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ISSN : 1225-9306(Print)
ISSN : 2288-0186(Online)
Korean Journal of Medicinal Crop Science Vol.20 No.1 pp.1-7
DOI :

지질분해효소 저해물질 함유 약용식물의 선발 및 저해물질 추출조건

이종국*, 강민구**, 김영헌**, 이종수**†
*충남 농업기술원, **배재대학교 생명유전공학과

Screening of Medicinal Plants containing Lipase Inhibitor and Optimal Extraction Conditions

Jong Soo Lee**†, Jong Kug Lee*, Min Gu Kang**, Young Hun Kim**
*Chungnam Agricultural Research and Extension Services
**Department of Life Science and Genetic Engineering, Paichai University
Received 2011 October 10 , 1st Revised 2011 December 28 , 2nd Revised 2012 January 26 , 3rd Revised 2012 January 30 , Accepted 2012 February 1

Abstract

This study was performed to develop new anti-obesity agents for functional foods from medicinal plants andherbs. Methanol extracts from 560 kinds of medicinal plants and herbs, and their lipase inhibitory activities were investigated.Methanol extract from Desmodium oxyphyllum Dc showed the highest lipase inhibitory activity at 74.2%. This lipaseinhibitory activity was maximally extracted when powder of Desmodium oxyphyllum Dc was treated with 80% methanol(1 : 20) for 48 h.

서 언

비만은 오래전부터 심혈관 질환 등의 다양한 만성 질환을 유발시키는 것으로 알려져 왔다 (Colditz et al., 1990; Manson et al., 1990; Witteman et al., 1990; Caman et al., 1994; Davis et al., 1998; Rexrode et al., 1998). 대사조절을 통한 비만 예방법 중의 하나로 췌장 lipase를 저해하는 방법이 있는데 지금까지 lipase 저해물질로는 phosphatidyl choline, 콩 단백질과 여러 곡물, tannin 같은 천연 물질 그리고 미생물 등 다양한 자원에서 보고되었다 (Levinson, 1977). 특히, 미생물기원의 lipase 저해제로는 Streptomyces toxytricini로부터 항비만성 lipase 저해물질이 생산되어 다양한 임상실험을 거친 후 현재 Xenical (Olistat)이라는 제품의 비만 치료 보조제로써 상용되고 있다 (Bray and Greenway 1999). 그러나 위와 같이 lipase 저해제가 식물이나 미생물들로부터 일부 생산되고 있으나 수율이 낮고 활성이 높지 않아 다양한 약용식물로부터의 탐색과 이들을 이용한 산업화가 필요한 실정이다. 

따라서 필자 등은 lipase 저해 활성이 높고 부작용이 적은 새로운 lipase 저해 소재를 개발하고자 전보 (Lee et al., 2010a)에서는 약용 및 식용버섯 자실체들의 다양한 추출물들 의 lipase 저해활성을 측정하여 72.5%의 lipase 저해활성을 보인 상황버섯을 선발하여 이들의 저해물질 추출 최적조건을 검토하였고 (Lee et al., 2010b), 이들을 정제한 후 특성을 조사하였으며 (Lee et al., 2010c) 산업적으로 응용성을 검토하였다 (Lee et al., 2010d). 본 연구에서는 560종의 약용 식물과 허브로 부터 각각의 메탄올 추출물을 제조한 후 이들의 lipase 저해 활성을 측정하여 활성이 우수한 약용식물을 선발하였다. 또한, 메탄올을 이용하여 lipase 저해물질의 최적 추출 조건을 검토하였다. 

재료 및 방법

1. 실험재료 및 시약

약용식물과 허브류는 2009년도에 재배된 560종을 약재시장 및 시중 한의원 등에서 수집하여 사용하였다. 이들 시료들을
40℃ 열풍건조기에서 건조한 후 분쇄기로 분쇄하여 20 mesh 표준체로 선별하여 사용하였다. 

Lipase 저해활성 측정에는 Sigma (St, louis, Mo, USA)사의 porcine pancreatic lipase와 (Type II) 기질로 triolein을 사용
하였다. 또한 buffer조제에는 TES (N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid), taurocholic acid, gum arabia (Sigma-Aldrich Co. USA)를 사용하였고, 발색시약으로는 bathocuproine (2-9-dimethyl-4-7-diphenyl-1, 10-phenanthroline,
Sigma-Aldrich Co. USA)를 사용하였다. 

2. 추출물의 제조

건조분말 10 g을 80% 메탄올 200㎖에 넣고 40℃에서 24시간 추출한 후 8,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 회수하였다. 이를 다시 감압농축기를 이용하여 농축한 후 동결 건조하여 추출물을 제조한 다음 4㎎/㎖으로 조정하여 사용하였다 (Song et al., 2011; Lee et al., 2010a; Seo et al., 2009). 

3. Lipase 저해활성 측정

Lipase 저해활성은 Bitou 등 (1999)의 방법을 일부 변형시켜 triolein으로부터 생성되는 oleic acid를 측정하여 저해활성을 산출하였다. 기질은 0.1M NaCl이 첨가된 0.1 N TES (NTris (hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid) buffer (pH 7.0) 9 mL에 trioein (120㎎), gum arabic (90㎎), taurocholic acid (10.16㎎)을 넣고 5분간 sonification하여 제조하였다. Lipase 활성측정을 위한 반응용액은 효소용액 (pancreatic lipase, 500 U/㎖) 50㎕, 시료 추출물 50㎕ (4㎎/㎖), 기질용액 300㎕를 첨가하여 최종부피가 400㎕가 되도록 제조한 후, 37℃에서 30분간 반응 시켰다. 

효소반응 후 생성된 oleic acid의 정량은 Zapf 등 (1981)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 효소반응 후 반응용액 0.4㎖에 2% (v/v) 에탄올이 포함된 chloroform/n-hexane (1 : 1) 용액 3㎖을 첨가하여 10분 동안 교반한 후 6,000 rpm으로 원심분리하여 물층을 제거하였다. 침전물에 구리 반응액 1.0 mL을 첨가하여 다시 10분 동안 진탕 시킨 후, 10분간 원심분리(6,000rpm)하고, 추출된 유리 지방산의 구리염이 함유되어 있는 organic phase 1.0㎖를 취하여 0.05% (W/V) 3-tert-buyl-4-hydroxyanisol이 포함된 0.1% (w/v) bathocuproine-chloroform 용액 0.5㎖를 혼합하여 10분간 반응 후 480㎚에서 흡광도를 측정하여 아래와 같이 저해활성을 측정하였으며 모든 시료를 3반복으로 실험한 후 평균값을 구하여 표준오차를 표시하였다 (Lee et al., 2010a). 

Inhibition activity (%) = (A − B) / A × 100
A: enzyme activity without inhibitor
B: enzyme activity with inhibitor 

결과 및 고찰

1. 약용식물과 허브 추출물들의 Lipase 저해활성

지금까지 보고된 곡류의 lipase 저해 활성 들이 대체로 메탄올 추출물에서 우수하였고 (Levinson, 1977), 약용식물 중의
elastase 저해물질 등이 역시 메탄올 추출물에서 높은 결과를 나타냈기 때문에 (Kwak et al., 2005) 본 실험에서도 560종의 약용식물과 허브들의 메탄올 추출물들에 대한 lipase 저해활성을 측정하였다. Table 1에서와 같이 도둑놈의갈고리
(Desmodium oxyphyllum Dc) 메탄올 추출물이 74.2%로 가장 높은 저해활성을 보였고, 다음으로 백출 63.4%, 노랑원추리61.9%, 감초 68.8%, 오리방풀 61.3%, 애기맥문동 66.3%, 박하 64.5% 등으로 비교적 높은 lipase 저해활성을 보였다. 이상의 활성을 종합하여 도둑놈의갈고리를 lipase 저해물질 함유식물로 최종 선발하였다. 

Table 1. Lipase inhibitory activity of methanol extracts from medicinal plants and herbs.

한편, 이와 같은 도둑놈의갈고리의 lipase 저해활성은 필자 등이 보고한 상황버섯 (고려1호) 자실체의 72.5%와 비슷하였으나 차가버섯 (62.9%), 표고버섯 (45.3%), 영지버섯 (35.7%, 44.5%) 등 보다 높은 활성을 나타냈다 (Lee et al., 2010a). 또한, 시판되고 있는 lipase 저해활성 물질인 Olistat와 농도별로 활성을 비교하였을 때 Olistat가 1.0~10.0㎍/㎖에서 83.0% 이상을 보인 반면에 본 연구의 도둑놈의갈고리의 부분 정제된 lipase 저해물질은 10㎍/㎖에서 67.4%를 보여 시판 Olistat보다는 활성이 낮았다 (Lee et al., 2011b). 

한편 필자 등은 도둑놈의갈고리의 또 다른 생리기능성으로 에탄올 추출물의 항치매성 acetylcholinesterase 저해활성이 68.4%, 항고혈압성 ACE 저해활성이 15.9%, SOD 유사활성이 16.1%를 보였음을 보고한바 있다 (Lee et al., 2011a). 

도둑놈의갈고리는 장미목, 콩과의 쌍떡잎 여러해살이 식물로, 한국, 중국, 일본, 대만 등지에 분포되어 있으며, 열매는 협과로 납작하며 표면에 짧은 갈고리 모양의 털이 있어 잘 달라붙는다. 지금까지 이들의 약리 효능으로는, 토혈, 거풍, 해열, 개선, 황달, 해수 등이 알려져 있어 일부 한방에서 이용되고 있을 뿐 대체로 사료로 이용되고 있다 (Bae, 2003). 

지금까지 콩을 포함하는 일부 곡물들로부터 lipase 저해물질의 탐색과 이들의 산업적 응용에 관한 연구가 국부적으로 진행되었지만 선발된 도둑놈의갈고리를 포함하는 560종의 다양한 약용식물과 허브류에 대한 lipase 저해 활성은 본 논문에서 처음 보고되는 것으로 앞으로 항비만성 건강소재의 하나로 활용이 가능할 것으로 사료된다. 

2. 도둑놈의갈고리로부터 lipase 저해활성물질 추출조건

도둑놈의갈고리에 함유되어있는 lipase 저해물질을 대량 추출하기 위한 최적 추출조건을 조사한 결과, Fig. 1과 같이 메탄올 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하여 80% 메탄올을 시료분말의 20배 첨가하여 추출하였을 때, 유의성 있게 73.5%의 최대 저해활성을 보였다. 그리고 100% 메탄올을 20배로 시료분말에 첨가하여 추출 하였을 때 74.1%로 80% 메탄올로 20배 첨가하여 추출하였을 때와 유의성 있게 같은 저해활성을 보였다. 따라서 경제성과 추출물에 대한 영향을 고려하여 80%메탄올을 1 : 20 (W/V)비율로 첨가하여 최적 추출시간을 검토하였다. 

Fig. 1. Effects of methanol concentration and addition ratio on the lipase inhibitory activity of Desmodium oxyphyllum Dc Addition ratio of Methanol vs D. oxyphyllum Dc are 1 : 10 (□) and 1 : 20 (▩), respectively

도둑놈의갈고리 중에 함유되어 있는 lipase 저해물질은 80% 메탄올로 48시간 추출했을 때 가장 높은 lipase 저해활성을 보인 후 추출시간이 길어짐에 따라 점차 감소하였다 (Fig. 2). 이러한 추출 최적조건은 상황버섯 자실체 중의 lipase 저해물질이 80% 메탄올로 40℃에서 24시간 추출했을 때 가장 많이 용출 되었다는 보고 (Lee et al., 2010a)보다 추출시간이 24시간 길었으나 상황버섯 중의 lipase 저해물질의 추출 최적 조건이 80℃의 증류수로 72시간, 또는 80% 에탄올로 100℃에서 60시간이었다는 보고 (Lee et al., 2010b)보다 추출온도가 낮고 추출시간이 짧았다. 이와 같이 lipase 저해물질의 추출 최적 조건이 다른 것은 수수중의 항치매성 아세틸콜린에스터레이즈 저해물질이 80% 메탄올 40℃에서 12시간에 가장 많이 용출되었다는 Song 등 (2010)의 보고와 Seo 등 (2009)이 율무 중의 아세틸콜린에스터레이즈 저해물질이 60% 메탄올로 40℃에서 6시간에 최대로 용출되었다는 보고처럼 시료인 버섯과 약용식물의 물질 조성 차이와 함유되어있는 lipase 저해물질의 물성 차이 등에 의한 것으로 추정되며, 도둑놈의갈고리중의 lipase 저해물질에 대한 추가의 정제 연구가 필요한 것으로 사료된다. 

Fig. 2. Effects of methanol extraction time on the lipase inhibitory activity of Desmodium oxyphyllum Dc.

한편, 도둑놈의갈고리 중에 함유되어 있는 lipase 저해물질을 메탄올 이외에 물과 에탄올로 추출하였을 때와 저해활성을 비교한 결과 물로 80℃에서 72시간 추출하여 얻은 추출물은 39.5%, 에탄올로 80℃에서 60시간 추출한 추출물은 67.2%를 보여 메탄올 추출물 보다 각각 34.0%와 6.3% 낮은 저해활성을 보였다 (Lee et al., 2011a). 

이상의 결과들을 종합해보면 비록 시판 lipase 저해물질인 Olistat의 저해활성보다 본 연구의 도둑놈 갈고리 추출물 중의 lipase 저해물질의 활성이 약 16% 낮았지만 도둑놈의 갈고리는 이미 오래전부터 한방에 이용되고 있어 인체 안전성 등이
검증되었으므로 앞으로 이를 이용한 항비만성 건강식품이나 대체의약의 보조 소재로써 응용성이 클 것으로 사료된다. 

01-07.pdf642.7KB

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