본 실험은 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 환경조절온실에서 2020년 2월과 6월 사이에 수행하였다. 1년생 재래종 묘삼 (Panax ginseng C. A. Meyer)을 2019년 겨울에 농가에서 구입하여 -3℃에 저장한 후 실험 전 일주일 이상 2℃에서 두어 천천히 녹인 다음 0.6 g - 0.8 g 크기의 묘삼을 재료로 사용하였다.

실험구는 51 ㎝ (너비) × 33 ㎝ (길이) × 20 ㎝ (높이) 화분에 인삼 전용상토 (Hwanggmpuri, Nongkyung, Jincheon, Korea)를 담고 묘삼을 4 행 × 6 열로 24 주를 이식하여 3 반복으로 조성하였다. 환경조절온실은 광투과율을 20%로 하는 차광막과 지열 냉난방 시스템을 이용하여 일사량과 온도를 조절하였고, 실내 온도가 28℃가 넘을 때는 보온 커튼을 조절하여 온도 상승을 억제하였다. 시험 기간동안 온실 내 평균온도는 2월부터 점차 증가하여 18.6℃ - 23.0℃ 범위였다.

저온처리는 −2℃ 또는 −4℃로 설정된 저온 저장고 (Serbingo, Cheonan, Korea)에 인삼이 60% - 80% 출아하였을 때 처리 시간별 (2, 4, 6, 8 h, 또는 16 h)로 1 회 넣었다 꺼내어 다시 온실로 옮기는 방식으로 하였다. 저온처리 시기에 출아한 인삼은 출아를 시작한 것, 잎 전개중인 것 (expanding), 완료된 것 (expanded) 등이 혼재하였다.

저온고의 평균 상대습도는 약 66%로 저온고 전체의 습도를 높이기는 어려워 토양수분 증발을 이용하여 극소적으로 고습 환경을 조성하기로 하였다. 17 ㎝ (높이) × 10 ㎝ (상면 직경) 크기의 플라스틱 컵에 공기구멍을 뚫고 개별 출아 인삼에 씌워 상대습도를 높였다. 화분당 약 10 개의 인삼에 플라스틱컵을 덮어 대조구와 고습처리가 동일 화분에서 이루어지게 하였다. 저온처리 시 온·습도는 EasyLog USB (Lascar Electronics Ltd., Wiltshire, UK)을 이용하여 별도의 실험에서 조사하였는데 컵 내부의 온도는 천천히 낮아져서 최종 -3℃였고 상대습도는 95%에 이르렀다 (Fig. 1).

Fig. 1.  Temperature (A) and relative humidity (B) in the cold room (line) and in the plastic cup (dash) for cold treatment on ginseng seedlings.

식물의 손상 정도에 따라 점수를 다음과 같이 부여하여 저온처리 1 주일 후에 양호도 (healthiness)를 조사하였다 [‘1’, 전체 고사, ‘2’, 심한 손상 (50%이상), ‘3’, 부분손상 (생육부진 또는 50% 이하), ‘4’, 양호] (RDA, 2018). 피해율 (damage rate)은 양호도 중 ‘1’, ‘2’, ‘3’을 피해구로 보고, 화분별 출아한 전체 주수에 대한 이들 피해 개체수 합의 백분율을 구하여 (피해주수/전체 주수 × 100) 3 반복에 대한 평균을 산출하였다.

저온피해를 유발하는 생육 특징을 조사하기 위해서 16 시간, -4℃를 처리한 후 바로 피해주와 양호주를 회수하여 생육을 조사하였다. 저온처리가 생육에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 저온처리를 실시한 날부터 한달 후에 조사하였다.

근경은 버어니어캘리퍼스 (Mitutoyo, Aurora, IL, USA)로 측정하였다. 경장은 뇌두 바로 위부터 잎자루 착생부까지의 길이를 측정하였고, 엽장과 엽폭은 가장 큰 잎의 길이와 폭을 측정하였다. 지상부 무게는 잎과 줄기를 포함한 생체 무게를 측정하였다.

엽록소 형광반응은 -4℃를 16 시간 처리하고 1 주일 후 대조구, 저온 처리구 중 양호구, 피해구로 나누어 리프클립 (leaf clip)으로 30 분간 암처리를 한 후 엽록소 형광을 측정하였다 (FP-100, Photon Systems Instruments, Drasov, Czech Republic). Photosystem II의 양자수율 (quantum yield)은 포화광 펄스에 의한 초기형광 (F_o)과 최대형광 (F_m)으로부터 구해지는데 (F_v/F_m = (F_m − F_o)/F_m) 본 실험에서는 측정기에서 제공되는 값을 사용하였다. 엽록소 함량도 저온처리 1 주일 후 엽색계 (SPAD-502Plus, Konica Minolta Inc., Tokyo, Japan)를 이용하여 조사하였다.

통계분석은 SAS v9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 ANOVA분석을 수행 후 DMRT (Duncan’s Multiple Range Test)을 이용하거나 (p < 0.05), Student t-test를 이용하여 유의성을 검정하였다 (p < 0.05).

2018년 4월 8일 저온 피해가 컸던 장수의 야간 기온을 바탕으로 2년생 인삼 (Panax ginseng C. A. Meyer)의 출아기에 -2℃와 -4℃에서 2, 4, 6, 8 시간 동안 저온을 처리하였으나 저온처리구는 대조구와 비교하여 뚜렷한 손상을 받지 않았다 (Table 1).

온도가 영하로 떨어지더라도 얼음이 형성되지 않을 수 있는데 이를 과냉각 (supercooling)이라고 한다. 과냉각은 얼음이 형성되기 위한 빙결핵 (ice nucleating agent)이 없을 때, 물의 양이 극소량일 때, 세포 내 삼투물질에 의한 방해 등에 의해서도 일어난다 (Hopkins and Hüner, 2003; Keller, 2010).

인삼 지상부의 동결온도에 대해서는 알려진 바가 없지만, 지하부는 -5℃에 24 시간동안 노출시켜도 얼지 않았으나 -10℃에서는 5 시간 안에 심한 손상을 받는다고 하였다 (Lee and Proctor, 1996). 또한 대부분의 작물에서 동결 피해는 주로 복사 냉각에 의해 발생하는데, 이를 구현하기 위해 복사냉각이 가능한 장비를 사용하여 좀 더 정확한 냉해 조건을 조사하기도 한다 (Fuller and Le Grice, 1998; Lu et al., 2019). 그 외에도 습도, 바람, 포장이 위치한 곳의 극소적 기상조건 등 여러 요소가 저온 피해에 영향을 줄 수 있으므로 설정 최저온도가 -4℃로 한정된 저온저장고에서는 노지에서와 같은 동결피해 양상을 구현하기 어려웠을 것으로 생각된다 (Boostma and Brown, 1985; Cameron and Dixon, 1997; Keller, 2010; RDA, 2018).

위와 같은 이유로 저온처리 시간을 늘려 예비실험을 하였을 때 저온처리 16 시간에서 일정 정도의 피해가 관찰되어 이후 저온처리는 -4℃에서 16 시간 동안 하였다. 저온을 처리하였을 때 나타나는 증상으로는 전체적 또는 부분적으로 괴사하거나, 엽맥 주위로 황화가 시작된 후 점차 잎 전체가 황화되는 것이 관찰되었다. 드물게 잎의 피해가 뚜렷이 드러나지 않지만 팽압이 감소하거나, 잎이 주름져있는 경우도 있었다 (Fig. 2).

Fig. 2.  Symptoms of leaf damage 1 week after cold treatment of cold at -4℃ for 16 h.

(A); normal, (B); leaf withering, (C); leaf chlorosis, (D); leaf shrinkage, (E); leaf damage, and (F); death.

16 시간 동안 -4℃에서 저온을 처리하였을 때 최종 피해율이 21.4%였으며, 대조구는 잎발달이 불량한 개체가 있어 피해율이 2.9%였다. 저온처리구 중 피해를 받지 않은 나머지는 상태가 매우 양호하였는데 이들을 모두 포함하여 양호도를 조사한 결과 대조구는 3.94였으나 저온 처리구는 3.53으로 대조구보다 11.6% 낮았다 (Table 2). 반면 컵을 덮어 씌어 습도를 높여준 고습처리구는 피해율이 59.9%로 저온만 처리한 것보다 2.8 배 높았으며, 양호도도 2.85로 대조구보다 20% 낮았다 (Table 2).

-4℃에서 16 시간 저온을 처리하여 피해율이 증가하였지만 20% 내외로 양호구가 더 많아 인삼 지상부의 동결 피해온도는 더 낮은 곳에서 형성되거나, 다른 요소가 관여할 여지가 있다. 위 실험결과로 보면 대기 중 습도가 한 예일 것으로 생각된다. 고습 조건에서 형성된 이슬은 빙결핵 (ice nucleating agent)으로 작용할 수 있다. 이슬, 강우 등으로 잎표면이 젖거나, 병원균과 같은 이물질이 잎 표면에 있을 때도 빙결핵으로 작용하여 0℃보다 약간만 낮아도 얼음 결정이 형성되는데 이후 기공, 배수조직 (hydathode), 상처 등으로 확장되면 동결피해가 발생한다 (Cary and Mayland 1970; Luisetti et al., 1991; Pearce, 2001; Wisniewski et al., 2002).

본 연구에서도 컵을 씌어 놓음에 따라 표면에 이슬이 많이 발생하여 빙결핵 형성을 촉진하였을 수 있었다. 그러나 대기중 습도는 일반적으로 저온 피해를 낮추는 특성이 있으므로, 실제로 노지에서 습도가 동해에 어떤 영향을 줄지는 복잡한 기상 상황과 연관되어 있어 단순히 예측하기는 어렵다.

저온 피해를 입기 쉬운 인삼의 생육 특성이 있는지 조사하기 위해 저온처리 직후 피해를 입은 인삼과 피해를 입지 않은 인삼의 생육상태를 조사하였다. 지상부의 초장, 경장, 엽장, 엽폭은 양호구가 피해구보다 약간 크게 조사되었는데 통계적으로는 초장에서만 차이가 인정되었다 (p < 0.05). 이는 초장이 저온 피해에 영향을 주기보다는 피해구의 지상부 팽압상실이 정확한 길이 측정에 영향을 주어 나타난 결과로 생각된다. 근장과 근중에서도 양호구와 피해구 간에 큰 차이가 없었다. 이 결과로 볼 때 외형적 특징으로는 저온피해를 예측하기 어려울 것으로 판단되나 더 다양한 소질을 대상으로 실험해 보아야 알 수 있을 것이다 (Table 3).

발달단계가 저온 피해에 영향을 주었는지 조사하였는데 잎이 전개 중에 있던 인삼이 잎 전개가 끝난 인삼보다 피해율이 높은 편이었지만 통계적 유의성은 없었으며, 양호도도 전개중 인삼이 전엽이 끝난 것보다 유의하게 더 낮았다 (p < 0.05) (Table 4).

일반적으로 동절기 휴면상태에 있던 눈 (bud)은 수분을 흡수하고 발달이 진행되면서 저온에 대한 저항성을 잃어버린다 (Keller, 2010). 감귤류, 복숭아, 포도 등에서는 식물 또는 눈의 발달단계에 따라 저온 피해 양상이 다르다고 보고되었는데 (Anderson et al., 1980; Johnson and Howell, 1981; Andrews et al., 1984) 차이가 없다는 연구 결과도 있다 (Luisetti et al., 1991). 본 연구에 사용한 인삼은 모두 휴면이 끝난 상태이고 비교 대상도 모두 출아기 이후이므로 명확한 특성을 결정짓기는 어려운 점이 있다.

저온처리 직후는 전엽이 충분하지 않거나 조직이 연하여 리프클립을 물리기 어려워 엽록소 형광반응은 1 주일 후에 조사하였다. 저온처리 후 대조구의 양자수율은 (Fv/Fm)은 0.785였는데, 외형적 손상이 관찰될 경우 0.770으로 감소하여 광합성 기구에 손상이 발생하였음을 알 수 있었다 (p < 0.05). 저온에 노출되었어도 외형적 손상이 없는 저온처리구의 양자수율은 0.784로 대조구와 차이가 없었다.

엽록소 함량도 대조구는 26.0이었고 저온피해구는 22.8로 감소하였는데 엽록소 함량감소가 엽록소 효율을 떨어뜨리는데 기여하였을 것으로 판단된다. 그러나 역시 외형적 손상이 없는 저온처리구의 엽록소 함량은 27.4로 대조구와 차이가 없었다.

저온에 노출되면 엽록소 형광반응이 감소하기도 하지만 저항성 작물의 경우 회복을 하기도 한다 (Kuk et al., 2001; Rizza et al., 2001; Oh and Koh, 2005). 본 연구에서 저온처리 후 외형적 손상이 관찰되지 않았어도 저온처리 시 엽록소 형광반응은 저하되었으나 1 주일 후에는 회복되어 차이를 보이지 않았을 가능성도 있다.

저온처리 1 개월 후 인삼 생육 차이를 비교하였을 때, 저온처리구 중 양호구는 지상부 생육과 지하부 생육 역시 대조구와 차이가 없었다. 저온 피해구는 초장, 경장, 엽장, 엽폭, 지상부 무게, 근장, 근경, 근중 모든 조사항목에서 생육이 불량하였다. 이중 근중은 대조구 대비 58%였으며 지상부가 괴사한 개체의 근중은 대조구 대비 45%였다 (Table 6).

이상의 결과를 볼 때 인삼의 저온피해 연구를 인공적인 환경에서 수행 시에는 인위적으로 장시간 저온을 처리해주거나 적절한 저온처리 시설을 필요로 할 것으로 사료된다. 또한 인삼의 발달단계, 활력 등 다른 생리적 요소와 환경적 요소들도 저온 피해에 영향을 미치는 것으로 생각되므로 상황에 따라 이들을 고려하여 저온 피해 가능성을 연구하여야 할 것이다. 이번 연구를 통해 얻어진 정보들은 인삼의 저온 피해에 대한 이해를 높이고 피해 대책을 수립하는데 유용한 자료로 쓰이기를 기대하는 바이다.