참당귀 (Angelica gigas)를 포함한 Angelica 속 식물 14종 을 수집하여 사용하였다 (Table 1). 수집된 Angelica 속 식물 중 참당귀는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 보유종인 ‘만추’ 를 사용하였고, 나머지 Angelica 속 식물은 미국의 종자회사인 Horizon Herbs (Williams, OR, USA) 와 유럽의 종자회사인 Plant World (Newton Abbot, England)에서 구입하여 사용하 였다. DNA 추출은 14종의 당귀 종자를 액체질소로 급랭시켜 막자사발을 이용하여 분말상태가 되도록 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)을 이용하여 제조사가 제시한 실험방법에 따라 DNA를 추출하 였다. 추출된 DNA는 Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 기기를 이용하여 농도를 측정하였다. 각각의 DNA 최종농도는 멸균된 증류수를 이용하여 5 ng/㎕ 로 조정하였다.

당귀의 엽록체 염기서열 확보를 위하여 앞서 추출한 참당 귀 DNA를 이용하였다. 염기서열 분석을 위해 Illumina paired-end 라이브러리를 제작한 후 Illumina HiSeq 2000 platform (Illumina, San Diego, CA, USA)을 이용하여 염 기서열을 얻었다. 생산된 염기서열은 CLC Genomics Workbench version 8.0. 프로그램을 통해 엽록체 DNA에 해당 하는 염기서열들을 수집하여 원형구조로 조립하였다. 참당귀 엽 록체 염기서열에서 SciRoKo version 3.4 software ( http:// kofler.or.at/bioinformatics/SciRoKo )를 이용하여 SSR 구간을 탐 색하였다 (Kofler et al., 2007).

Primer 3 프로그램을 이용하여 각 구간을 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머를 제작하였다. 프라이머 조건은 길이 18 - 25 bp, 온도는 48 - 60℃, G/C 비율 50% 이상으로 하였다. PCR 반응 액의 총 부피는 50㎕로서, 10 ng genomic DNA, 1 × Ex buffer, 1 μM primer, 0.2mM dNTPs, 그리고 0.5 unit Ex Taq DNA polymerase (Takara Bio, Otsu, Japan)로 반응하였다. PCR 반응은 C1000 Touch^™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하였다. PCR 조건은 95℃에서 5 분간 pre-denaturation한 후, 95℃ 서 45초, 55 - 60℃에서 45 초, 72℃에서 45초로 35 cycles로 수행하였고, final extention 과정은 72℃에서 10분간 반응시켰다. 증폭된 DNA 산물은 1.5% agarose gel에서 100 V로 전기영동한 후, Safe Gel Stain (Inclone, Seoul, Korea)로 염색하여 gel documentation system (Gel Doc^™ XR + System, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 PCR증폭 산물을 확인하였다.

당귀 속 유전자원에 대한 SSR 마커 다양성 분석은 DNA fragment 분석기법을 활용하였다. PCR 증폭된 산물을 DNA Fragment Analyzer Automated CE System (Advanced Analytical Technologies, Ankeny, IA, USA)으로 분석하였다. 분석시약은 dsDNA 905 Reagent kit (Geneer, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 각 마커에서 PCR 증폭산물의 유무에 따 라 ‘1’과 ‘0’으로 표시하여 매트릭스로 변환하였다. 추출한 RFU 값이 2,000 이하인 증폭산물은 제외하고 분석하였다. 분 석결과는 GeneMaker software (SoftGenetics, State College, PA, USA)를 이용하여 정리하였다. 수집된 14종의 당귀속 유전 자원 간 유연관계 분석은 NTSYS-pc 2.10 프로그램 (Exeter Software, Setauket, NY, USA)을 이용하여 수행하였다. 프로그 램 내 옵션을 SIMQUAL로 설정하여 수행하였고 UPGMA 알고리즘을 통해 도출된 데이터를 바탕으로 SHAN 클러스터 링을 거쳐 유전적 유연관계를 분석하였다.

참당귀 (Angelica gigas)의 엽록체 DNA 염기서열을 이용하 여 SciRoKo 분석 프로그램을 통하여 SSR 마커를 선발하였다 . 선발된 5개의 SSR 마커의 특성에 대해 Table 2에 정리하였 다. 본 연구에서 선발된 AGcpSSR1-AGcpSSR5는 모두 염기 서열 A와 T로 구성되어 있었다. SSR motif를 검토한 결과 mono-nucleotide motif는 존재하지 않았고 di-nucleotide motif 가 2개 (AGcpSSR2, AGcpSSR5), trtra-nucleotide motif 2개 (AGcpSSR1, AGcpSSR3), penta-nucleotide 1개 (AGcpSSR4) 로 분석되었다.

선발된 5개의 마커인 AGcpSSR1, AGcpSSR2, AGcpSSR3, AGcpSSR4 그리고 AGcpSSR5를 이용하여 PCR증폭하고 Fragment Analyzer^TM Automated CE system을 활용하여 각 유전자원별 5개체씩 분석하였다 (Fig. 1). 이 분석 시스템은 SSR분석을 위하여 형광 dye가 결합된 프라이머를 제작하고 증폭산물을 만들어 형광물질의 양을 측정하던 방법에 비해 실 험단계를 축소시킬 수 있으며 실험실 내에서 빠른 시간 내에 결과물을 작성 할 수 있다는 장점이 있었다.

Fig. 1  Electropherograms generated by the polymorphic SSR markers, (A); AGcpSSR2 and (B); AGcpSSR5, using fragment analyzer CE System in 14 Angelica species.

M; 1 - 500 bp size maker, 1; Angelica archangelica, 2; Angelica taiwaniana, 3; Angelica hispanica, 4; Angelica pachycarpa, 5; Angelica hendersonii, 6; Angelica arguta, 7; Angelica keiskei, 8; Angelica atropurpurea, 9; Angelica dahurica, 10; Angelica genuflexa, 11; Angelica tenuissima, 12; Angelica gigas, 13; Angelica acutiloba, 14; Angelica sinensis.

GeneMaker software를 이용하여 각각의 마커들에 PCR fragment analyzer 분석 결과를 Table 3에서 정리하였다. 각 마커별 주요 위치에서 증폭되는 allele이 나타나는 빈도수 (major allele frequency, MAF)를 분석한 결과 0.50이상의 값 을 가지는 마커는 AGcpSSR2와 AGcpSSR5였다. 그리고 다형 성을 보이는 마커에서 allele의 수 (N_A)를 분석한 결과 AGcpSSR1은 3개, AGcpSSR2는 10개, AGcpSSR3은 5개, AGcpSSR4는 3개, AGcpSSR5는 12개의 allele이 있는 것으 로 나타났다. 따라서 본 연구에서 개발된 당귀 엽록체 기반 SSR 마커에서는 총 33개의 allele이 출현하였고 평균적으로 6.6개의 allele이 나타나는 것으로 분석되었다.

Expected heterozygosity (H_E)는 예상이형접합도라고 하여 전체 개체 중에서 이형접합을 보일 것으로 예상되는 개체 의 비율을 뜻하는데 AGcpSSR5 > AGcpSSR2 > AGcpSSR3 > AGcpSSR1 > AGcpSSR4 순으로 분석되었다. 전체적인 H_E 분석값은 0.33에서 0.89를 나타냈다. 전체 샘플 중에서 PCR 분석되어 genotyping이 가능한 시료의 비율을 의미하는 number of observed (N_o)는 최저 51%에서 최대 70%로 평균 64.6%의 확률을 보였다. 분석한 샘플 중에서 이형접합성을 보 이는 샘플의 비율을 나타내는 oserved heterozygosity (H_O)값은 AGcpSSR5에서만 0.56으로 분석되었다. 다양성 요소인 polymorphism information content (PIC) 평균값은 0.59이며 0.31에서 0.88사이의 값을 나타냈는데 Kim 등 (2016)에 의하면 PIC값이 0.5이상이면 다형성 분석에 유익한 마커라고 보고된 바 있으며 보고된 연구결과에 따르면 인삼과 감초의 SSR마커에서 도 PIC값이 0.5이상인 마커에서 종 및 품종의 다형성 분석에 유익한 마커임을 증명한 바 있다 (Um et al., 2016a, b). 비록 AGcpSSR1과 AGcpSSR4의 PIC값이 0.31로 분석되었지만 본 연구에서 개발된 마커들을 이용하여 당귀 속 식물들의 유전적 다양성을 분석하기에 충분하였다.

각 마커들을 이용하여 나온 분석결과를 이용해 Fig. 2과 같 이 계통도를 작성하고 유연관계를 분석하였다. 그 결과 A. archangelica와 A. taiwaniana는 상관계수 값이 1을 나타내면서 본 연구에서 쓰인 마커로 분석하였을 때 유전적 다양성이 유사 하다는 결과를 얻을 수 있었다. 마찬가지로 A. hispanica 와 A. pachycarpa 또한 동일한 유전자 패턴을 가지는 것으로 나 타났다. 이와는 대조적으로 A. tenuissima의 경우 5개체 모두 다른 유전자형을 나타내며 가장 가까운 유전자형의 상관계수 가 0.938로 분석되었다.

Fig. 2  A UPGMA tree based on genetic distances analyzed using 5 polymorphic SSR markers in 14 of Angelica species.

국내에서 혼용되는 참당귀 (A. gigas), 중국당귀 (A. sinensis), 일당귀 (A. acutiloba)는 계통도 분석 결과 참당귀와 일당귀의 상관계수가 0.868, 이 두 그룹과 중국당귀의 상관계수는 0.792 로 나타났다. Liao 등 (2013)에 따르면 ITS 영역 염기서열 분 석을 통해 A. dahurica와 A. genuflexa와 A. gigas는 Angelica s.s. clade로 분류되었으며 A. keiskei는 littoral Angelica clade, A. arguta는 북아메리카 Angelica clade, A. acutiloba는 Archangelica, A. sinensis는 Sinodielsia clade로 분류하였다. 이처럼 참당귀와 중국당귀, 일당귀는 선행연구자들에 의해 유 전적 차이가 큰 것으로 입증되어 왔을 뿐만 아니라 본 연구 결과에서도 큰 차이가 있음을 확인 할 수 있었다.

엽록체에 관한 연구는 식물 유전체학에서 생물학적 진화분 야에서 주로 연구되어 왔다 (Palmer et al., 1988). 특히 엽록 체 DNA 정보를 이용하여 종간 생체시스템상의 문제들을 해 결하기 위해 주로 활용되어 왔다 (Olmstead and Palmer, 1994). 엽록체 DNA는 대부분 모본으로부터 다음 세대로 전해 지기 때문에 유전체 수준의 연구와는 다른 특성을 가진다고 하였다 (Corriveau and Coleman, 1988; Birky et al., 1989). 유전적 다양성의 원인은 교잡으로 인한 변이가 주된 요인으로 써 엽록체 DNA는 전체 유전체에 비해 오랜 시간이 걸리는 특성 때문에 세대가 거듭되어도 비교적 장기적으로 유지된다 는 장점이 있다 (Powell et al., 1995). 그렇기 때문에 선행연 구자들은 쑥류, 삼나무에서 엽록체 DNA 기반의 SSR 마커를 이용하여 연구결과를 보고하였다 (Liu et al., 2013; Hirao et al., 2009). 또한 엽록체의 DNA 염기서열을 바탕으로 개발된 마커를 이용하여 계통분리를 하는 경우 모본의 유전적 특성 에 따라 분류할 수 있다고 하였다 (Wheeler et al., 2014). 본 연구에서는 개발된 5개의 엽록체 DNA기반 당귀 SSR마 커를 이용하여 14종의 당귀 속 식물들의 유연관계를 분석하 였다. 이를 통하여 한약재 시장에서 유통되는 당귀 속 식물 의 혼 • 오용을 방지하고 이들에 대한 기원을 재정립할 수 있 으며 차후 당귀의 분자육종을 위한 선발마커로의 활용을 기 대하는 바이다.