풋거름작물은 두과 작물로 헤어리베치, 화본과 작물로 호밀을 각각 이용하였으며 호밀은 질소 고정능력이 낮아 단독처리에서 제외하여 처리내용은 헤어리베치 (hairy vetch, HV), 헤어리베치 +호밀 (hairy vetch + rye, HV/R), 헤어리베치 + 호밀 혼파처리 후 혼합유기물로 추가 시비 (hairy vetch + rye + mixed organic matter, HV/R/MO), 화학비료시비 (chemical fertilizer, CF), 무처리 (non-treatment, NT) 등 5 가지 처리를 하였다.

풋거름 작물의 파종시기구명을 위해 2015년 9월 20일, 10월 20일, 11월 20일 등 한 달 간격으로 파종 (3㎏/10a)을 실시하여 이듬해 질소고정량을 조사한 결과 9월 처리를 선발하고 위의 5 가지 처리를 하였다. 풋거름 작물들은 2016년 9월 20일에 다시 파종 (헤어리베치 3㎏/10a, 헤어리베치/호밀 : 1.5㎏ + 1.5㎏/10a)하였고, 이듬해 3월 5일에 경운을 실시하여 풋거름작물을 토양으로 환원시켰다. 화학비료 처리구 (질소기준 6㎏)는 3 월초에 기비 4㎏를 시비하고 풋거름작물과 같은 시기에 경운을 하고 추비로 6 월 중순에 2㎏을 추가시비 하였다. 모든 처리는 경운 2 일 후 2 년생 더덕을 정식하고 20 일 후 토양 이화학성 분석을 위하여 헤어리베치/호밀/혼합유기물 (HV/R/MO)처리를 제외한 모든 처리의 토양 샘플을 채취하였다. 헤어리베치와 호밀의 혼파 처리 후 혼합유기물 추가 시용구 (HV/R/MO)는 6월 20일에 4㎏/10a (질소함량 기준)의 혼합유기물 (4.5-1-1, 87㎏/10a)을 추가 시용하고 20 일 후 토양 샘플을 채취하여 다른 처리구와 같이 토양 분석을 실시하였다.

토양성분 분석은 각 처리의 토양을 표면에서 15㎝ 걷어낸 후, 처리 당 3 반복씩 채취하여 건조 후 2㎜ 채로 걸러 불순물을 제거하여 고운 흙을 분석에 이용하였다.

토양성분의 분석은 ‘농촌진흥청 국립원예특작과학원 시설원예연구소’에 의뢰하여 분석하였으며 토양질소는 암모니아태와 질산태 질소로 나누어 분석하였다.

질소고정량은 토양면적 (10 a)을 토양무게 (토양깊이 15㎝, 용적밀도 1.25㎎/㎥)로 환산하고 질소 분석치 (㎎/㎏)를 곱하여 계산하였다.

더덕 (Codonopsis lanceolata Trautv.)의 지상부 생육특성 조사는 각 처리 당 5 주를 1 반복으로 하여 3 반복으로 측정하였고, 지하부도 수확 후 각 처리 당 5 주를 1 반복으로 하고 3 반복으로 측정하였다. 지하부는 근장, 근경, 지근수, 생근중, 건근중의 항목으로 나누어 조사하였다.

수확한 더덕은 수세 후 물기를 제거한 다음 근장, 근경, 지근수, 생근중을 측정하고 건조기 (JSOF-050S, JS Research Ind., Gongju, Korea) 에 60℃, 48 시간 건조하여 건근중을 측정하고 분쇄하여 40 mesh 채로 걸러 추출시료로 이용하였다.

조사포닌의 추출 및 분획은 더덕 분말 10 g을 10 배의 70% MeOH (Daejung Chemicals and Metals Co., Ltd., Siheung, Korea)로 1 시간 2 회 Soxhelt (GL14pp connect-Kit, SciLab Korea, Seoul, Korea) 추출하여 여과 후 감압 농축 (R-520, Ilsin, Daejeon, Korea)하였다. 여기에 60㎖의 증류수를 가하여 회수한 후 물층과 동량의 n-hexane, ethly-acetate, n-butanol (Daejung Chemicals and Metals Co., Ltd., Siheung, Korea)을 순으로 분획을 하였고 이것을 2 회 반복하여 수행한 다음 여기에서 얻은 n-butanol층을 감압농축하고 동결건조 (FD8508, Ilshin Biobase, Dongducheon, Korea) 후의 무게를 조사포닌 함량으로 하였으며 이후 LC-MS/MS분석의 시료로 이용하였다.

조사포닌 (㎎/g)은 A-B/S; A [부탄올 층을 농축 건조한 플라스크 무게 (㎎)], B [빈 플라스크 무게 (㎎)], S [건물중 (g)]로 계산하였다.

LC-MS/MS (Qtrap, Ab Sciex Co., Framingm, MA, USA) 분석은 Ichikawa 등 (2009)의 방법을 참조하여 분석하였다.

Column은 YMC-Pack Pro C18 RS Column (150 × 2.0㎜ × I.D., 5㎛, YMC Korea Co., Ltd., Seongnam, Korea)을 사용하였고 column의 온도는 40℃로 설정하였다. 이 동상은 H₂O (0.1% formic acid) : acetonitrile (70 : 30, v/v; Daejung Chemicals and Metals Co., Ltd., Siheung, Korea)를 이용하여 유속을 0.2㎖/min, Column 온도는 40℃로 설정하여 injection volume 20㎕씩 주입하여 분석하였다.

Mass spectrometer는 negative ion과 selected-ion monitoring (SIM)하에서 작동하였다. Electrospray ionization (ESI) 는 4.5 kV의 spray voltage로 수행하였다. Capillary voltage와 tube lens offset은 각각 −40 V과 −130 V로 각각 고정하였다. Capillary temperature는 400℃로 고정하였다. Sheath gas와 auxiliary gas와 로 사용된 nitrogen은 각각 35, 5 arbitrary units로 유지하였다. Lancemaside A는 m/z 1,189, lancemaside B는 m/z 1,351, lancemaside B는 m/z 1,205, aster saponin Hb은 m/z 1,057로 분석하였다.

내부 표준물질로는 ginsenoside Rg1 (Ambo Institute, Daejeon, Korea)을 이용하여 최종농도를 0.01 ppm, 0.1 ppm, 1 ppm, 10 ppm농도로 희석하여 정량분석에 이용하였다.

본 연구의 실험데이터는 처리당 3 반복으로 측정하였고 (n = 3), 수집된 데이터는 SPSS Statistics 21 프로그램 (Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 일원배치 분산분석 (One-way ANOVA)을 실시한 후, Ducan’s Multiple Range Test (DMRT)을 통해 5%와 1% 수준에서 통계학적 유의성을 검정하였다 (*p < 0.05, **p < 0.01).

풋거름작물별 재배 후 토양의 이화학성을 조사한 결과 pH는 화학비료 (CF) 단용처리가 가장 낮았고 그 다음으로 헤어리베치 (HV)단용처리가 낮은 경향이었고, 전기전도도 (electric conductivity, EC)는 화학비료 (CF)와 헤어리베치/호밀/혼합유기물 (HV/R/MO) 처리에서 가장 높았고 그 외 처리 간에는 차이가 없었다 (Table 1).

인산 함량은 화학비료 단용처리가 가장 높았고, 그 다음이 헤어리베치 > 헤어리베치/호밀/혼합유기물 > 무처리 > 헤어리베치/호밀 순으로 높은 경향이었다. 치환성 양이온인 Ca, Mg, K의 함량은 처리구간 차이는 있었으나 그 차이는 미미한 수준이었다.

화학비료 시용에 따른 토양의 산성화는 본 시험에서도 확인할 수 있었고, 헤어리베치 처리에서도 토양이 다소 산성화되는 경향을 나타내었는데, Ortiz escobar 와 Hue (2008)는 토양 pH는 풋거름 작물의 유기질소의 무기화에 의해 방출된 NH₃⁺가 수분과 반응을 통해 OH⁻를 생성함으로써 분해 초기에는 토양 pH를 증가시키고 그 이후 질산화 작용 (nitrification)에 의해 NH₄⁺가 NO₃⁻로 변환됨으로써 H⁺를 발생함으로써 토양 pH를 감소시킨다고 보고하였다.

Lawson 등 (2013)도 호밀, 헤어리베치 단·혼용 처리 시 pH가 낮아지고 EC가 증가하는 것은 질소고정 과정에서 H⁺ 이온 활동의 증가와 관련이 있고, EC는 질소 축적에 따른 증가의 결과라고 보고하였다.

따라서 본 실험에서 헤어리베치를 함유하고 있는 처리에서 pH가 다소 낮고 EC가 높은 것은 이미 질산화 작용이 진행되고 있음을 짐작할 수 있다.

인산의 경우 화학비료 시용구에서 매우 높았는데 인산은 질소와 달리 용탈이 잘 안 되기 때문에 토양 중에 집적되는 것으로 보이며 (Anugroho et al., 2010), 헤어리베치와 같은 풋거름작물 재배에 따라 N, K₂O, Ca등과 더불어 토양 중에 많이 축적되는 것으로 보고되고 있다 (Sung et al., 2008).

특히 인산의 경우 논에서 헤어리베치를 재배할 경우 19.7㎏/ha 정도 생산되는 것으로 보고되고 있어 (Kim et al., 2013) 본 실험에서도 헤어리베치 단용처리가 헤어리베치/호밀혼용 및 헤어리베치/호밀/혼합유기물 처리보다 인산함량이 높은 것을 확인할 수 있었다. 혼용처리가 단용처리보다 낮은 것은 호밀이 함유된 혼용처리의 경우 호밀의 인산이용이 영향을 미쳤을 것으로 사료된다.

그 외 치환성 양이온은 풋거름작물 재배에 따라 다소 증가하는 것으로 보고 되고 있으나 본 실험에서는 Ca, Mg, K 등은 풋거름작물에 재배에 따른 처리 간 큰 차이를 나타내지 않았다.

Total 질소함량의 경우 헤어리베치에 의한 질소고정으로 인해 헤어리베치 처리와 헤어리베치/호밀 재배 후 추비처리인 헤어리베치/호밀/혼합유기물 처리에서 질소함량이 당연히 높았고, 헤어리베치/호밀 혼용처리보다 헤어리베치 단용처리에서 고정효과가 더 뛰어남을 알 수 있었다.

특히 화학비료 시용구보다 많은 질소를 함유하고 있었는데 화학비료 시용구는 강우에 의한 용탈이나 작물의 생장에 직접 이용되는데 반해 헤어리베치는 토양환원 후 유기태질소가 분해되어 암모니아태 질소와 질산태 질소와 같은 무기태 질소함량이 증가된 것으로 보인다 (Sung et al., 2008).

그리고 토양내 NO₃⁻는 양이온 형태인 NH₄⁺와 달리 음하전을 띠고 있어 토양 교질과 쉽게 흡착하지 못하므로 강우에 의해 용탈되거나 탈질작용에 의해 손실률이 NH₄⁺보다는 높은 것으로 알려져 있는 바 (Fenn and Hossner, 1985), 본 실험에서도 헤어리베치/호밀/혼합유기물 처리와 헤어리베치 처리에서 NO₃^- 함량이 높았고 이것은 적은 강수와 앞서 언급한 봐와 같이 NH₄⁺가 NO₃⁻로 변화는 질산화 작용과 관련이 있는 것으로 사료된다.

헤어리베치 단파와 헤어리베치/호밀 혼파의 파종시기에 따른 질소고정량을 조사하기 위해 9 월, 10 월, 11 월에 각각 파종한 결과, 파종시기가 빠를수록 질소고정량이 증대하였다 (Fig. 1).

Fig. 1.  Effects of green manure crops and additional fertilization application on nitrogen fixation and content in soil.

NT; Non-treatment, CF; Chemical fertilizer, HV; Hairy vetch, HV/R; Hairy vetch + rye, HV/R/MO; Hairy vetch + rye + mixed organic matter. CF indicates the amount of nitrogen content in soil by chemical fertilizer application at March. Vertical bars represent standard error of the means (n = 3). Percentage number shows the amount of nitrogen reduction compared with N standard amount of fertilizer (6㎏) in Codonopsis lanceolata cultivation.

이것은 Lim 등 (2011)이 헤어리베치는 파종시기가 늦을수록 초장이 짧아지고 엽수와 줄기수가 감소하여 결과적으로 건물중 감소로 이어진다는 연구결과와 일치한 결과를 나타내었다.

그리고 10월과 11월 파종은 단파와 혼파에서 큰 차이가 없었는데 이것은 앞서 언급한 것처럼 헤어리베치를 늦게 파종함으로써 질소고정을 위한 헤어리베치의 생육이 충분하지 못하였기 때문에 큰 차이가 없는 것으로 판단된다.

단·혼파 시 헤어리베치 단파 처리에서 5.7㎏/10a으로 가장 높았으며 그 다음이 헤어리베치/호밀, 무처리 순으로 낮아 혼파보다는 단파에서 질소고정량이 높은 것을 확인 할 수 있었다. 특히 헤어리베치 단파에서 5.7㎏의 질소고정은 더덕 재배 시 전량 기비로 시용할 경우 질소요구량의 94.2%를 차지하는 비율이다.

화학비료의 경우 3 월초에 기비로 4㎏/10a을 시용하였는데 30%가량이 작물이 이용되거나 용탈되어 약 2.89㎏ 정도 남아 있는데 반해 헤어리베치 처리는 상당량이 무기태 질소로 전환되고 있음을 알 수 있었다 (Fig. 1).

그리고 헤어리베치/호밀처리는 일찍 파종하였을 때도 질소 고정량이 헤어리베치 단파보다 낮은데 이것은 Kim 등 (2013)에 의하면 헤어리베치와 보리를 혼파할 경우 헤어리베치는 공중질소를 고정하여 이용하지만, 보리의 경우 대부분의 질소를 토양 내 질소를 이용하기 때문이라 하였다.

따라서 호밀과 같은 화본과 작물은 주로 질소고정효과보다 토양 개량 및 토양 물리성 개선에 주목적이 있기 (Lim et al., 2012) 때문에 헤어리베치와 호밀의 적정 파종비율을 조절함으로써 토양개량과 질소고정량을 증대 시킬 수 있을 것이라 판단된다. 벼의 경우 보리 (75%) +헤어리베치 (25%)를 혼파한 경우 수량이 약 7%가량 증대하는 것으로 보고 되고 있어 (Kim et al., 2013) 더덕에 있어서도 헤어리베치와 호밀의 적정파종비율 연구는 추가로 수행되어져야 할 것으로 보인다.

더덕의 표준시비량은 N-P-K: 6-6-6㎏/10a이나 척박한 토양에서는 좀 더 많은 시비를 권장하고 있다 (RDA, 2009). 본 실험에서도 더덕의 표준 추비시기에 맞추어 정식 후 70 일경 추비로 혼합유기물을 4㎏/10a을 시용하였을 경우 전체 질소공급량은 8.7 ㎏로 전체 질소공급량인 6㎏보다 45% 정도 초과하는 것을 나타나 헤어리베치 재배와 혼합유기질 비료 시비로 충분히 화학비료를 대체 할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이것은 헤어리베치에 의한 질소고정량이 5.7㎏/10a인데 2달 동안 작물이 이용되거나 용탈된 것은 약 30%정도로 헤어리베치의 분해 속도가 매우 느린 것으로 판단된다.

헤어리베치의 경우 경운 후 70 일 후 질소함량이 모두 분해된다는 보고가 있는 반면 (Lim et al., 2014), 토양 중 질소함량이 30 일경이 최고를 기준으로 120 일까지 서서히 감소한다고는 보고 (Sung et al., 2008)등 대기 환경 및 토양조건에 따라 분해속도가 상당히 다른 것으로 보인다.

따라서 본 실험에서는 토양 중 질소함량이 높음에도 불구하고 질소 과잉에 의한 증상이 발생하지 않는 것으로 보아 토양물리성 개선에 따른 지속적인 질소 공급으로 더덕의 생육을 촉진시킬 수 있었던 것으로 판단된다.

더불어 풋거름작물의 혼합비율에 따른 질소고정량 및 혼합유기물 추비 시용량에 따라 질소 공급량의 조절이 가능하기 때문에 이것과 더덕 생육과 관련된 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.

풋거름작물 재배에 따른 더덕 (Codonopsis lanceolata Trautv.)의 지상부 생육을 조사한 결과 초장은 헤어리베치/호밀/혼합유기물 처리에서 가장 우수하였고, 그 다음은 헤어리베치 > 헤어리베치/호밀 =화학비료 > 무처리 순으로 생육이 우수한 경향이었다 (Fig. 2). 그러나 풋거름작물과 화학비료 처리구간에 경경은 뚜렷한 차이는 없었다.

Fig. 2.  Growth characteristics of Codonopsis lanceolata under cultivation of green manure crops and additional fertilization application.

NT; Non-treatment, CF; Chemical fertilizer, HV; Hairy vetch, HV/R; Hairy vetch + rye, HV/R/MO; Hairy vetch + rye + mixed organic matter. *Vertical bars represent standard error of the means (n = 3). Different letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan’s Multiple Range Test (DMRT).

풋거름작물 재배에 따른 지하부 생육을 조사한 결과 근장과 근경은 모든 풋거름작물 처리에서 무처리 보다 높았다 (Table 2).

그러나 풋거름작물 처리 내 단·혼파 및 추비처리구간 차이가 없었으나 헤어리베치/호밀/혼합유기물 처리에서 다소 높은 경향이었고, 지근수는 무처리와 더불어 큰 차이가 없었다.

생근중은 무처리를 제외하고는 통계적으로 유의한 차이가 없었으나 헤어리베치/호밀/혼합유기물 처리에서 가장 우수한 경향을 보였으며, 그 다음이 헤어리베치 단용처리, 헤어리베치/호밀 혼파, 화학비료 순이었다. 건근중과 조사포닌 함량은 다른 처리에 비해 헤어리베치/호밀/혼합유기물와 헤어리베치 처리에서 높은 경향이었다. 이것은 풋거름 작물의 질소고정효과 및 추비시용이 더덕의 생육에 관여하는 것으로 보인다.

Moon 등 (2018)은 더덕의 혼합유기질 비료 시비가 화학비료에 비해 더덕의 지상부 생육 및 수량을 증대시킨다고 하였고, Jeon 등 (2016)은 같은 초롱꽃과인 도라지에서도 유기질비료 시용에 의해 도라지 수량이 증대된다고 하였다.

또한 인삼에서 유기질 비료시용이 수량과 정의 상관이 있다고 하였고 (Lee et al., 1984), 당귀, 지황, 토천궁, 작약, 맥문동 재배 시 유기질 비료 시용에 의해 건근중 및 상품수량이 11 - 34% 증수되고, 유기질 비료 시용에 의한 생육증대로 뿌리의 약효성분이 높아져 수량성과 품질이 향상된다고 하였다 (Choi et al., 1989; Lee et al., 2007; Kim et al., 2014b).

따라서 더덕 재배시에 풋거름작물 재배 및 추비로 유기질비료 시용은 지상부 및 지하부 생장을 유리하게 하여 더덕의 생육과 수량을 증가시킨다고 판단된다.

풋거름작물 재배 및 추비시용 따른 더덕의 주요 사포닌을 조사한 결과 lancemaside A가 모든 처리에서 가장 높아 lancemaside A가 더덕의 주 사포닌임을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 그 다음으로 aster saponin이 높았고, lancemaside B, G는 소량 존재하는 것으로 나타내었다.

Fig. 3.  Lancemasides content in Codonopsis lanceolata roots under under cultivation of green manure crops and additional fertilization application.

Lan A, B, G and Aster indicate lancemaside A, B, G, and Aster saponin Hb, respectively. NT; Non-treatment, CF; Chemical fertilizer, HV; Hairy vetch, HV/R; Hairy vetch + rye, HV/R/MO; Hairy vetch + rye + mixed organic matter. Vertical bars represent standard error of the means (n = 3). ^NS,*,**Indicate non-significant and significant at p < 0.05 or < 0.01, by Duncan’s Multiple Range Test (DMRT).

Ichikawa 등 (2009)은 더덕의 주요한 사포닌은 lancemaside A이며 이외에 lancemaside B, C, E, G, foetidissimoside A, aster saponin Hb 등이 존재한다고 하였고, Kim 등 (2014a)은 5 종의 triterpene saponin을 보고하였는데 본 연구에서는 lancemaside A, B, G 및 aster saponin Hb를 포함한 4 종의 사포닌만이 검출되었고, 나머지 사포닌들은 극미량 존재하거나 또는 검출되지 않았다. 이것은 Ichikawa 등 (2009)이 한국산 더덕과 일본 더덕에서 사포닌 차이가 존재한다고 한 것처럼 시료와 추출방법의 차이에 기인하는 것으로 사료된다.

Lancemaside A는 처리간 통계적으로 유의하지 않지만 헤어리베치/호밀/혼합유기물 > 헤어리베치 > 헤어리베치/호밀 > 화학비료 > 무처리 순으로 높은 경향이었다. Lancemaside B와 G는 소량 존재하였고 처리 간 차이가 거의 없었다.

Aster saponin은 헤어리베치/호밀/혼합유기물 처리에서 가장 높았고, 그 다음으로 화학비료 > 헤어리베치/호밀 > 무처리 > 헤어리베치 처리 순으로 높은 경향이었다. 따라서 전체 lancemaside 함량은 헤어리베치/호밀/혼합유기물 처리에서 가장 높았으며 그 다음이 헤어리베치, 헤어리베치/호밀, 화학비료, 무처리 순으로 높았다.

이것은 Fig. 3과 Table 2에서와 같이 헤어리베치/호밀/혼합유기물 처리와 헤어리베치 처리에 의해 지상부 및 지하부 생육이 우수할수록 사포닌 함량은 높아지는 경향을 보여 더덕의 생육과 사포닌 함량간의 밀접한 관련이 있는 것으로 사료된다.

따라서 화학비료 절감을 위한 더덕 재배 시 헤어리베치 단용처리나 헤어리베치/호밀 처리 후 추비로 친환경 재료인 혼합유기물을 시용하는 것이 토양개량효과 및 토양 내 질소고정량을 향상시켜 더덕의 생육을 향상시키고 이로 인한 수량 증대 및 사포닌 함량이 증대되는 것을 확인할 수 있었다.

헤어리베치 단용처리 후 혼합유기물 시용도 헤어리베치/호밀 혼합처리 효과와 같을 것이라 판단되나 토양이화학성을 고려한다면 혼합처리가 필요하다고 보여진다. 더불어 헤어리베치와 호밀의 혼파 시 파종 비율에 따른 질소고정량 및 이에 따른 혼합유기물의 추가 시비량 등에 관한 추가연구가 필요할 것으로 판단된다.