실험에 사용된 갈근탕정은 경방신약주식회사에서 구매하였으며 갈근탕의 구성 및 추출 수율은 테이블에 표기하였다 (Table 1). 갈근탕정은 믹서를 이용해 분쇄하고, 일정 농도가 되도록 멸균수에 완전히 녹여 사용하였다.

본 시험은 의약품등의독성시험기준 (식품의약품안전청 고시 제 2015-82호), 한약[생약]제제 비임상시험기준 (식품의약품안전청 고시 제 2016-112호), 소아용의약품의 비임상 안전성 평가지침의 의약품평가지침 23 (식품의약품안전청) 및 2008년 1월 기준 유럽의약품기구 지침인 의약품의 동물에 대한 비임상검가 지침을 준수하여 실험을 진행했다.

동물은 13 주 반복 경구투여 평가를 위해 실험군당 15 마리씩 배정하였고, 반복 투여가 끝난 뒤 4 주 회복 평가를 위해 10 마리를 제외한 나머지 5 마리를 배정하였고 실험군은 정상대조군 (0), 저농도 갈근탕 투여군 (1,000㎎/㎏ GT 1,000), 중농도 갈근탕 투여군 (2,000㎎/㎏ GT 2,000) 및 고농도 갈근탕 투여군 (4,000㎎/㎏ GT 4,000)으로 실험군을 분리하고 매일 오전에 경구투여용 존데를 이용하여 13 주 동안 1 일 1 회 경구투여하였다. 13 주 반복 경구투여가 끝난 뒤 정상 회복군 (0R) 및 고농도 갈근탕 투여 회복군 (GT 4,000R)으로 분리하여 회복평가를 진행하였다.

본 시험은 동물보호법 (제정 1991년 5월 31일 법률 제 4379호, 일부개정 2015년 1월 20일 법률 제 13023호)에 근거하여 한약진흥재단 한약자원본부 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다 (승인번호: 2017-01-13). 실험동물은 3 주령 수컷 SD (Sprague-Dawley) 랫드를 Orientbio (Seongnam, Korea)에서 구입하였다. 반입 시 전체 동물에 대한 외관 검사를 실시한 뒤 체중을 측정하였다. 순화기간 동안 매일 1 회 야윔, 사망, 식욕부진, 거식 및 배설상태를 포함한 일반증상을 관찰하였으며, 순화기간 종료일에 체중을 측정하고 일반증상과 체중변화를 확인해 동물의 건강상태를 평가하였다. 순화기간 동안 발견된 이상동물은 CO₂ 가스를 이용해 안락사 시켰다. 사육 조건은 온도 (20 ± 2℃), 습도 (55 ± 5%), 명암조건 (12 시간) 및 조도 (150 - 300 Lux)로 설정한 뒤 사육하였고 실험동물용 고형사료인 Teklad global 18% protein rodent diet (2918C, Harlan Laboratories Inc., Indianapolis, IN, USA)와 장흥군 수돗물을 필터유수살균기로 여과한 뒤 자외선을 조사하고 자유섭취 하였다.

통계처리는 SPSS (Chicago, IL, USA)을 사용하여 통계처리 했다. 평균값과 표준편차를 구하였다. 시험군 간 평균 차이를 검증하기 위해 일원배치 분산분석 (One-way ANOVA)을 한 뒤 Tukey-Kramer Multiple Comparison Test를 이용해 유의수준 5%에서 통계적인 차이를 검증하였다 (p < 0.05).

정상대조군 및 갈근탕을 투여한 모든 시험동물은 빈사 또는 사망동물이 발생하지 않았고. 하루에 한번 식욕부진, 거식, 배설상태와 같은 일반증상을 평가하였을 때 이상소견이 나타나지 않았다 (Table 2).

갈근탕 13 주 경구투여 및 4 주 회복기간 동안 실험동물들의 체중을 측정하였을 때, 투여 첫 주에 암수 모두 갈근탕 투여에 따른 유의적인 체중변화가 관찰되었지만 이는 일시적인 변화로 생각되며, 반복투여 13 주째에 암수 모두에서 정상대조군과 비교했을 시 유의적인 체중변화는 관찰되지 않았다 (Table 3). 회복평가에서 4 주째에 암컷 정상대조군 (female, G5, 0R)에 비해 암컷에 대한 4,000 ㎎/㎏ 갈근탕 회복군 (female, G6, GT 4,000R)의 유의적인 체중감소가 나타났다. 이는 정상대조군 대비 약 13% 정도 체중이 감소하였다.

갈근탕 경구투여 13 주 및 4 주 회복기간 동안 암수 모두에게서 평균 사료섭취량을 측정한 결과. 반복투여 4 주째에 암컷에 대한 2,000 ㎎/㎏ 갈근탕 투여군 (female, G3, GT 2,000)에서 평균사료섭취량이 유의적으로 증가된 것으로 나타났지만, 이는 매우 미미하고 개체차이로 보이며 5 주째에 정상대조군과 비교하였을 때 차이가 나타나지 않음에 따라 독성에 의한 변화가 아닌 것으로 사료된다. 또한 모든 시험군은 연령증가에 따라 자연스럽게 평균사료섭취량이 상승하는 경향을 나타내었다 (Table 4).

정상대조군과 비교하여 13 주 동안 갈근탕 경구투여시 1,000 ㎎/㎏ 농도부터 요단백 (protein) 수치가 증가하는 경향이 암수 모두에게서 나타났지만 이는 4 주 회복평가기간에 모두 정상적으로 회복되었다. 암컷에 대한 갈근탕 투여군 모두 bilirubin 수치가 농도대비 증가되었으나 회복평가기간동안 수치변화가 나타나지 않았다 (Table 5). 종합하면 갈근탕 경구투여는 투여기간동안 요단백 및 bilirubin 수치에 영향을 미치는 것으로 나타났지만 이는 갈근탕 투여를 중지하면 정상적으로 회복되는 것으로 확인되었다.

시험동물 부검 시 채취한 전혈에 대해 혈액학적 검사를 수행한 결과 암컷에 대한 2,000 ㎎/㎏ 갈근탕 투여군 (female, G3, GT 2,000)에서 RBC와 HGB 수치가 유의적으로 감소된 것으로 나타났지만 이는 실험군 내에서 오차가 크기 때문에 개체차이인 것으로 사료되며 이를 제외한 여러 투여군은 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다 (Table 6).

시험동물 부검 시 채취한 혈청에 대해 혈액생화학적 검사를 수행한 결과 수컷에 대한 갈근탕 4,000 ㎎/㎏ 농도로 투여군은 정상대조군과 비교하여 AST, BUN 및 CRE 수치가 유의적 증가되었지만 증가량은 미미하였다. 하지만 회복평가기간 동안 모든 수치는 정상적으로 회복되는 것으로 나타났다. 암컷 실험군은 갈근탕을 2,000 또는 4,000 ㎎/㎏ 농도로 투여하였을 때 혈액생화학적 인자들이 증가되는 것으로 나타났지만, 수컷 실험군과 마찬가지로 회복평가기간동안 모두 정상적으로 회복되었다 (Table 7).

암컷 동물의 성주기를 검사한 결과 모든 실험군에서 정상대조군과 비교하여 정상적인 발정주기를 보였으며 (100%), 발정기부터 다음 발정기까지 기간은 각각 2.4, 2.0, 2.4 및 2.6 일로 정상대조군 및 갈근탕 투여군간 유의적인 차이는 나타나지 않았다 (Table 8).

모든 실험동물에 대해 안락사를 실시한 뒤 5 분 이내에 부검을 실시하였다. 전신의 장기에 대한 육안검사를 진행한 결과 출혈, 비대, 위축과 같은 이상소견은 관찰되지 않았다 (Table 9). Rat 부검 시 흔하게 찾아볼 수 있는 가슴샘의 발적과 같은 증상도 확인되지 않은 것으로 보아 갈근탕의 투여가 암수 모두에서 장기에 대한 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.

부검을 진행한 뒤 실험동물의 자궁 (uterus), 난소 (ovary), 고환 (testis), 정소 (epididymis), 간 (liver), 심장 (heart), 비장 (spleen) 및 신장 (kidney)의 절대 장기중량과 정강뼈의 둘레 및 길이를 측정한 결과, 수컷에 대한 4,000 ㎎/㎏ 갈근탕 회복군 (male, G6, GT 4,000R)은 회복주 수컷 정상대조군 (male, G5, 0R)과 비교하였을 때 심장에 대한 습중량의 차이가 나타나지 않았지만 절식체중에 비례한 상대장기 중량비가 감소된 것으로 나타났다. 하지만 이는 개체별 오차범위가 다른 값과 비교하여 크기 때문에 개체차이 인 것으로 사료된다. 암컷에 대한 4,000 ㎎/㎏ 갈근탕 투여군 (female, G4, GT 4,000)은 정상대조군 (female, G1, 0)과 비교하여 비장의 상대장기 중량비가 유의적으로 증가된 것으로 나타났지만 증가량이 매우 미미하였고 습중량의 차이는 나타나지 않았다. 암컷에 대한 4,000 ㎎/㎏ 갈근탕 회복군 (female, G6, GT 4,000R)은 암컷 정상대조군 (female, G5, 0R)과 비교하여 심장, 폐, 신장의 상대장기 중량비와 정강뼈의 길이와 두께의 상대비가 증가되는 것으로 나타났지만 습중량의 차이는 없었다 (Table 10, 11).