실험에 사용된 dopaol β-D-glucoside는 한라돌쩌귀 [Aconitum japonicum subsp. napiforme (H. Lév. & Vaniot) Kadota] 전초에서 분리된 천연분리물질이며 한약진흥재단 (National Development Institute of Korean Medicine, NIKOM) 천연물 물질은행 (NPBANK, Gyungsan, Korea)에 서 분양받아 사용하였다.

실험에 사용된 HK-2 세포 (human kidney proximal tubule cell)는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. PRMI 1640 배지 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에 10% FBS (fetal bovine serum)와 1% penicilin/ streptomycin을 첨가하여 사용하였고. 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

실험동물은 BALB/C mice 6 주령 수컷을 샘타코 (Samtako Inc., Osan, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 온도 20 ± 2℃, 습도 55 ± 5%, 12 시간 명암조건에서 사육하였다. 실험동물은 구입 후 1 주일 동안 순화한 다음, 각 군당 7 마리씩을 배치 하여 실험군을 분류하였다. 정상대조군, cisplatin 단독 투여군, cisplatin + dopaol β-D-glucoside 투여군으로 군을 분리하였다. 정상대조군을 제외한 모든 군에 20㎎/㎏ 용량의 cisplatin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 3 일 동안 24 시간 주기로 복강투여 하여 신장독성을 유발하였고, cisplatin 복강투여 30 분 후에 dopaol β-D-glucoside를 10㎎/㎏ 용량 으로 복강투여 하였다.

세포생존율은 CellTiter 96® aqueous one solution Cell proliferation assay kit (Promega Co., Madison, WI, USA) 를 사용하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라서 측정하였다. HK-2 세포를 96 well plate에 1 × 10⁵ cells/㎖ 농도가 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% 배양기에서 24 시간 배양한 후 dopaol β-D-glucoside를 각각 10, 20, 40 그리고 80 μM 농도로 24 시간 동안 처리하여 천연분리물질에 대한 자체 독성을 조사하 였고 이와 같은 농도로 1 시간 동안 전 처리한 뒤 20 μM cisplatin을 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 뒤 MTS 시약 20㎕를 넣고 2 시간 동안 배양한 후 microplate reader infinite® 200 PRO (TECAN, Mannedorf, Switzerland) 를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하였고, 세포생존율은 정상대조군에 대한 생존율로 표시하였다.

TUNEL 염색은 DeadEnd^™ fluorometric TUNEL system (Promega Co., Madison, WI, USA)을 사용하였으며, 제조사 의 프로토콜에 따라서 수행하였다. HK-2 세포를 12 well plate에서 cover slip 위에 2 × 10⁵ cells/㎖ 농도가 되도록 분주 한 뒤, 37℃, 5% 배양기에서 24 시간 배양했다. 배양된 세포 는 80㎕ dopaol β-D-glucoside를 1 시간 동안 전 처리 한 뒤 20 μM cisplatin을 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 10% neutralized buffered formalin (NBF)로 4℃에서 20 분 동안 고정하였고, phosphate buffered saline (PBS)로 2 번 씻어주었다. 다음 0.2% triton X-100 in PBS 용액으로 5 분간 투과화한 뒤 PBS로 2 번 씻어주었다. 남은 액체가 없도 록 모두 제거하고 equilibration buffer를 5 분간 처리하였으며 100㎕ rTdT incubation buffer를 처리하고 37℃에서 60 분 동안 배양하였다. 그 후 2X SSC buffer를 처리하고, PBS로 2 번 씻은 뒤 Prolong^™ gold antifade mountant with DAPI (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)로 마 운트하여 Epi-fluorescence microscope (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)하에 관찰하였다.

약물처리 후 배양이 끝난 HK-2 세포는 PBS로 세척한 뒤 Pierce^™ protease and phosphatase inhibitor mini tablets (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)가 포함 된 RIPA cell lysis buffer 2 (Enzo Life Science Inc., Farmingdale, NY, USA)로 1 시간 동안 용해하였다. 세포용해액 은 원심분리기로 4℃, 13,000 × g 조건에서 10 분간 원심분리 하였고, 단백질 농도를 Bradford assay를 이용하여 측정하였다. 총 1㎍의 단백질 샘플을 Wes (Protein simple, San Jose, CA, USA)를 이용해 단백질을 탐지하였으며 제조사에서 제공한 protocol을 사용하였고, 1 차 항체는 cell signaling technology (CST, Danvers, MA, USA) 제품인 MST-1 (#14946S), phospho-MST thr183 (#3681S), caspase-3 (#9662), GAPDH (8884S)를 사용하였다.

Caspase-3 colorimetric detection kit (Enzo Life Science Inc., Farmingdale, NY, USA)를 이용해 실험을 진행하였다. Western blot 분석 방법에서 사용된 동일한 방법으로 세포를 용해하였고 총 20㎍의 단백질 샘플을 사용하여 제조사가 제 시한 protocol에 따라 수행하였다.

Annxon V-FITC apoptosis detection kit (Enzo Life Science Inc., Farmingdale, NY, USA)을 사용하였다. HK-2 세포에 약물 처리 후 유도되는 apoptosis의 비율을 구분하기 위해 제조사의 protocol에 따라 annexin V-FITC와 propidium iodide (PI) 형광염료로 염색시켰으며, mitochondrial membrane potential (MMP)의 비율을 측정하기 위해 JC-1 Dye (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 실험 을 진행하였다. 각각 형광염료로 염색된 세포는 CytoFLEX (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA)를 이용하여 분석하 였다.

Cisplatin 투여에 의해 변화되는 호중구의 비율을 분석하기 위해 IDEXX ProCyte DX hematology analyzer (IDEXX, Westbrook, ME, USA)를 사용하였다. 실험은 제조사의 protocol에 따라 진행하였으며 마우스에서 채취한 전혈을 BD Vacutainer^™ glass blood collection tube with K₃ EDTA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에 담 아 사용하였다.

Cisplatin 투여에 의해 변화되는 blood urine nitrogen (BUN)과 creatinine (Cre)의 양을 분석하기 위해 FUJI DRICHEM 4000i (Fujifilm Co., Tokyo, Japan)를 사용하였다. 실 험은 제조사의 protocol에 따라 진행하였으며 마우스에서 채취 한 혈청을 이용해 분석하였다.

신장을 적출한 뒤 10% NBF에 고정하여, 조직처리 과정을 통해 파라핀으로 포매하였다. 포매가 끝난 조직은 5㎛ 두께로 절편을 제작하였으며, Dako Mayer’s hematoxylin (Agilent Technologies Inc., Santa clara, CA, USA)과 Eosin Y (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 이용해 염색한 뒤 광학현미경하에 관찰하였다.

통계처리는 평균 ± 표준편차 (means ± SD)로 나타내었고, 군 간의 유의성을 검정하기 위하여 SPSS (Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프 로그램을 사용하였다. 일원변량분석 (One-way ANOVA)을 실 시하였으며, 유의성이 있는 경우 p < 0.05 수준에서, Duncan's Multiple Range Test (DMRT)와 Tukey post-hoc test를 실시 하였다.

HK-2 세포에 대한 천연분리물질의 자체적인 세포독성과 cisplatin에 대한 세포보호효과를 확인하기 위해 MTS assay를 진행하였다. Dopaol을 농도별로 24 시간 동안 처리하였을 때, 세포독성은 나타나지 않았지만 40 μM 농도부터 비처리군에 비해 세포의 증식이 증가한 것으로 확인되었다 (Fig. 1A). 이 어서 dopaol을 농도별로 처리하고 20 μM cisplatin을 함께 처 리하였을 때, cisplatin 단독처리군은 비처리군에 비해 세포생 존율이 80.2 ± 3.0%로 감소하였으며 80 μM dopaol 처리군은 비처리군에 가깝게 회복되는 결과를 나타냈다 (Fig. 1B). 실험 결과를 종합하였을 때 dopaol은 HK-2 세포에 대해서 독성을 나타내지 않았다. 흥미롭게도 HK-2 세포의 증식을 증가시키 는 것으로 나타났으며 cisplatin 처리에 의한 세포독성도 80 μM 농도에서 차단되었다. Dopaol은 cisplatin으로 유도된 신장독성으로부터 농도 의존적으로 세포생존율을 회복시켜 신 장독성 보호 효과가 있음을 확인하였다.

Fig. 1  Dopaol β-D-glucoside prevents cisplatininduced cell death in HK-2 cells.

A; HK-2 cells were treated with dopaol β-D-glucoside for various concentration, B; after pretreatment with dopaol β-D-glucoside for various concentration, HK-2 cells were treated with 20 μM cisplatin for 24 h. Cell viability was measured by MTS assay. Means values ± SD from triplicate separated experiments are shown. *Means with difference letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s Multiple Range Test (DMRT).

하지만 dopaol 처리에 따른 HK-2 세포의 증식에 관련된 중요 인자들을 확인하기 위해 추가적인 실험이 필요하다고 생 각되며, cisplatin과 dopaol의 처리가 apoptosis와 necrosis 중 어느 기전에 영향을 미치는지 알지 못하기 때문에 다음 실험 을 진행하였다.

Dopaol이 cisplatin에 의해 유도된 세포사 중 apoptosis와 necrosis 둘 중 어느 기전을 억제하는지 알아보기 위해 몇 가 지 실험을 진행하였다. TUNEL 염색은 DNA 단편화 (DNA fragmentation)를 형광 표지를 통해 시각화하는 방법으로 염증 성 세포자멸사 (pyroptosis), 세포자멸사 (apoptosis) 및 세포괴 사 (necrosis)를 측정하는데 많이 이용된다. Cisplatin를 HK-2 세포에 20 μM 농도로 24 시간 동안 처리하였을 때 증가하는 TUNEL signal이 dopaol을 80 μM 농도로 함께 처리하였을 때 대부분 감소되는 결과가 나타났다 (Fig. 2A).

Fig. 2  Dopaol β-D-glucoside ameliorates cisplatin-induced apoptosis and mitochondrial dyfunction in HK-2 cells.

After pretreatment with 80 μM dopaol β-D-glucoside for 1 h, HK-2 cells were treated with 20 μM cisplatin for 24 h. A; HK-2 cell visualized by TUNEL assay, B; annexin V and propidium iodide staining, C; JC-1 staining were analyzed by flow cytometry. Representative images were taken from at least three independent experiments.

다음으로 apoptosis와 necrosis의 비율을 측정하기 위해 annexinV-PI 염색을 통해 flow cytometry에서 측정하였다. HK-2 세포에 20 μM cisplatin을 24 시간 동안 처리했을 때 apoptosis의 비율이 27.04%까지 증가하였고 80 μM dopaol을 함께 전 처리했을 때 9.23%까지 감소되는 결과가 나타났다 (Fig. 2B).

마지막으로 미토콘드리아의 활성을 측정하기 위해 JC-1 염 색을 실시하였다. 미토콘드리아막전위 (MMP, mitochondrial membrane potential)는 flow cytometry를 이용해 측정하였으 며, 비처리군은 red signal이 77.87%인 반면 20 μM cisplatin 처리군은 57.81%까지 감소하였고 80 μM dopaol을 함께 처리 하였을 때 72.12%까지 회복되었다 (Fig. 2C).

결과를 종합하였을 때 dopaol의 처리는 cisplatin에 의해 유 도된 HK-2 세포 apoptosis를 억제하는 것으로 확인될 뿐만 아니라 cisplatin에 의해 감소된 미토콘드리아의 활성 까지 회 복시키는 것으로 나타났다. 미토콘드리아의 활성은 세포가 necrosis로 진행되었을 때 과활성화 (hyperactivation) 된다고 알려져 있지만 (Shin et al., 2015), 반대로 apoptosis로 진행 되었을 때 감소된다 (Gottlieb et al., 2003). 이는 dopaol이 necrosis가 아닌 apoptosis 기전을 억제하는 것으로 사료되며, 미토콘드리아 활성을 회복시키는 것으로 보아 아마도 apoptosis 초기단계부터 관여한다고 생각된다. 다음으로 dopaol 은 어떤 apoptosis 관련 신호전달경로에 관여하는지 알아보기 위해 실험을 진행하였다.

Caspase-3/MST-1 신호전달경로는 포유류세포 (mammalian cell)에서 cell apoptosis에 관여하는 중요한 신호전달경로로 알 려져 있으며 apoptosis를 개시하기 위해 Thr¹⁸³ 부위의 자가인 산화 (autophosphorylation)와 caspase-3에 의한 단백질 절단이 필요하다 (Ardestani et al., 2014). 이에 따라 20 μM cisplatin 을 HK-2세포에 처리하였을 때 caspase-3/MST-1 신호전달경로 가 활성화되는지 또는 dopaol 처리에 의해 차단되는지 알아보 기 위해 단백질 발현량을 조사하였다. Cisplatin을 20 μM 농 도로 HK-2 세포에 처리하였을 때, 비처리군에 비하여 MST- 1, MST-1 cleaved form, caspase-3, caspase-3 cleaved form 의 단백질 발현량 뿐만 아니라 MST-1 Thr¹⁸³부분에 자가인산 화 비율이 증가하였다. 하지만 80 μM dopaol을 처리하였을 때 cisplatin 처리에 의해 증가된 단백질 발현량이 감소되는 결 과가 나타났다 (Fig. 3A). 추가적으로 caspase-3 활성도를 확 인하였을 때 마찬가지로 20 μM cisplatin에 의해 증가된 caspase-3 활성도가 80 μM dopaol을 처리했을 때 감소되는 결과가 확인되었다 (Fig. 3B).

Fig. 3  Dopaol β-D-glucoside reduces cisplatin-induced caspase-3/MST-1 signaling pathway in HK-2 cells.

After pretreatment with 80 μM dopaol β-D-glucoside for 1 h, HK-2 cells were treated with 20 μM cisplatin for 24 h. Cell extracts were subjected to protein analysis using Wes and caspase-3 activity assay. Data represent the means ± SEM of three independent experiments. Means with difference letters are significantly different at **p < 0.05 vs. control, *p < 0.05 vs. cisplatin (20 μM).

결과를 종합하자면 dopaol 처리는 cisplatin에 의해 증가되는 caspase-3/MST-1 신호전달경로를 억제할 뿐만 아니라 caspase- 3 활성도를 감소시켜 HK-2 세포에 일어난 apoptosis 기전을 억제하는 것으로 보이지만, MST-1 Cleaved form이 세포핵내 로 도입되거나 MST-1 단백질을 HK-2 세포 내부에 인위적으 로 과발현 시켰을 때 apoptosis가 유도되는지에 대한 추가실험 이 필요할 것으로 생각된다.

각 실험군간 신장의 손상 정도와 혈액 내 호중구의 양을 측 정하기 위해 실험을 진행하였다. 동물에서 채취한 전혈의 일 부분을 IDEXX ProCyte DX hematology analyzer를 이용해 모든 적혈구와 백혈구의 비율을 분석하였다.F4

Fig. 4  Dopaol β-D-glucoside prevents cisplatin-induced nephrotoxicity on animal model.

Mice were separated 3 groups [(control (n = 7), cisplatin 20 ㎎/㎏ (n = 7), cisplatin 20 ㎎/㎏ + dopaol 10 ㎎/㎏ (n = 7)]. Mice were administered with vehicle or cisplatin 20 ㎎/㎏. A; blood neutrophils were analysed by IDEXX procyte, B; BUN and Cre in sirum are analysed by FUGI DRI-CHEM 4000i, C; representative images were stained by hematoxylin and eosin (H&E) staining. Means with difference letters are significantly different at **p < 0.05 vs. control, *p < 0.05 vs. cisplatin (20 ㎎/㎏).

Cisplatin 단독처리군은 정상대조군과 비교하여 총 백혈구 중 호중구의 비율이 76.4±4.6%로 증가하였지만 dopaol 처리군은 25.5±7.3%로 감소하였다. 다음으로 혈청에 존재하는 blood urea nitrogen (BUN)과 creatinine (Cre)의 양을 측정하기 위 해 FUJI DRI-CHEM 4000i를 이용하였다. 그 결과 cisplatin 단독처리군은 정상대조군과 비교하여 BUN 농도가 116.0±16.54㎎/㎗, Cre 농도 1.4±0.34㎎/㎗로 증가된 반면 dopaol 처리군은 BUN 농도 23.5±2.36㎎/㎗, Cre 농도 0.4 ±0.08㎎/㎗로 감소하였다. 마지막으로 H&E 염색을 통해서 신장 내에 존재하는 세포와 조직의 형태를 확인하였을 때, cisplatin 단독 투여군 (CIS)은 정상대조군 (NOR)과 비교하여 세뇨관 세포의 솔가장자리 (brush border) 부분의 소실과 세뇨 관손상 (tubular damege)이 관찰되었으며 dopaol 처리군에서 정상에 가까운 형태로 회복되었다. Cisplatin을 투여했을 때 혈 중 호중구와 BUN과 Cre 농도가 증가되고, 세뇨관 손상이 일 어난다고 알려져 있다 (Faubel et al., 2007; İşeri et al., 2007). 본 실험에서도 cisplatin 투여에 의해 증가된 혈중 호중 구와 BUN, Cre 농도가 확인되었을 뿐만 아니라 손상된 신장 조직을 확인할 수 있었지만 dopaol 투여에 의해 회복되는 결 과를 실험을 통해 확인하였다. 하지만 dopaol이 in vivo에서 정확히 어떤 기전에 의해 cisplatin에 의해 유도된 신장독성을 억제하는지 신장조직 내부에서 발현되는 MST-1과 caspase-3 단백질 발현량 확인실험이 필요할 것으로 생각되며, dopaol의 혈중 반감기 또는 투여농도에 따른 독성평가가 추가적으로 필 요할 것이라 생각된다.

결과를 종합하자면 HK-2 세포에서 80 μM dopaol 전처리는 20 μM cisplatin 처리에 의해 80.2±3.0% 감소된 세포생존율을 97.9±1.0%까지 회복시켰다. TUNEL assay와 FACS analysis에 서도 20 μM cisplatin 처리에 의해 증가된 DNA 단편화와 apoptosis의 비율은 모두 80 μM dopaol 전처리에 의해 감소되 었을 뿐만 아니라 caspase-3/MST-1 신호전달경로에 관여하는 단백질의 발현량을 감소시켰다. 세포실험과 마찬가지로 6 주령 수컷 BALB/C를 이용한 동물실험에서도 20㎎/㎏ cisplatin처 리에 의해 증가된 혈중 호중구, BUN과 Cre 농도, 신장조직손 상을 10㎎/㎏ dopaol 투여로 억제하는 효과를 확인하였다. 따 라서 dopaol은 cisplatin의 부작용을 예방할 수 있는 천연분리 물질로써 유용하게 이용 될 수 있을 거라고 생각된다. 하지만 dopaol 투여에 따른 신장조직 내부의 기전변화와 혈중 반감기 측정 또는 독성평가와 같은 추가적인 연구가 필요하다고 생각 된다.