본 연구에서 사용한 도깨비부채 (Rodgersia podophylla)는 경기도 일대에서 채취된 것을 경희대학교 한의과대학 본초학 교실 김호철 교수 연구팀으로부터 검증 및 제공받아 사용하였다. 도깨비부채의 뿌리를 분리하여 증류수로 세척한 후 비건조 시료는 바로 파쇄하고 95% 에탄올을 사용하여 교반 및 초음파 추출하였으며, 건조시료는 50℃에서 열풍건조 후 파쇄하고 95% 에탄올을 사용하여 교반 및 초음파 추출하였다. 교반추출은 overhead stirrer (EYELA Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 상온에서 1 시간씩 3 회 반복 추출하였으며 초음파 추출은 ultrasonicator (Branson Ultrasonics Co., Danbury, CT, USA)를 사용하여 상온에서 1 시간씩 3 회 반복 추출 하였다. 추출액은 여과 후 감압 농축하여 -20℃에 보관하면서 실험시료로 사용하였다.

마우스 유래의 멜라닌 생성세포인 Melan-A 세포는 cancer research사 (London, England) 로부터 분양받아 사용하였다. 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA), 200 nM의 phorbol-12 myristate 13-acetate (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 가 함유된 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. Melan-A 세포 (1 × 10⁵ 개)를 24 well plate에 접종하고 24 시간동안 배양한 후 각각의 농도로 용매 (propylene glycol : EtOH : H₂O = 5 : 3 : 2)에 녹인 10 ㎕의 도깨비부채 시료를 1 일 1 회 새로운 배지와 함께 3 일간 처리하였다.

마지막 처리 24 시간 후에 배지를 제거하고 세포를 phosphate buffer saline (PBS)로 세척하였다. 10% 에탄올에 녹인 0.1% crystal violet 200 ㎕를 첨가하고 5 분간 상온에서 배양하여 살아있는 세포를 염색하였다. 염색된 세포를 증류수로 2 번 세척하고 1 ㎖의 에탄올을 첨가하여 10 분간 교반한 뒤 microplate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland)를 사용하여 590 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

마지막 처리 24 시간 후에 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척 하였다. 각 well 당 1 ㎖의 1 N NaOH 를 가하고 교반하여 멜라닌을 녹인 후 microplate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland)를 사용하여 400 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

Phosphate buffer (67mM, pH 6.8)에 녹인 8.0mM levodopa (L-Dopa) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 120 ㎕와 여러 농도로 메탄올에 녹인 도깨비부채 시료 40 ㎕를 96-well plate에 넣어 섞은 후 phosphate buffer (67 mM, pH 6.8)에 녹인 125 U/㎖ mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 용액 40 ㎕를 첨가하여 37℃에서 30 분간 배양한 후 생성된 dopachrome의 양을 microplate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland)를 사용하여 490 ㎚에서 측정하였다.

도깨비부채 시료를 Melan-A 세포에 3 일간 처리 후 lysis buffer로 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질 50 ㎍ 을 8% SDS-polyacrylamide gel을 사용하여 전기영동 후 tyrosinase 및 TRP-2 primary antibody 와 anti-goat secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)를 사용하여 배양 후 enhanced chemiluminescence (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 검출하였다.

각 실험결과는 평균 ± 표준편차 (means ± SD)로 표시하였으며 GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA, Tukey Multiple Comparison으로 분석하였고 p-value < 0.05일 때 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

건조하지 않은 도깨비부채 (Rodgersia podophylla) 뿌리와 열풍 건조된 도깨비부채 뿌리를 파쇄 후 동일량의 에탄올을 가하고 각각 교반 추출 및 초음파 추출하여 도깨비부채 뿌리 추출물을 제조하였다. 제조된 도깨비부채 추출물의 멜라닌 생성 억제효과를 Melan-A 세포를 이용하여 측정한 결과는 Fig. 1에 나타내었다.

Fig. 1.  Effects of Rodgersia podophylla root extracts on cell viability and melanin production in Melan-A cells.

(A); effect on cell viability. (B); effect on melanin production. RP-HD-SO; Rodgersia podophylla root extracted using ultrasonic after hot air drying, RP-HD-ST; Rodgersia podophylla root extracted using stirring after hot air drying, RP-ND-SO; non-drying Rodgersia podophylla root extracted using ultrasonic, RP-ND-ST; non-drying Rodgersia podophylla root extracted using stirring. Data represent the mean of triplicate experiments. *p < 0.05 and **p < 0.01 compared with untreated group. ^a-cMean values with different superscripts are significantly different among the groups (p < 0.05).

건조 여부에 따른 멜라닌 억제활성을 비교하여 보면 초음파추출 방법으로 추출한 건조하지 않은 도깨비부채 뿌리 시료가 100 ppm 에서 세포독성 없이 18.3%의 멜라닌 생성을 억제하여 열풍 건조한 시료의 3.3% 보다 높은 멜라닌 억제 활성을 나타내었다. 또한 교반추출 방법으로 추출한 도깨비부채 뿌리 시료 역시 건조하지 않은 시료가 열풍 건조한 시료보다 높은 멜라닌 억제활성을 나타내어 건조하지 않고 추출하는 것이 멜라닌 억제 활성이 높은 추출물을 제조하는데 유리한 것으로 판단된다.

또한 교반 추출 방법과 초음파 추출 방법을 사용하여 도깨비부채 뿌리 시료를 추출하였을 때 건조하지 않은 시료와 열풍건조 시료 모두에서 교반 추출 시료가 높은 멜라닌 억제 활성을 나타낼 뿐만 아니라 추출 수율도 초음파 추출 (1.1%) 보다 교반 추출 (2.1%)이 높았다. 따라서 도깨비부채 뿌리 추출물 제조시 에는 초음파 추출보다는 교반 추출하는 것이 멜라닌 억제 활성 및 수득율 측면에서 유리한 것으로 판단된다.

Kim 과 Lee (2015)는 melanoma 세포인 B16F10 cell에서 미선나무 70% 에탄올 추출물의 멜라닌 억제활성이 추출 전 초음파 처리에 의해 유의적인 큰 변화가 없다고 보고한 바 있다. 그러나 본 연구와는 추출온도 및 처리시간 등의 추출조건이 다르고 도깨비부채 뿌리와 미선나무 함유성분의 초음파 처리후의 특성이 상이하여 나타나는 차이라 추측된다.

채취시기에 따른 멜라닌 억제 활성의 차이를 알아보기 위해 5월, 8월, 11월에 채취된 도깨비부채 뿌리를 건조하지 않고 교반하여 추출물을 제조한 후 멜라닌 억제 활성을 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 측정 결과 8월에 채취된 도깨비부채 뿌리 추출물이 가장 높은 멜라닌 억제 활성을 나타내었으며 3 일간 처리 후의 Melan-A 세포사진은 Fig. 3에 나타내었다. 특히 8월에 채취된 도깨비부채 뿌리 추출물을 100 ppm으로 처리 시 39.6%의 멜라닌 억제 활성을 나타내었고 이는 알부틴의 27.5%와 비교할 때 통계적으로는 유의하지 않았으나 높은 경향을 나타내었다. 이상의 결과를 볼 때, 도깨비부채 뿌리 추출물 제조 시 에는 8월과 같은 기온이 높은 여름에 채취하여 추출하는 것이 멜라닌 억제활성이 높을 것으로 판단된다.

Fig. 2.  Cell viability and melanin inhibition of non-drying Rodgersia podophylla root stirring extracts by collection time.

(A); effects on cell viability. (B); effect on melanin production. RP-M; Rodgersia podophylla root extract corrected in May, RP-A; Rodgersia podophylla root extract corrected in August, RP-N; Rodgersia podophylla root extract corrected in November. Arbutin was used as positive control. Data represent the mean of triplicate experiments. *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 compared with untreated group. ^a-bMean values with different superscripts are significantly different among the groups (p < 0.05).

Fig. 3.  Melan-A cells image after 3 days treatment with Rodgersia podophylla root extract corrected in August (magnification 200 ×).

(A); untreated cells, (B); 100 ppm of RP-A (Rodgersia podophylla root extract corrected in August) treated cells.

Melan-A 세포에서 가장 우수한 멜라닌 억제활성을 나타낸 도깨비부채 뿌리를 8월에 채취하여 건조하지 않고 교반 추출한 시료가 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 측정한 결과 100 ppm 농도에서 37.8%의 활성억제를 나타내었고, 동일 농도에서 Melan-A 세포내의 tyrosinase 발현량을 효과적으로 감소시켰다 (Fig. 4).

Fig. 4.  Tyrosinase inhibitory effect Rodgersia podophylla root extract corrected in August (RP-A).

(A); inhibitory effect on tyrosinase activity, (B); inhibitory effect on intracellular tyrosinase level in Melan-A cells. Data represent the mean of triplicate experiments. *p < 0.05 and **p < 0.01 compared with untreated group. ^a-bMean values with different superscripts are significantly different among the groups (p < 0.05).

따라서 본 연구에서 제조된 도깨비부채 뿌리 추출물은 멜라닌 생합성 과정의 초기에 주요한 역할을 하는 tyrosinase (Lai et al., 2018)의 활성 및 발현량을 억제함으로써 생성되는 멜라닌의 양을 감소시키는 것으로 확인하였다.

이러한 결과를 종합하여 보면, 본 연구에서 제조된 도깨비부채 뿌리 추출물은 Melan-A 세포에 100 ppm 농도로 처리 시 39.6% 의 멜라닌 억제 활성을 나타내어 이전 연구 (Choi et al., 2006)에서 보고된 도깨비부채 뿌리 추출물의 24.6% 비하여도 멜라닌 생성 억제효과가 더욱 개선되었고 tyrosinase 억제효과 역시 높았다.

따라서 도깨비부채 뿌리를 8월에 채취하여 건조하지 않고 교반 추출하는 것이 멜라닌 억제 활성 증가에 긍정적인 조건일 것으로 사료되며 향후 활성성분 규명 및 추출조건에 대한 함량변화에 대한 추가연구를 진행할 예정이다.