실험에 사용된 지황 (Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel) 재료는 국립원예특작과학원 약용작물과 시험포장에서 2015년 4월 중순에 정식하고 그 다음해인 2016년 3월에 수확 한 11개의 품종과 지역적응시험 중인 2개 계통 (수원 1호, 수 원 9호)의 뿌리를 채취하여 사용하였다. 수확한 뿌리 중에 무 작위로 품종 당 각각 20개의 샘플을 채취하여 수세 후 동결건 조 한 다음 균질하게 분쇄하여 분석에 사용하였다.

Aucubin과 catalpol의 표준물질은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였으며, 분석방법은 Sertić 등 (2015)의 방법을 이용하였다.

검액은 MeOH 950㎕와 내부 표준물질로서 salidroside (50㎎/ℓ in MeOH) 50㎕ 혼합액에 건조 지황 10㎎을 용 해하여 초음파 추출한 후, 0.5㎛ syringe filter를 이용하여 여 과하였다. 분석은 Agilent 6120 LC-MS System (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)을 이용하였고, 컬 럼은 Develosil ODS-UG-5 (2 × 250㎜)을 사용했다. 컬럼 오 븐 온도는 25℃에서 0.2㎖/min의 flow rate로, 샘플은 5㎕을 분석기기에 주입해서 분석하였다. 이동상 용액에서의 A line 은 0.1% 포름산이 포함된 물을, B line은 아세토나이트릴을 이용하였다. 이동상 용매는 0 - 10 분에서의 A는 100%, 10 - 15 분에서의 A는 50%, 15 - 30 분에서의 A는 5%, 30 분에 서의 A는 100%로 용매를 흘려주어 분석을 실시하였다.

Aucubin과 catalpol 그리고 salidroside는 각각 390.10 m/z (-), 407.00 m/z (-), 299.10 m/z (-)의 분자량 값으로 분석되었 다. 지황에서 추출한 catalpol과 aucubin의 chromatogram은 Fig. 1과 같다. 정량분석을 위해서 표준물질을 5.00, 2.50, 1.25, 0.63, 0.31, 0.16, 0.08㎎/ℓ의 농도별로 메탄올에 녹인 후 LC-MS 분석을 실시했다. LOD (limit of detection)는 0.95㎍/ℓ 였으며, 표준물질의 농도별 분석을 실시하였으며 내부 표준물질 salidroside의 상대비로 검량선 식 (catalpol, y = 0.3500x + 0.0704, R² = 0.9976; aucubin, y = 0.4842x + 0.0618, R² = 0.9978)을 만들었고, 이 식을 이용해서 정량분석 을 실시했다.

Fig. 1. 

Selected ion chromatogram (A) and mass spectra (B, C) of catalpol and aucubin from R. glutinosa root.

표준물질은 GABA (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 구입하여 사용하였으며, 분석 방법은 Park 등 (2012) 의 방법을 이용하였다.

검액은 1㎖ solvent (MeOH : H₂O :CH₃Cl = 2.5 : 1 : 1) 와 내부표준물질로서 ribitol (200㎎/ℓ ribitol) 60㎕ 혼합액에 10㎎의 건조 지황을 용해하여 원심분리한 후, 상층액을 동 결 건조하여 농축하였다. GABA의 휘발성 유도체화를 위해 N–methyl–N-trimethylsilyltrifluoroacetamide와 methoxyamine hydrochloride를 첨가하고 trimethylsilyl (TMS) 유도체화 반 응을 수행하였다. 분석은 GCMS-QP2010 Ultra system (Shimadzu, Kyoto, Japan)을 이용하였고, 컬럼은 Rtx-5MS (30.0 m × 0.25㎛ × 0.25㎛)을 사용하였다. 샘플은 280℃로 1㎕를 분석기기에 주입하였고, 이동상 가스는 초고순도 헬륨 을 분당 1㎖씩 흘려주어 분석하였다. 컬럼 오븐은 100℃에서 4 분간의 등온 가열 후, 분당 10℃씩 승온 속도로 320℃까지 상승시키고 11 분의 유지 시간을 주어 분석하였다. 이온 소스 온도는 200℃에서, interface의 온도는 280℃에서 분석하였다. GABA의 이온은 304.10 m/z, 내부표준물질로 사용한 리비톨의 이온은 319.10 m/z로 분석하였다.

지황에서 추출한 GABA의 chromatogram은 Fig. 2와 같다. 정량분석을 위해서 표준물질의 농도별 5, 1, 0.1, 0.05㎍으로 분석을 실시하였으며 내부표준물질 리비톨의 상대비로 검량선 식 (y = 0.0575x + 0.0006, R² = 0.9999)을 만들었고, LOD (limit of detection)는 0.001 ng이었다.

Fig. 2. 

Extracted ion chromatogram (A) and mass spectrum (B) of GABA (15.701 min, 304.1 m/z) from R. glutinosa root.

실험결과는 SAS Enterprise Guide 4.2 (Statistical Analysis System 2009, SAS Institute Inc., Cray, NC, USA)로 분석 하였고, 3 반복한 결과 값을 평균치 ±표준편차 (Means ± SD) 로 나타내었다. 시료간의 유의적인 차이는 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의수준 5% (p < 0.05)에서 검증하 였다.

지황 (Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel)의 품종 별 aucubin 함량은 다강 >대경, 다황, 세강 >고려, 토강 >고 강 순으로 높았으며, 원강, 연강, 황강 등 5개 품종은 전혀 검 출되지 않았다. 특히 다강 품종의 aucubin의 함량은 0.10㎎/g 로 가장 낮은 품종인 고강에 비해 3 배나 많은 함량 차이를 보였다. Catalpol은 생지황 (Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel)의 지표성분으로 실험결과 모든 품종에서 12㎎/g 이상의 함량을 보였다. Catalpol 함량은 지황 1호가 가장 높았 으며 고강, 토강, 연강, 수원 1호는 낮은 함량을 보였다 (Table 1).

지황 품종의 catalpol 함량에 대한 선행 연구에 따르면 그 당시 신품종인 지황 1호, 고려, 고강의 경우 catalpol 함량이 85 - 144 ㎎/g 정도로 높게 나왔다고 보고되어 있으나 (You et al., 2011), 본 연구에서는 같은 품종이라도 12 - 17㎎/g 정도 로 선행 연구에 비해 낮게 나왔다. 그 이유는 선행연구와 수 확시기, 재배지, catalpol 분석 방법 등의 차이 때문으로 사료 된다.

Wang 등 (2016)이 보고한 바에 따르면 품종 마다 잎에서 aucubin과 catalpol의 함량 차이가 있다고 하였는데, 본 실험에 서는 뿌리를 이용하였으나 잎을 이용한 실험처럼 품종마다 aucubin과 catalpol 함량 차이가 있는 것으로 나타났다. 그러나 Wang 등 (2016)이 보고한 바에 따르면 베이징 1호 품종의 잎 에서 aucubin의 함량이 적어지면 catalpol의 함량이 많아지는 음의 상관관계를 보인다고 하였는데, 뿌리를 분석한 본 연구 에서는 그러한 경향이 나타나지 않았으며, aucubin이 검출되 지 않은 품종도 발견되었다. 또한 최근 지황 연구에서 사용된 수원 9호의 뿌리에서 aucubin이 검출되었는데 (Lee et al., 2017b), 본 실험에서는 aucubin이 검출되지 않았다.

약용작물 중에 단삼과 천속단에서 수확시기에 따라 함량변 이가 크다는 보고가 있었는데 (Kim et al., 2015a; An et al., 2016), 아마도 선행연구에서 샘플을 채취한 시기와 본 실 험에서 샘플을 채취한 시기가 달라서 그런 것으로 생각된다. 그 이유는 선행연구에서는 첫 수확기인 8월 말에 채취하였고, 본 실험은 해를 넘긴 3월 말로 수확 적기를 지났기 때문으로 사료된다. 또한 지상부의 유무가 aucubin의 검출 유무와도 연 관이 있을 것으로 사료되는데, 선행연구에서 수확한 시기인 8 월은 모든 샘플에 지상부인 잎이 다 자라있는 시기이나, 본 연구에서 수확한 3월 말은 잎이 없는 시기였기 때문이다.

인삼에서 ginsenoside의 경우 잎에서 합성된 ginsenoside가 뿌리로 이동할 수 있다는 연구결과가 보고되었는데 (Kim et al., 2015b), 지황에서도 이와 비슷하게 catalpol의 전구체인 aucubin (Jensen, 1991)이 잎에서 합성된 후 뿌리로 이동해서 검출된 것으로 생각되며, aucubin이 검출되지 않은 품종이 나 왔던 이유는 이동했던 aucubin이 겨울을 지나면서 catalpol로 의 생합성이 끝나 검출되지 않았을 것으로 생각된다.

지황에서 iridoid 배당체는 aucubin, catalpol, acetylcatalpol, dihydrocatalpol, leonuride 등 33 종류가 넘는 것으로 알려져 있고, 특히 catalpol은 가장 처음 보고된 물질로 약리학적으로 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Zhang et al., 2008). 지금까지 많은 연구결과는 catalpol을 중심으로 보고되 어 있으며, 상대적으로 그 전구체인 aucubin은 연구결과가 적 은 편이다. 최근에 지황과 같은 현삼과인 개불알풀속에서 aucubin 함량에 대한 연구가 보고된 바가 있으나 (Kroll- Møller et al., 2017), aucubin도 catalpol 연구처럼 아직까지는 약리학적인 연구가 대부분을 차지하고 있다. 또한 지황은 당 성분들이 다량 함유되어 있다고 보고되었다. 즉 단당류들인 glucose, galactose, fructose, mannito 2당류인 sucrose, 3당류 들인 raffinose, manninotriose, 4당류인 stachyose, 5당류인 verbascose, 다당류들인 rehmannan S, rehmannan 등이 보고 되었다 (Liu et al., 2013).

최근에 항염증, 항산화 작용이 있는 약용작물을 이용한 기 능성화장품 원료 개발 연구가 보고된 바가 많이 있고 (Kim et al., 2010, 2012; Gu et al., 2013), aucubin의 경우 항염 증, 항산화 작용이 있는 있으므로 지황도 기능성 화장품 원료 로 이용가능성이 있을 것으로 생각된다. Catalpol의 경우 혈당 강하 작용이 있어 당뇨병 치료제로 만들기 위한 연구가 많이 보고되고 있는 것으로 볼 때 (Huang et al., 2010; Bao et al., 2016; Zhu et al., 2016), 앞으로 기능성 식품 원료 및 제약 원료로도 이용가능성이 있을 것으로 생각된다.

GABA의 경우 모든 품종에서 함유하고 있었으며, 수원 1호 에서 가장 높은 함량을 보였다. 또한 가장 낮은 GABA 함량 을 보인 연강에 비해 수원 1호는 1.032㎎/g로 거의 40 배나 많은 함량 차이를 보였다 (Table 2).

Kim 등 (2013)에 의하면 약용작물인 황금의 뿌리에서도 GABA가 함유되어 있다고 하였고, Yang 등 (2014)이 보고한 삼칠삼에서도 GABA가 함유되어 있다고 하였다. 본 실험에서 도 삼칠삼과 황금처럼 지황의 뿌리에도 GABA가 함유되어 있 음을 알 수 있었다. 아직까지 지황 품종의 지하부에서 GABA 에 대한 연구가 없었기에 본 실험은 그 자체로 의의가 있다고 생각되나, 지상부의 GABA 함량 연구와 비교해 볼 때 (Lee et al., 2017b), 수원 1호를 제외하고는 지상부에 더 높은 함 량이 있어 GABA를 쓰기에는 지하부보다는 지상부가 더 적 절할 것으로 사료된다.

본 결과를 통하여 지황에 지표 성분인 catalpol 뿐만 아니라 아직까지 연구되지 않은 aucubin, GABA가 포함되어 있음을 알 수 있었고, 향후 지황이 식품원재료나 기능성식품 원료 등 용도의 다양화를 시도할 때 귀중한 기초자료가 될 것으로 생 각된다. 또한 지황의 각 품종에 대한 성분 분석 결과는 한약 재 용도가 아닌 다른 용도로 쓰일 수 있는 지황 품종 선발에 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다.