공시재료는 2014 - 2016년 전남대학교에서 수확한 결명자 [Senna tora (L.) Roxb.] (M0)를 사용하였으며, 선별된 종자 는 정읍 한국원자력연구소 감마선 조사 시설 (Co-60 3000 Ci, Nordion Inc., Ottawa, Canada) 내에서 감마선 선량을 100 Gy에서 400 Gy까지 24 시간 처리하였으며, 감마선이 처 음 조사된 종자는 M1으로 명명하였다. 감마선이 조사된 종자 를 재배하여 얻어진 종자와 그 다음 세대의 종자를 각각 M2, M3로 명명하였다. 감마선 조사량과 세대에 따라 종자의 항산 화 활성, 발아 및 성장을 비교 분석하기 위해 감마선이 조사 되지 않은 시료를 대조구로 이용하였다.

처리종자의 실험은 105 개의 칸이 있는 트레이에 상토를 넣 고 깊이 2㎝의 구멍을 뚫어 종자를 1 립씩 심었으며 25℃ 의 일정한 온도로 통제하여 발아시킨 후 생육상 변화를 조 사하였다. 발아조사는 파종 후 7 일째 첫 번째 싹이 지상부에 출현한 날을 기준으로 하였으며, 최종 발아율은 파종 후 발아 가 거의 완료되는 날인 파종 20 일 후를 기준으로 하였다. 생 육상 변화의 조사는 초장 (stem)과 자엽 (cotyledon) 및 본엽 (true leaf) 두 가지 엽장의 길이를 측정하였고, 초장은 파종 7 일과 20 일 후에 엽장은 21 일 후에 측정하였다 (Fig. 1). 초 장의 길이는 줄기가 지상부에 출현한 곳에서부터 자엽의 시작 점까지 측정하였으며 자엽과 본엽의 엽장은 각각 잎의 가장 긴 지제부에서 끝부분까지 측정하였다. 측정한 값들은 t-test를 통해 감마선을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 생육변화 결 과를 냈다.

Fig. 1  Investigation site of growth charateristics in seedling of Senna tora after gamma ray irradiation.

A; true leaf length, B; cotyledon length.

균일한 추출효과를 위하여 결명자 종자는 40 mesh 이하로 분쇄하였다. 추출은 결명자 시료와 75% 에탄올 용매를 1 : 20 (w/v) 비율로 혼합하여 3 시간 동안 shaking water bath (60℃, 150 rpm)에서 수행되었다. 이후 원심분리 (2,000 rpm, 10 분) 를 3 회 반복하여 상층액을 분리하였으며 회전식 감압 농축기 를 사용하여 농축 후 동결건조를 실시하였다. 동결건조 후 분 말을 균일하게 분쇄하여 실험 전까지 –20℃에서 냉동 보관하 였다.

결명자 종자의 TPC 함량 측정은 추출물을 1 ㎎/㎖로 용해 시켜 이용하였다. 용해된 추출물 0.2㎖와 10% (w/w)의 Folin Ciocalteu’s reagent (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 1㎖를 혼합한 후 7.5% (w/v)의 Na₂CO₃ (Duksan Pure Chemicals Co., Ltd., Ansan, Korea) 0.8 ㎖를 첨가하 였다. 반응을 위해 암실에서 2 시간 방치하였으며, 760㎚의 UV-vis spectrophotometer (UV 1800, Shimadzu, Kyoto, Japan)에서 흡광도를 측정하였다. TPC 정량을 위해 vanillin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 이용하여 표준 곡선을 작성하였다.

ABTS (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 이용 한 자유라디칼 소거 활성은 Re 등 (1999)의 방법을 변형하여 수행하였다. 7 mM ABTS와 2.4 mM potassium persulfate (Duksan Pure Chemicals Co., Ltd., Ansan, Korea) 용액을 1 : 1 (v/v)로 혼합하여 16 시간 동안 차광상태로 방치시켜 ABTS⁺를 형성시켰다. 이 후 UV-vis spectrophotometer (UV 1800, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 734㎚에서 흡광 도를 측정하였다. 흡광도 값이 0.7 ± 0.02가 되도록 에탄올로 희석하였으며 희석된 ABTS⁺용액 1㎖에 농도별로 추출물 0.2㎖를 첨가한 후 흡광도의 변화를 측정하였다.

감마선 조사량과 세대에 따른 항산화 활성 분석을 위해 Two-way ANOVA를 실시하였다. 통계적 유의성은 pvalue < 0.05 수준에서 유의성이 있다고 판단하였으며 IBM SPSS Statistical Package for Social Science Statistics 23 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였다.

감마선이 처음 조사된 결명자[Senna tora (L.) Roxb.] 종자 M1과 그 다음세대 종자인 M2 발아율은 저선량의 조건 (100 Gy, 200 Gy)에서 유의하게 증가하였다 (Fig. 2). 100 Gy - 300 Gy 조건의 발아율은 무처리 된 종자보다 높았으며, 최대 발아율은 100 Gy (66.0%) 조건으로 대조구와 비교하여 약 7.2% 발아율이 증가하였다.

Fig. 2  Effect of gamma ray on the germination of Senna tora.

The data were statistically analyzed using t-test, significant differences were assessed to be significant at *p < 0.05 and **p < 0.01 level of probability. Average n = 145 (M1), 55 (M2).

300 Gy에서는 대조구와 비교하여 2.0% 정도 발아율이 증가 하였지만, 400 Gy 조건에서는 발아율이 감소하였다. M2 세대 의 발아율은 무처리된 종자부터 200 Gy 조건의 종자까지 상 승하였지만 300 Gy와 400 Gy 조건에서 각각 46.7%, 51.4% 로 낮아졌다. M2 세대는 M1 세대와 비교하여 종자의 발아율 이 감소하는 것을 육안으로 확인하였다 (Fig. 3).

Fig. 3  Effect of gamma ray on the growth of Senna tora.

A - E; M1 generations, a - e; M2 generations.

M2 세대의 200 Gy 조건은 M1의 200 Gy 조건과 비교하 여 발아율이 증가하였다. 결과적으로 결명자 발아율에 있어서 최적의 감마선 조사량은 200 Gy로 판단되며, 300 Gy 이상의 감마선 조사는 결명자 발아율을 감소시켰다.

감마선을 조사한 M1 세대의 줄기 길이는 파종 후 7 일째 대조구와 100 Gy - 400 Gy간의 유의한 차이가 나타나지 않았 지만 20 일 후에는 대조구를 기준으로 100 Gy에서 400 Gy 로 선량이 높아질수록 줄기 길이가 유의하게 감소하였다 (Fig. 4). 이것은 M2 세대와 유사한 경향으로 200 Gy 조건을 제외 하고 점차적으로 감소하였다. 즉, 100 Gy이상의 감마선 조사 는 결명자 종자의 줄기 생장을 억제하는 것으로 사료된다.

Fig. 4  Effect of gamma ray on the stem length of Senna tora.

The data were statistically analyzed using t-test, significant differences were assessed to be significant at *p < 0.05 and **p < 0.01 level of probability. Average n = 151 (M1), 55 (M2).

M1 세대의 파종 21 일 후 측정한 자엽과 본엽의 길이는 각각 대조구와 비교하여 100 Gy에서 400 Gy로 선량이 높아 질수록 점차 감소하였다 (Fig. 5). 300 Gy와 400 Gy 구간은 자엽과 본엽 모두 유의하게 감소하였다. 하지만, M2 세대 본 엽의 길이는 400 Gy에서 유의하게 상승하였고, 자엽의 길이 는 200 Gy와 400 Gy에서 상승하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 세대가 지남에 따라 감마선 처리에 의한 스트레스가 회 복된 것으로 보인다. 본 연구는 감마선 조사 후 M2 세대의 생육상 차이를 조사한 것으로, 그 결과의 신뢰성을 확보하기 위하여 M1 세대의 생육상 차이를 조사할 예정이며, 변이체를 추후 선발하여 육종에 활용할 계획이다.

Fig. 5  Effect of gamma ray on the length of cotyledon and true leaf of Senna tora.

A; M1, B; M2. The data were statistically analyzed using ttest, significant differences were assessed to be significant at *p < 0.05 and **p < 0.01 level of probability. Average n = 84 (M1), 54 (M2).

페놀화합물은 식물의 감염과 상해로부터 스스로를 보호 할 수 있게 하는 2 차 대사산물로써 항균, 항암, 항산화 등 다양 한 생리활성을 포함하고 있다

(Krishnaiah et al., 2011). 페놀화합물은 전자 공여능을 가지 고 있어 산화를 억제하는 것으로 자유 라디칼을 제거하는 항 산화 활성과 관련이 있다 (Han et al., 2006). 따라서 페놀화 합물의 함량은 식물체의 항산화 활성을 예상할 수 있는 자료 이다. Lee 등 (2013)이 보고한 결명자의 TPC 함량은 7.15㎎/ g으로 알려져 있다.

감마선 조사량이 증가할수록 각 세대 내에서의 TPC은 감소 하는 경향을 보였으나, 세대가 M1에서 M3로 증가할수록 그 감소도가 회복되는 경향을 보였다 (Fig. 6). M1 세대 내에서 100 - 200 Gy 조사는 TPC 함량에 유의한 차이를 보이지 않았 으나, 300 Gy 이상에서 유의한 차이를 보이기 시작했으며, 400 Gy에서는 최대 감소량을 보였다. M2 세대의 경우도 M1 세대와 유사하게 TPC 함량 변화를 보였으며, 300 - 400 Gy 조사량부터 확연한 감소를 보였다. 이는 Sikder 등 (2015)이 연구한 저선량 감마선 (50 - 250 Gy) 조사가 토마토의 총 당 함량, 아스코르브산과 잎의 페놀 함량 등에 영향을 미치는 것 과 유사하였다. 하지만 세대 간 즉, M1에서 M3로 진행되면서, TPC의 전체 함량은 증가하였다. 이것은 세대가 거듭되면서, 감마선에 의한 세포 스트레스 정도가 회복되면서 나타나는 현 상으로 분석되며 추후 감마선을 이용한 결명자 연구에 있어 중요한 연구사례가 될 것으로 사료된다.

Fig. 6  Effect of gamma ray on the total phenolic compounds of M1 -M3.

VE; Vanillin equivalent, control; M0. The data were statistically analyzed using Two-way ANOVA, significant differences were assessed to be significant at *p < 0.05 and **p < 0.01 level of probability. a - b; the data were analyzed using Tukey’s HSD (honestly significantl difference).

감마선이 직접 조사된 결명자 (M1)는 항산화 활성 차이에 따라 통계적으로 a - d 집단이 분류되었으며, a에서 d로 갈수 록 항산화 활성이 낮은 집단으로 확인되었다 (Fig. 7). M1 세 대 내 100 Gy는 대조구와 비교하여 낮은 항산화 활성을 나타 냈지만, 두 조건 사이의 항산화 활성에서 유의미한 차이가 없 었다. 하지만 조사량이 증가할수록 (> 100 Gy) 항산화 활성이 감소하면서 대조구와 큰 차이를 나타냈다 (Fig. 7).

Fig. 7  Antioxidants activity of gamma ray treated Senna tora in each generation.

control; M0. The data were statistically analyzed using SPSS, significant differences were assessed to be significant at *p < 0.05 level of probability. a - d; the data were analyzed using Tukey’s HSD (honestly significantl difference).

M1 세대 내에서는 감마선 조사에 따라 항산화 활성의 차이 가 다른 세대와 비교하여 크게 나타났으며 (f-value = 258.70), 세대가 증가하면서 감마선 조사에 따른 항산화 활성의 차이는 감소하였다 [f-value = 49.22 (M2), 4.01 (M3)]. M1 세대의 가장 큰 항산화 활성차이는 감마선 조사가 돌연변이를 유발하 여 감소된 TPC 함량에 의해 항산화 활성이 감소된 것으로 사 료된다. TPC의 수산기는 라디칼을 제거, 흡착 및 중화를 하기 때문에 직접적으로 항산화 활성에 관여하는 인자로써 TPC 감 소가 항산화 활성의 감소를 발생시키는 것으로 판단된다. 이 것은 Lampart-Szczapa 등 (2003)의 감마선 조사량 증가에 따 라 lupin 종자의 TPC 감소가 항산화 활성이 감소에 영향을 미치는 결과와 일치하였다. 반면 Dixit 등 (2010)의 연구에서 는 감마선 조사량이 증가함에 따라 항산화 활성이 증가하다가 5 kGy의 조사량에서 비 조사된 시료보다 항산화 활성이 낮아 짐을 확인하였다. Štajner 등 (2007)의 연구에 의하면 대두는 감마선 조사량 (−10 kGy)이 증가함에 따라 항산화 활성이 증 가하는 것으로 나타났다. 시료에 따라 강한 강도의 감마선 처 리는 세포벽을 분해하여 페놀과 플라보노이드 성분의 추출을 증가시켜 항산화 활성을 증가시켰다 (Choi et al., 2009). 감 마선 조사량에 따른 항산화 활성의 변화는 시료의 유전변이에 의한 성분 변화와 강한 감마선 에너지에 의한 분해정도에 영 향을 받는 것으로 사료된다.

세대 (M1 -M3)가 증가할수록 감마선 조사 결명자의 항 산화 활성은 증가하였는데 이것은 TPC 함량과 동일한 경 향을 나타냈다 (Fig. 5). M1과 M2 세대의 IC₅₀은 각각 1.85 ± 0.27㎎/㎖, 1.65 ± 0.24㎎/㎖로 M2에서 높은 항산화 활성을 보였지만, 통계적으로 M1과 M2 세대의 항산화 활성 에 차이가 없음을 알 수 있다 (Table 1). 반면, M3 세대의 평균 IC₅₀은 1.34 ± 0.07㎎/㎖로 M1 및 M2 세대와의 유의적 인 차이가 나타났다. 이것은 감마선 처리에 의한 스트레스가 M2 세대까지 영향을 미치며 M3 세대에서는 감소되는 것으로 사료된다.