실험에 사용한 acetonitrile, ethyl alcohol, methyl alcohol은 Merck Millipore (Billerica, MA, USA)에서, dimethyl sulfoxide (DMSO), formalin solution, phosphate buffered saline (PBS), hispidulin, luteolin, rosmarinic acid, nepetin montelukast, 2-7-dicholordihydrofluorescein diacetate (DCFDA), aluminium hydroxide는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서, Dulbecco’s modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin amphotericin B (antibotics), 0.25% trypsin-EDTA (TE)는 Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구매하여 사용하 였고 FACS 분석용 항체는 R-phycoerythrin (PE) anti-mouse CD11b (aM, rat IgG2b)과 FITC anti-mouse Gr-1 (RB6- 8C5, rat IgG2b)는 Biosciences (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구매하였고, Mip-2 (DY452- 05)와 Cxcl-1 (DY453-05)는 R&D system (Minneapolis, MN, USA)에서 구매하여 사용하였다.

우리가 사용한 배암차즈기 (Salvia plebeia R. Br.)는 추출물 및 유효성분 분석을 위해 2014 또는 2015년 4월에 수확해서 지상부를 세척 및 건조한 시료를 부안동진농장 (전라북도 부 안군 동진면 지비길 38-1)으로부터 구입하여 지상부 500 g을 고루 섞은 후 3 차 증류수에 희석하여 제조한 30% 주정 (식 품추출원료 사용 시 안전성검사를 하지 않아도 되는 추출법) 10ℓ이용해서 80℃에서 2.5 시간동안 열탕 추출하였다. 여액 을 모은 후 잔사는 동일한 방법으로 재추출 하여 그 여액을 합하여 45℃에서 배암차즈기 추출물이 건조될 때까지 감압 농 축하였다. 이후 2ℓ의 증류수를 가해 현탁시킨 후 동결 건조 하여 분말상태로 제조하였다 (Shin et al., 2016). 배암차즈기 추출물은 초저온냉동고 (−84℃)에 보관 (표본시료: SP_R- 70MeOH)하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.

HPLC 분석을 위한 acetonitrile과 water는 HPLC용 특급용 매로, trifluoroacetic acid (TFA)는 분석용 등급의 용매로 Merck Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구입하였다. Hispidulin (SML0582), luteolin (L9283), 그리고 rosmarinic acid (536954)등 표준품들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서, 또한 nepetin (ASB-00005380-005)은 ChromaDex (Irvine, CA, USA)사에서 구입하여 사용하였다. HPLC 분석은 waters 2695 및 996 photodiode array detector에 의하여 수 행하였다.

배암차즈기 추출물을 20 ㎎/㎖로 70% 메탄올에 용해한 후, PVDF syringe filter를 사용하여 여과한 후 분석에 사용하였다. Optima pak C₁₈ column (5㎛, 4.6㎜ × 250㎜)을 사용하여 수행되었으며, 칼럼의 온도는 40℃로 유지하였고, 검출은 PDA detector를 사용하였다. 이동상은 acetonitrile (A) 및 0.1% TFA 함유 water (B)를 이용한 gradient system (0 min, 10% A; 10 min, 10% A; 50 min, 50% A; 52 min, 100% A; 62 min, 100% A; 65 min, 10% A; 75 min, 10% A)으로 최 적화 하였고, 유속은 1.0㎖/min, 주입량은 20㎕로 하였다.

미세먼지는 여러 가지 복합한 성분을 가진 대기 중 부유 물 질인데, 그 중 미세먼지의 구성성분인 석탄연소물 (coal)은 5 g 의 석탄을 700℃의 가열로 (ULVAC-RIKO TPC5000, ULVAC Technologies Inc., Methuen, MA, USA)에서 10 분간 연소시 키면서 발생되는 연소물을 glass fiber filter pad에 포집하였고, 포집된 TPM (total particulate matter)은 DMSO 용액을사용 해서 10㎎ TPM/㎖로 농도로 추출해서 석탄 연소물실험에 사용하였다. 제조된 석탄연소물은 KT&G 중앙연구원에서 공 급하였고, 플라이애쉬 (fly ash)는 일본 JIS type-II fly ash (Yoshitaka, 2007)를 제공받아 사용하였으며, 각각을 디젤연소 분진 (DEP) (Lim and Kim, 2009)과 혼합하여 미세먼지 혼 합물을 제조하였다. 구체적으로는 디메틸설폭사이드 (DMSO) 에 녹인 석탄연소물 (5㎎/㎖), 플라이애쉬 (10㎎/㎖), 디젤연 소분진 (5㎎/㎖) 을 각각 최종농도가 석탄연소물 (0.25㎎/㎖), 플라이애쉬 (0.5㎎/㎖), 디젤연소분진 (0.75㎎/㎖)로 희석하여 혼합하고, 명반 (aluminium hydroxide) gel adjuvant를 8%로 희석되게 하여 최종적으로 미세먼지 혼합물 (ambient particulate matter, APM)을 제조하였다.

MH-S murine alveolar macrophage cell line (ATCC, Rockville, MD, USA)는 RPMI 1640 medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 1% antibiotics (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)를 첨가하여 사용하였고, 항온 (37℃)과 항습을 유지하는 5% CO₂ incubator에서 배양하였다.

MH-S alveolar macrophage cell을 96 well plate에 well당 2 × 10⁴ cell이 되도록 분주하여 배양하였다. 미세먼지 (25, 50, 100, 200㎍/㎖)와 배암차즈기 추출물 (25, 50, 100, 200, 400㎍/㎖)을 농도별로 처리하여 24 시간 배양한 다음 MTS tetrazolium salt와 electron coupling reagent (phenazine methosulfate, PMS)를 20 : 1의 비율로 섞어 각 well당 MTS + PMS 용액 50㎕ 와 RPMI 1640 media 50㎕ 를 혼합하 여 100㎕ 씩 분주하였다. 37℃에서 4 시간 배양한 후 차광 반응으로 plate reader를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정 하였다.

MH-S 세포를 분리하여 5 × 10⁵ cell을 FACS tube에 분주하 고 FACS buffer로 2 회 세척한 다음, DCF-DA 용액을 각 tube당 10 μM의 농도로 분주하여 세포를 현탁하였다. 37℃ 암 실에서 30 분간 staining한 후 FACSCalibur^TM flow cytometry system (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 분석하였다.

각 세포와 조직들로부터 유전자의 발현을 분석하기 위해 TRIzol reagent 용액 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA USA)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 추출한 RNA를 RTase, dNTP, buffer, oligo-dT를 넣은 후 42℃ water bath에서 2 시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 2 x SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster, CA, USA), 200 nM primers, Rox dye를 넣은 후 각 cycle은 95℃ 15 sec, 55℃ 15 sec, 72℃ 15 sec의 조건으로 Applied Biosystems 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)를 이 용하여 PCR을 수행하였다. 각 유전자의 발현은 housekeeping 유전자 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 를 internal control로 사용하여 상대적 정량값을 비교분석하였 다 (Table 1).

기관지 삽입에 의한 기도세척 (airway lamina washing)을 통해 마우스의 기도세척액 (airway lavage)으로부터 기관지폐 포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BAL fluid)을 분리 한 다음, 분리한 BAL fluid를 cytospin에 넣어 슬라이드 도말 한 후 Diff-quick 용액으로 염색하여 neutrophils의 감별을 실 시하였다. 동물로부터 분리한 폐 조직은 10% 포르말린 용액에 고정하여 sucrose를 이용해 탈수과정을 거친 후 hematoxylin과 eosin 용액을 이용하여 염색한 다음 조직병리학적 검사를 실시 하였다. 다른 section은 Masson’s trichrome 용액 (Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)으로 염색한 후 light microscopy를 이용하여 교원섬유의 감별을 실시하였다.

세포의 차이를 분석하기 위하여 각 샘플은 staining solution (PBS containing 1% FBS and 0.01% NaN₃)에서 정해진 antibody를 이용하여 10 분간 염색한 다음 FACScalibur flow cytometry system (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 유세포 분석을 하였다. 결과는 CellQuest software (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 세포를 분석하였고, 분석한 세포 수와 백분율을 이용해 총 세포 수를 구하였다. 유세포 분석을 위한 antibody는 BD Pharmingen (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구입하였다.

단백질의 생성정도를 측정하기 위해 ELISA를 이용하여 분 석하였다. IL-17A (M17AFO), TNF-α (MTA00B), Mip-2 (MM200), 그리고 Cxcl-1 (MKC00B) 단백질량을 BAL fluid 에서 ELISA kit (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 시행하였다.

먼저, coating antibody를 microplate에 100㎕ 씩 분주하고 4℃에서 24 시간 반응시켰다. 각 well을 wash buffer로 세 번 세척하고 assay diluent를 200㎕ 씩 넣어서 1 시간 동안 실 온에서 배양하였다. 배양하는 동안 표준품과 상등액을 준비하 고 완료되면 microplate를 세 번 세척한 후 각 표준품과 상등 액을 100㎕ 씩 넣고 2 시간 동안 실온에서 배양하였다. Microplate를 세 번 세척하고 detection antibody를 만들어서 각 well에 100㎕ 씩 넣고 실온에서 배양하였다. 1 시간 후, microplate를 다섯 번 세척하고 substrate solution을 만들어서 각 well에 100㎕ 씩 넣고 30 분 동안 어두운 곳에서 실온으 로 배양하였다. Stop solution을 각 well에 넣고 microplate spectrophotometer를 이용하여 흡광도 450㎚로 측정하였다.

본 연구는 수컷 C57BL/6J 마우스 (20 - 22 g, 대한바이오, 음성)를 실험 기간 동안 평균 온도 23 ± 2℃, 습도 50 ± 2%로 유지하였으며, 밤낮 주기 (12 시간 light/12 시간 dark, light turn on 9 am)가 조절되는 환경에 수용하였다. 실험 기간 동 안 물과 고형사료는 자유롭게 섭취할 수 있도록 제공하였다. 호흡기 손상 미세먼지는 석탄연소물인 coal과 fly ash, diesel exhaust particles (DEP)를 섞은 4㎎/㎏ 미세먼지혼합물 (APM)을 aluminium hydroxide (alum)에 희석시켜 intranazal- trachea (INT) injection 방법을 이용하여 기도를 통해 폐로 직접 주입하는 동물모델을 제작하였다.

배암차즈기 추출물 (식품으로 안전한 농도인 100㎎/㎏, 200㎎/㎏, 400㎎/㎏) (Choi et al., 2016; Kim et al., 2016)과 양성대조군 montelukast (10㎎/㎏)를 각각 10 일 간 투여하였고 투여시작일로부터 3 일 후, 6 일 후에 미세먼지혼 합물을 주입하였다.

실험 집단 간 수치 데이터는 각 실험군 결과값 mean ± standard error (SEM)로 나타내었으며, 동물실험에서는 SPSS 11.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 일원배치 분산분석 (One-way analysis of variance, ANOVA) 후에 Duncan’s Multiple Comparison Tests (DMRT)로 유의성 을 검증하였고, 세포실험에서는 독립표본 T-검정 (independent samples t-test)을 이용하여 유의성을 검증하였다. p 값이 0.05, 0.01 혹은 0.001 보다 작은 경우를 구분하여 분석하였으며, 각 경우에 해당 시 통계적으로 유의적 차이가 있는 것으로 판정 하였다.

본 연구에서 이용한 배암차즈기(Salvia plebeia R. Br.) 추출 물의 지표성분 분석을 위해 표준품과 함께 배암차즈기 추출물 을 HPLC로 분석한 결과, 배암차즈기 추출물에서 rosmarinic acid (69.86㎎/g), luteolin (1.72㎎/g), nepetin (8.26㎎/g), hispidulin (7.56㎎/g)의 성분함량을 확인할 수 있었다 (Fig. 1).

Fig. 1  Chromatogram and structure of four compounds purified from S. Plebera R. Br. (SP_R).

A; HPLC of four compound standard, B; active ingredients of SP_R extracts were analyzed by HPLC, C; structural formula of four indicative compounds.

폐의 대식세포인 MH-S 세포주을 통하여 배암차즈기 추출 물의 항염증 효능을 분석하고 in vitro 실험의 적정 투여량을 설정하기 위하여 우선 미세먼지의 처리 농도를 결정하였다. 미 세먼지 (APM)를 농도별 (25, 50, 100, 200㎍/㎖) 로 처리한 후 MTS assay를 통해 세포생존율을 관찰한 결과, 미세먼지 100, 200㎍/㎖ 처리농도에서는 세포독성에 의해 거의 모든 세 포가 death되었고 50㎍/㎖ 처리농도 이하에서 50% 이상 세 포생존율이 관찰되었다 (Fig. 2A). In vitro에서 미세먼지 (APM)에 의한 MH-S 세포주의 산화적 스트레스 (oxidative stress) 유도는 DCF-DA staining법으로 측정한 ROS의 생산량 이 극대화되는 미세먼지 농도를 관찰하였고, 그 결과 50㎍/㎖ 처리농도에서 25㎍/㎖ 이하 처리농도 보다도 2 배 이상 ROS 생산량이 증가되는 것을 관찰하였다 (Fig. 2B와 2C). 즉, 미세먼지 처리에 의한 세포생존율은 농도 의존적으로 감소하 였으며 100, 200㎍/㎖의 농도에서는 95% 이상의 감소 수준 을 보였다. 그러므로 약 50%의 세포생존율을 보이면서 ROS 생산량이 가장 높은 50㎍/㎖의 농도를 다음 실험을 위한 미 세먼지의 처리 농도 값으로 선정하였다.

Fig. 2  The determination of optimal concentration of APM in MH-S alveolar macrophage cells.

The cell survival A and ROS levels B of MH-S cells stimulated with APM (ambient particulate matter) were analyzed by MTS assay and flow cytometry C and appeared graph. The 50㎍/㎖ of APM was suitable concentration for in vitro. Data are shown as means ± SEM. Significant (*p < 0.05, **p< 0.01 and ***p < 0.001). difference between value for control cells and the APMstimulated cells.

배암차즈기 추출물의 적절한 처리 농도를 관찰하기 위하여 MTS assay를 통해 세포의 증식에 영향을 끼치는지 관찰한 결 과 배암차즈기 추출물을 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때 MH-S 세포의 세포 증식 능력이 증가함을 확인할 수 있었고, 400㎍/㎖의 처리농도에 서는 세포독성이 관찰되었다 (Fig. 3A). 이를 토대로, 50㎍/㎖의 미세먼지를 처리한 MH-S 세포에 배암차즈기 추 출물 50㎍/㎖ 의 농도로 처리한 결과, 미세먼지에 의해 증가 된 ROS의 생성량이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 3B). 또한 염증 사이토카인으로 알려진 IL-4, IL-15, IL-17A와 함께 호중구에서 분비되는 IL-10 (Tosello et al., 2012)의 유 전자 발현 변화를 확인한 결과, 미세먼지에 의해 염증 사이토 카인들의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었으며, 배암차즈기 추 출물의 농도별 처리에 의해 염증 사이토카인들의 발현이 유의 적으로 감소됨을 관찰 할 수 있었다 (Fig. 3C).

Fig. 3  The determination of optimal concentration of the Salvia plebeian R. Br. (SP_R) in MH-S alveolar macrophage cells.

A; the cell survival of MH-S cells was measured by MTS assay after treatment of SP_R extracts indicated concentration. The 50㎍/㎖ of SP_R extracts was suitable concentration for in vitro. B; the MH-S cells were treated with SP_R extracts after stimulation of APM (ambient particulate matter), C; the reduced expression of IL-4 mRNA (a), IL-10 mRNA (b), IL-15 mRNA (c), IL-17A mRNA (d) by the SP_R extracts in MH-S cells stimulated with APM using real-time PCR analysis. The production of ROS in MH-S cells were analyzed by flow cytometry after staining with DCF-DA. Data are shown as mean ± SEM. ^##p < 0.005, ^###p < 0.0005 vs Nor; *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001. vs CTL.

10 일간 미세먼지의 기관지 주입과 함께 배암차즈기 추출물 을 매일 경구 투여하여 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에서 배암차즈기 추출물의 호흡기 염증 증상의 개 선 효과를 관찰하였다. H&E 염색법을 통하여 폐조직의 단면 을 검사함으로써 호흡기 염증 증상을 확인하고 M-T 염색법을 통하여 교원 섬유의 양을 측정하였다. 미세먼지에 의해 유도 된 호흡기 질환 마우스 모델의 폐 세포 조직을 관찰한 결과 폐 세포의 벽이 두꺼워지는 것을 확인하였으며, 교원 섬유가 증가함을 확인하였다. 이러한 염증 증상은 배암차즈기 추출물 을 경구 투여한 마우스 그룹에서 폐 세포의 벽 및 교원 섬유가 정상군 수준으로 회복되는 것을 관찰 할 수 있었다 (Fig. 4).

Fig. 4  Experimental schedule to make APM induced mice model and Histopathology.

A; mice were treated with the SP_R extracts (400㎎/㎏, 200㎎/㎏, 100㎎/㎏) and montelukast 10㎎/㎏ daily for 10 days and intra-nasal trachea injected with 4㎎/㎏ APM (ambient particulate matter) at day 4 and day 7. At day 10, mice were sacrificed. B; the thickness of alveolar wall and detection of collagen fibers in lung tissue was measured by H&E (hematoxylin and eosin) staining and M-T (Masson’s trichrome) staining assay, respectively (WT; Balb/c Normal , APM-CTL; APM control, APM + Montel; APM induced and orally administration montelukast, APM + SP_R; APM induced and orally administration SP_R extracts. Lung tissue were observed using a visible-light microscope at a magnification of 200 x (green color bar; 100 ㎛). mpk; ㎎/㎏, WT; Wild type.

미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 모델의 기관지 폐포세척액에서 ROS 생성량을 관찰하기 위해, DCF-DA로 염 색한 BAL fluid를 유세포 분석기를 이용하여 분석한 결과, 미 세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 그룹의 BAL fluid 에서 ROS의 생성량이 증가됨을 확인하였으며, 증가된 ROS의 생성량은 100, 200, 400㎎/㎏의 농도에서 배암차즈기 추출물 의 경구 투여에 의해 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다. 또한 양성대조군인 montelukast을 투여한 그룹의 BAL fluid에 서도 미세먼지에 의해 증가된 ROS 생성량을 감소시킴을 확 인하였다. 따라서 배암차즈기 추출물이 미세먼지에 의해 유도 된 호흡기 질환에서 미세먼지에 의해 증가된 염증 수준을 회 복시킴을 알 수 있었다 (Fig. 5).

Fig. 5  The reduced production of ROS by the Salvia plebeian R. Br. (SP_R) extracts in BAL fluid of APM-induced mice models.

The ROS production of BAL fluid was analyzed by flow cytometry after staining with DCF-DA. The extracts of SP_R reduced the ROS production in BAL fluid. APM; Ambient particulate matter, WT; Wild type.

마우스의 BAL 세포와 폐 세포의 총 세포 수를 관찰한 결 과 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 그룹에서 BAL 및 폐의 전체 세포 수가 증가하였으며, 증가된 BAL 및 폐의 전체 세포 수가 배암차즈기 추출물을 경구 투여한 마우 스 그룹에서 농도별로 감소됨을 확인 할 수 있었다. 또한 BAL 세포에서 호중구 수를 확인하기 위해 Diff-Quik 염색을 한 결과, 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 그룹에 서 호중구의 수가 증가하였으며, 이는 폐의 염증 수치가 증가 함을 의미한다. 미세먼지에 의해 증가된 호중구의 수가 배암 차즈기 추출물을 경구 투여한 그룹에서 감소됨을 확인 하였으 며 따라서 미세먼지에 의해 유도된 호흡기 질환에서 배암차즈 기 추출물이 주요 염증 세포인 호중구 수의 감소를 통해 폐의 염증 반응을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다 (Fig. 6).

Fig. 6  The inhibition of infiltrated granulocytes by the Salvia plebeian R. Br. (SP_R) extracts in airway of APM-induced mice model.

The total BAL A and lung cells B were counted using flow cytometey and the granulocytes infiltrated to BAL, C photomicrograph (original magnification,×200) of BALF cytospins from a sensitized mouse exposed repeatedly to allergen (Diff-Quik stain). (a; Balb/c WT, b; APM control, c; APM-monteleukast_10㎎/㎏ d; APM-SP_R 400㎎/㎏, e; APM-SP_R 200㎎/㎏, f; APM-SP_R 100㎎/㎏), D; granulocytes total cells No. in BALF. Data are shown as mean ± SEM. ##p < 0.005, ^###p < 0.0005 vs WT; *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001.vs CTL. APM; Ambient particulate matter, WT; Wild type.

마우스의 BAL과 폐 조직에서 flow cytometry 분석을 통해 세포빈도를 CD11b⁺/Gr-1⁺ 백분율(%)로 분석한 후 총 세포수 를 적용하여 각 조직에서의 절대 총 세포 수를 산출하였다. 그 결과 미세먼지를 주입한 대조군의 BAL과 폐에서 CD11b⁺/ Gr-1⁺ 면역 세포 수가 유의성 있게 증가함을 확인하였다.

배암차즈기 투여군의 BAL과 폐에서는 배암차즈기 추출물 의 농도별 투여에 따라 CD11b⁺/Gr-1⁺ 면역 세포 수가 유의성 있는 수준으로 감소함을 확인하였다. 또한 BAL fluid에서 ELISA를 통해 염증유발인자 IL-17A, TNF-α, Mip-2, 그리고 Cxcl-1의 생산량을 측정한 결과 대조군의 BAL fluid에서 IL- 17A, TNF-α, Mip-2, 그리고 Cxcl-1의 생산량이 모두 통계학 적 유의성 있게 증가하였다. 그러나 배암차즈기 투여군에서 투 여한 배암차즈기의 농도 의존적으로 IL-17A, TNF-α, Mip-2, 그리고 Cxcl-1의 생산량이 감소함을 확인하였다.

Mip-2는 monocyte chemotactic protein-1 (Mcp-1), macrophage inflammatory protein 1-alpha (Mip-1α)와 함께 단핵세포와 면역세포의 이동 및 침윤에 관여한다 (Ajuebor et al., 1999). 염증사이토카인인 IL-17A과 TNF-α, 그리고 CXC 케모카인 ligand 계열인 Cxcl 유전자가 염증과 관련하여 염증 세포인 호중구의 염증반응에 관여한다는 연구결과들이 다수 보고됨에 따라 (Amulic et al., 2012; De Filippo et al., 2013; Kolaczkowska and Kubes, 2013; Quinton et al., 2004), 과립구의 세포 수 조절에 있어서 Cxcl-2와 함께 Cxcl-1이 관여하는 것으로 예측 된다 (Fig. 7)

Fig. 7  The reduction of CD11b⁺/Gr-1⁺cells number by the Salvia plebeian R. Br. (SP_R) extracts through inhibiting expression of IL-17A, TNF-α, Mip-2 and Cxcl-1 in airway of APM-induced mice model.

The absolute number of CD11b⁺/GR-1+cells in airway (A - B) was evaluated by flow-cytometry. The production of IL-17A (C), TNF-α (D), Mip-2 (E), and Cxcl-1 (F) proteins in airway was measured by ELISA. Data are shown as mean ± SEM. ^##p < 0.005, ^###p < 0.0005 vs WT, *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001. vs CTL. APM; Ambient particulate matter, WT; Wild type.

CC 케모카인 수용체 Ccr9과 Ccr3, 케모카인 ligand인 Ccl5 는 기도의 염증에 반응하여 과립구의 염증을 증가시키고 기관 지의 면역반응을 높이는 것으로 알려져 있다. 이에 미세먼지 에 의해 유도된 호흡기 질환 마우스 모델의 폐 조직에서 염증 관련 케모카인 수용체와 케모카인 ligand의 유전자 발현을 측 정한 결과, 미세머지에 의해 이들 염증유발인자들의 발현이 증 가하였으며 배암차즈기 추출물 투여에 의해 감소하였다. 또한 염증반응에 대항하여 기관지의 면역반응을 높이는 염증성 사 이토카인 IL-15, TNF-α, IL-4의 유전자 발현이 미세먼지에 의 해 유도된 대조군에서 증가함을 확인하였으며, 증가된 사이토 카인 발현은 배암차즈기 투여군에서 농도 의존적으로 회복하 는 경향을 관찰 할 수 있었다 (Fig. 8).

Fig. 8  The restoration of airway immune response associated chemokines and inflammatory cytokines by the Salvia plebeian R. Br. (SP_R) extracts in APM-induced mice models.

The gene expression of airway immune response associated chemokines (A - C) and inflammatory cytokines (D - F) in lung isolated from APM-induced mice models were analyzed by real-time PCR. Data are shown as mean ± SEM. #p < 0.05, ^##p < 0.005, ^###p < 0.0005 vs WT, *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 vs CTL. APM; Ambient particulate matter, WT; Wild type.