문에 (Peterson and Dwyer, 1998) 가장 흔하게 존재하는 flavonoid glycoside인 rutin (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 표준 검량선을 작 성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.

지유 추출물과 분획물의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 radical 소거능을 측정하였다 (Blois, 1958). MeOH을 이용해 시료를 0.8 - 100㎍/㎖ 의 농도로 용 해시킨 시료액 20㎕와 MeOH에 200 μM로 용해시킨 DPPH 용액 180㎕를 혼합한 후 암실에서 15분간 반응시켜 517㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 바탕으로 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC₅₀)를 계산하였으 며, positive control로 L-ascorbic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.

Marcocci 등 (1994)의 방법을 변형하여 nitric oxide (NO) 소거능을 다음과 같이 측정하였다. 증류수에 용해시킨 시료액 30㎕와 10 mM sodium nitroferricyanide (III) dihydrate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 50㎕를 혼합하여 25 ℃에서 150분 동안 반응시켰다. 그 다음 1% sulfanilamide (in 30% acetic acid, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 60㎕를 넣고 5분 후에 0.1% N-(naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride (in 60% acetic acid, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 60㎕를 혼합하여 30분간 실온에서 반응시 킨 후 520㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 증류수 를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다. 대 조군으로 L-ascorbic acid를 사용하였다.

식중독 원인균을 대상으로 지유 추출물과 분획물을 disc diffusion assay를 이용하여 항균활성을 측정하였다. 항균활성 측정을 위해 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분 양받은 미생물 균주인 Staphylococcus aureus (KCTC3881), Bacillus cereus (KCTC1012), Vibrio vulnificus (KCTC 2959)를 사용하였으며, S. aureus와 B. cereus 균주는 Nutrient agar 및 broth (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하였고, V. vulnificus 균주는 Heart Infusion (HI) agar 및 broth (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하였다. 항균시험 용 평판배지는 10⁷- 10⁸CFU/㎖로 희석한 배양액을 100㎕씩 분주한 후 멸균 면봉으로 도말하였다. 직경 6㎜의 paper disc 에 시료를 disc당 0.5, 1.0, 0.5㎎이 되도록 천천히 흡수시켜 용매를 완전히 휘발시킨 후 평판배지에 밀착시킨 상태로 37℃ 에서 24시간 배양하였다. disc를 중심으로 생성된 저해환 (clear zone, ㎜)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.

모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준 편차 (means ± SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS (Statistical pakage for social science, version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이 용하였다. 각 군 간의 측정치 비교는 One-way analysis of variance (ANOVA)를 시행한 후 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의성을 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.

페놀성 화합물은 항산화 활성이나 항암 활성 등 다양한 생 리활성에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Manach et al., 2005). 한편, 플라보노이드는 2개의 벤젠핵 (A 및 B환)과 3개 의 탄소로 이루어진 C₆-C₃-C₆의 화합물로써 세포손상을 초래 하는 free radical을 없애주는 항산화 활성을 비롯하여 항암, 항균 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다 (Dewick, 2002). 지유 (Sanguisorba officinalis L.) 추출물과 분획물의 polyphenol과 flavonoid 함량을 측정한 결과를 Table 1에 제시하였다. 지유 추출물의 총 phenol성 화합물 함량은 337.91㎎/g으로 나타났다. 분획물의 경우 EF와 BF가 각각 538.93㎎/g, 433.30㎎/g으로 추출물보다 높은 함량을 보였다. Flavonoid 함량도 이와 유사한 양상으로 EF와 BF의 flavonoid 함량이 각각 23.16㎎/g, 14.87㎎/g으로 추출물과 다른 분획물보다 높게 나타났다.

추출물과 분획물의 DPPH radical 소거 활성을 SC₅₀ 값으로 환산하면, 추출물은 6.86㎍/㎖의 값을 가졌으며, EF가 3.85㎍/㎖로 가장 높은 활성을 보였다. 이러한 결과를 양성대 조군으로 사용된 L-ascorbic acid에 대한 상대적 활성으로 비 교하면 CF를 제외한 모든 분획물이 L-ascorbic acid에 비해 높은 활성을 나타내었으며, 특히 EF의 경우 양성 대조군보다 약 2.5배 높은 활성을 나타내었다 (Table 2). Kim 등 (2013) 이 보고한 소리쟁이 70% ethanol 추출물의 EtOAc 분획물이 L-ascorbic acid보다 2배정도 높은 활성을 보여준 것과 유사한 결과이다. 또한 DPPH radical 소거능과 같은 항산화 활성이 polyphenol 화합물의 함량과 연관관계가 있음을 확인할 수 있 었다 (An et al., 2014; Song and Lee, 2015).

여러 조직과 세포들에서 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 합성되는 nitric oxide (NO)는 혈관확 장, 신경전달, 혈액응고, 면역기능 조절 등의 역할을 하는 것 으로 알려져 있다 (Bryan, 1982). 그러나 과량으로 생성된 NO는 치매 및 파킨슨 질환과 같은 퇴행성 신경질환, 조직 및 기관 손상, 동맥경화 등을 유발하는 등 양면성을 지닌 생체 분자로 여겨진다 (Cirino et al., 2006). 지유 추출물 및 분획 물을 6, 30, 150㎍/㎖의 농도로 조제하여 NO 소거능을 측정 한 결과, 150㎍/㎖의 농도에서 모든 분획물과 추출물이 양성 대조군인 L-ascorbic acid보다 높은 활성을 보였다. 특히 EF는 30㎍/㎖와 150㎍/㎖의 농도 차이에 의한 활성의 차이가 거 의 없어 경제적인 활용 지표를 산출할 수 있었다 (Fig. 1). 항 산화 효과가 뛰어나다고 알려진 흑마늘 분획물과 NO 소거능 을 비교한 결과 (Shin et al., 2010) 시료를 150㎍/㎖의 농 도로 처리하였을 때, 흑마늘과 지유의 EF가 각각 85.99%, 87.75%의 유사한 소거 활성을 나타냄으로써 천연 항산화 물 질로의 활용가능성을 확인할 수 있었다.

Fig. 1  Nitric oxide scavenging abilities of methanol extract and its fractions from the root of Sanguisorba officinalis L.

Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. *Means within a column followed by the same letter are not significant based on the DMRT (p < 0.05). MS; Methanol extract of Sanguisorba officinalis L., CF; Chloroform fraction, EF; Ethylacetate fraction, BF; n- Butanol fraction, AF; Aqueous fraction, AA; Lascorbic acid was used as a positive control.

해마다 국내외적으로 발병률이 증가하는 추세에 있는 식중 독은 오염된 음식물을 섭취함으로써 발생되는 구토, 설사, 복 통 등의 증세를 동반한 임상 증후군이다 (Oldfield, 2001). 이 러한 식중독의 원인균으로는 Salmonella spp, Escherichia coli, Staphylococcus aures, Bacillus cereus, Shigella spp, Vibrio spp 등이 있다 (Song et al., 2009). 식중독 원인균으 로 알려진 그람 양성균인 S. aureus와 B. cereus, 그리고 그 람 음성균 V. vulnificus 세 가지 균주로 항균실험을 한 결과 를 Table 3에 나타내었다. S. aureus의 경우 추출물, BF, AF 는 실험을 실시한 모든 농도에서 생육 저해환을 형성하지 못 했으나 B. cereus의 경우 3㎎/disc로 시료를 처리하였을 때 모든 시료에서 9.17 - 16.85㎜의 생육 저해환을 형성하였다. 지유 ethanol 추출물을 3㎎/disc로 처리하였을 때 12.70㎜의 생육 저해환을 형성하였다는 보고가 있는데 (Kim et al., 2011), methanol 추출물은 11.32㎜의 생육 저해환을 형성함 으로서 ethanol 추출물보다 항균활성이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 반면 그람 음성균인 V. vulnificus에서는 저농도인 0.5㎎/disc로 시료를 처리하였을 때 모든 시료에서 생육 저해 환을 형성함으로써 지유의 추출물 및 분획물이 그람 양성균보 다 그람 음성균에서 높은 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 시료를 3 ㎎/disc로 처리하였을 때, 그람 양성균인 S. aureus와 B. cereus의 경우 EF가 각각 13.67㎜, 16.85㎜ 의 생육 저해환을 형성하면서 가장 높은 활성을 나타내었고, 그람 음성균인 V. vulnificus에서는 CF가 20.00㎜의 생육 저 해환을 형성함으로써 가장 높은 활성을 보여주었다.

이상의 결과에서, 지유 MeOH 추출물의 EF가 상대적으로 높은 polyphenol 함량을 바탕으로 높은 DPPH radical과 NO 소거 활성을 가지는 것으로 확인되었으며, 식중독 원인균에 대 한 항균활성을 측정한 결과 그람 양성군인 S. aureus와 B. cereus의 경우 EF가 가장 높은 활성을 나타낸 반면 그람 음성 균인 V. vulnificus에서는 CF가 가장 높은 활성을 보여줌으로 써 항균활성을 가지는 기능성 소재로서의 개발이 가능할 것으 로 판단되었다.