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ISSN : 1225-9306(Print)
ISSN : 2288-0186(Online)
Korean Journal of Medicinal Crop Science Vol.20 No.4 pp.259-269
DOI : https://doi.org/10.7783/KJMCS.2012.20.4.259

복분자 안토시아닌 분획의 항산화, 항암 및 면역증진 효과

정명근, 임정대
강원대학교 생약자원개발학과

Antioxidant, Anticancer and Immune Activation of Anthocyanin Fraction from Rubus coreanus Miquel fruits (Bokbunja)

Jung Dae Lim, Myoung Gun Choung
Department of Herbal Medicine Resource, Kangwon National University.
Received 2012 August 5 / 1st Revised 2012 August 7 / Accepted 2012 August 10

Abstract

This study was performed to determined the antioxdant activities, anticancer and immuno-activities of anthocyanin fraction from Rubus coreanus Miquel fruits (Bokbunja). Anthocyanin fraction extracted from Bokbunja revealed the presence of three anthocyanin components, which were tentatively identified as cyanidin 3-O-sambubioside, cyanidin 3-O-xylosylrutinoside and cyanidin 3-O-rutinoside using RP-HPLC/DAD/MS. The anthocyanin fraction from Bokbunja always showed reducing power and high scavenging activities against DPPH, hydroxy radical (OH) and superoxide anion radical (O2 -) similar to general synthetic antioxidant and polyphenol compounds from plant origin. Anthocyanin fraction from Bokbunja showed high inhibition on proliferation of LNCaP and A549 cells and did not inhibit the proliferation of other cancer cells. Immuno-activities of Anthocyanin fraction from Bokbunja were investigated, it showed high promotion of human B and T cells growth about 50% and secretion of IL-6 and TNF-α by treatment after 6 days. Over all, the result of the study suggest that anthocyanin fraction from Bokbunja displays antioxidant activity comparable to that general synthetic antioxidant, also, anthocyanin fraction from Bokbunja are expected to be good candidate for development into source of anticaner and immuno-activator agent in food industry.

smcs20(4)_7_g1.JPG15.9KB

서 언

 산딸기 속 (Rubus)은 250종의 유성생식 종으로 구성될 정도로 가장 다양성이 풍부한 식물 속 중 하나이며, 세계적으로 재배종과 야생종을 포함하여 12 아속으로 구성되어 있고 (Byamukama et al., 2005), 이 중 4개의 아속이 경제적으로 가치가 높은 과실을 얻기 위해 재배되고 있다. 이들 가운데 가장 가치 있는 종 중 하나가 복분자 (Rubus coreanus Miq.)로서 복분자는 장미목 (Rosales), 장미과 (Rosaceae)의 낙엽관목으로 동남아시아 지역, 특히 중국과 일본, 한반도의 남쪽에만 분포하고 있으며, 높이가 2~3 m 정도로 자라고 줄기는 붉은색을 띄며 새로 나는 가지에는 초록색 바탕에 흰 분이 덮여 있다. 5~6월에 연한 홍색의 꽃을 피고 열매는 7~8월에 열매가 성숙되어 둥글고 붉은색으로 익으나 점차 검게 된다. 전통적으로 미성숙 종자를 한방에서는 강장, 명안, 지신, 음위, 양모 등의 치료용 약재로 이용하여 왔고 (Lee et al., 2003), 정액루 (spermatorrhea), 유뇨증 (enuresis), 천식 (asthma) 및 알레르기 관련 질병의 치료제로 사용되고 있다 (Shin et al., 2002). 최근에는 상업적 용도로 전통 와인의 생산, 젤리, 잼, 음료 등의 제품이 개발되어 시판 중에 있어 재배면적 및 수확량이 증가하고 있으나 현재 재배되고 있는 복분자는 대부분 외래종 복분자 (Rubus occidentalis)이며, 우리나라에서는 잎뒷면에 털이 전혀 없는 것을 ‘청복분자 딸기’라 하여 토종 복분자 (Rubus coreanus Miq.) 종만의 열매를 약용으로 분류하고 있다 (Cha et al., 2007).

 고등식물의 꽃, 과실, 줄기, 잎, 뿌리 등 식물체 각 부위에 폭넓게 함유되어 있는 안토시아닌 색소는 적색, 자색 및 청색을 나타내는 수용성 flavonoid 색소로서 식물체 부위별 특성에 따라 서로 다르게 발현되는 식물색소이지만 (Choung, 2004), 최근 인체의 만성적 질병과 연관된 항산화, 항염증, 항암, 동맥경화 억제, 지질과산화 저해 및 DNA celavage 보호 작용등 다양한 생리활성 효과 (Ramirez-Tortosa et al., 2001; Acquaviva et al., 2003; Lazze et al., 2003; Lefevre et al., 2004; Rossi et al., 2003)가 인정되어 많은 연구자들에 의해 안토시아닌을 함유한 다양한 식품소재 개발 및 평가가 진행중이며, 또한 안토시아닌을 이용한 질환개선 제제의 개발 및 기능성 식품으로의 활용성이 검토되고 있다. 안토시아닌을 포함하는 폴리페놀성 화합물은 잠재적인 건강기능성 특징과 안정성을 가지고 있으며 이들을 포함하는 berry류 과실의 품질을 평가할 수 있는 지표로서 매우 중요하고 berry 자체와 berry를 이용하여 만든 제품에 대한 향과 색깔에 영향을 미치는 주요한 인자로 인식되고 있다 (Hollman, 2001).

최근 복분자 추출물이 대식세포에서 HO-1 (heme oxygenase-1)의 활성화를 통한 항염증활성 (Park et al., 2006), 자유라디칼 소거활성 (Kwon et al., 2011), malonaldehyde 형성 억제효과 (Kim et al., 2005), 항미생물효과, B형 간염에 대한 항바이러스 효과 및 항암효과 (Kim et al., 1999), 면역활성 증가 효과 (Lee et al., 2003; Park et al., 2004)를 가지고 있으며 활성물질로 phenolic acid, organic acid, tripterpeonoside, flavonoids gallotannin 및 ellagitannin 등을 함유하고 있다는 정량 및 정성 분석에 대한 결과가 보고된 바있다 (Yoon et al., 2002, 2003). 또한 복분자에는 천연 색소인 안토시아닌이 다량으로 포함되어 있어 인간의 건강을 위한 식물기원의 천연 식품 색소로서 활용을 위하여 안토시아닌의 수율과 가공 공정에서 다양한 생리 활성을 증가시키기 위한 가공공정 개발에 대한 연구가 진행 중이다 (Joo et al., 2009; Jeong et al., 2009).

하지만 이러한 복분자 열매의 성분 및 생리활성에 관한 연구는 대부분 열매의 에탄올 및 열수 추출물 자체, 또는 wine 등과 같이 특정 가공공정에서 나오는 제품이나 그 부산물을 대상으로 하고 있기 때문에 복분자의 안토시아닌 분획이 가지는 고유한 생리활성 평가는 진행되고 있지 못하다. 또한 다양한 과실이나 꽃에 포함된 각각의 안토시아닌의 비교에 있어 구성된 안토시아니딘 (anthocyanidin)의 종류, 하이드록시기 (hydroxy group)의 개수, 부착된 당의 종류와 개수, 아실화(acylation)의 유무에 기인하여 서로 다른 화학적 구조를 가지게 되고 이러한 화학적 구조에 의해 서로 다른 생물학적 활성, 생체이용률 등이 달라질 수 있다는 점 (Felgines et al., 2002; Wu et al., 2002)을 고려해 보면 서로 다른 과실이나 꽃에 포함된 안토시아닌의 종류 및 안토시아닌에 의한 생리활성 검정을 별도로 수행할 필요가 있다고 하겠다.

따라서 본 연구는 복분자의 추출물로부터 안토시아닌 분획을 획득하고 획득된 안토시아닌 분획의 조성을 확인하며 이들에 대한 항산화, 항암 및 면역증진 효능을 검토함으로써 복분자 열매 안토시아닌 분획을 이용한 식품 소재개발 및 복분자 안토시아닌 분획의 식품 색소 활용성 증진을 위한 기초 자료를 제공하고자 하였다.

재료 및 방법

1. 실험재료

본 실험에 사용된 복분자는 전북 고창군에서 재배된 것으로 2009년 7월에 완숙과만을 구분하여 수확한 것을 깨끗이 세척하여 -20℃로 냉동 보관하여 사용하였다. 수확된 열매를 동결 건조기 (FDS-5503, OPERON Freeze Dryer)로 건조한 후, 분쇄기 (DA282-2 대성아트론, 한국)를 이용하여 씨가 분쇄되지 않도록 분쇄한 다음 100 mesh 체를 통과하여 분말을 제조하고 건조제인 실리카겔을 포함하여 보관하였다.

분쇄 복분자 분말 10 g에 0.1% 염산 함유 증류수 1ℓ를 첨가한 후 저온 (4℃) 암조건 하에서 24시간 추출하여 추출물을 획득하고 추출물로부터 안토시아닌 분획을 얻기 위하여 6cc C18 Sep-Pak SPE 카트릿지 (Waters Co. USA)를 사용하였다. C18 Sep-Pak SPE 카트릿지에 30㎖의 추출용액을 흡착시킨 후 증류수 및 10% 메탄올 용액 각 10㎖로 세척하고, 다시 메탄올 10㎖로 용출 분획하여 복분자 안토시아닌 분획 (Anthocyanin Fraction form Fruits of R. coreanus, AFRC;35.2㎎/100 gFW)을 회수하였다. 분획 회수된 복분자 안토시아닌 분획을 감압 농축하고 질소충전 하에 -4℃에 보관하였고 증류수로 희석하여 RP-HPLC/DAD/MS를 이용한 분석과 생리활성 검정에 사용하였다.

2. 복분자 안토시아닌 분획에서의 안토시아닌 종류의 확인

복분자 안토시아닌 분획에서 안토시아닌의 정성적 평가를 위하여 RP-HPLC/DAD/MS를 이용하였다. LC/MS 기기는 Agilent 1200 HPLC 및 6110 Quadrupole LC/MS system (Agilent, Waldbronn, Germany)를 사용하였으며, 고정상은 YMC-Pack pro C18 RS (150 × 2.0㎜ I.D., S-3㎛, 8㎚, Japan), 이동상은 1% formate-H₂O와 1% formate-ACN을 80 : 20 (isocratic)의 비율로 조합하여 사용하였고 컬럼 온도는 30℃, 유속은 0.3㎖/min로 일정하게 조정하였다. DAD wavelength는 530㎚로 하여 검출하였으며 시료 도입량은 5㎕, 이온화는 ESI positive-ion mode를 사용하였고 mass range는 50-1,000 m/z, gas temperature는 350℃, Drying gas는 분당 10㎖로 하였다.

3. 복분자 안토시아닌 분획의 항산화 활성

1) DPPH radical 소거 활성 검정

시험관에 복분자 안토시아닌 분획물을 농도별 (25, 50, 100, 200㎍/㎖)로 첨가한 다음 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) 400㎕와 0.5 mM의 DPPH 1,600㎕를 첨가한 후 20분간 암실에서 반응시킨 뒤 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때 기질과 DPPH가 없는 Initial (Ai)과 blank (Ab)를 측정하였으며, 시료 첨가 후 흡광도 (As)를 측정하였고, RC50 (㎍/㎖)은 화합물을 첨가하지 않은 대조군의 값을 50% 감소시키는 화합물의 농도를 나타냈으며, 기존의 항산화제인 α-tocopherol, BHA 등의 합성 항산화물과 (+)-catechin, quercetin, vanillic acid와 상호 비교하였다.

2) Hydroxy radical 소거활성 검정

복분자 안토시아닌 분획의 hydroxy radical 소거 활성검정은 Fenton 반응에 의한 2-deoxyribose가 hydroxy radical에 의해 산화되어 malonaldehyde로 변환된 후 chromagen을 형성하는 정도를 측정하는 방법을 이용하였다 (Halliwell et al., 1987). 1㎖의 0.1M sodium phosphate buffer (pH 7.4), 0.2㎖의 10 mM 2-deoxyribose, 0.2㎖의 10 mM FeSO4EDTA, 0.2㎖ 의 10 mM H₂O₂ 그리고 0.075㎖의 복분자 안토시아닌 분획 농도별 시료(1.316, 2.632, 5.263, 10.526, 26.316, 52.631, 105.262, 210.524㎍/㎖)를 Eppendorf tube에 넣고 37℃, 암 상태로 4시간 동안 반응시킨 후 1㎖의 2.8% (w/v) trichloroacetic acid를 가하여 반응을 중지시킨 후에 다시 1㎖의 1.0% (w/v) TBA를 첨가한 후 이 반응액을 끓는 물에 10 분 동안 처리한 후 급속 냉각시키고, UV-1200 UV/VIS spectrometer (Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 532㎚에서 흡광도로 측정하여 검정하였다. Hydroxyl radical 소거활성 검정은 복분자 안토시아닌 분획물의 첨가 농도에 따라 hydroxyl radical에 의해 2-deoxyribose가 산화되는 것을 저해하는 비율로 계산하였으며, 기존의 합성 항산화제인 α-tocopherol과 (+)-catechin, quercetin, vanillic acid를 대조군으로 상호 비교하였다.

3) Superoxie anion radical 소거활성 검정

복분자 안토시아닌 분획의 superoxide radicals 소거활성은 NBT (Nitro-Blue Tetrazolium)환원법을 사용하여 검정하였다 (Nagai et al., 2005). 즉, 3mM xanthine 80㎕, 0.05mM sodium carbonate buffer (pH 10.5) 1.92㎖, 3mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) 80㎕와 0.75 mM NBT 80㎕로 구성된 혼합액에 복분자 안토시아닌 분획물을 10, 25, 50, 100㎍/㎖의 농도로 각각 처리하였으며, 이 혼합물을 25℃에서 10분간 incubation 하였으며, 다시 1.0㎖의 XOD (6 mU/㎖)를 첨가하여 반응을 시작한 후 25℃에서 20분간 반응하였다. 그 후 0.02㎖의 6 mM CuCl를 첨가하여 반응을 종결시킨 후 560㎚에서 흡광도를 측정하였다. 농도별 시료 첨가 양에 따른 NBT환원에 대한 저해능을 50% 감소시키는 화합물의 농도 (IC50, 50% inhibition concentration)로 나타내었으며, 합성 항산화제인 ascorbic acid와 (+)-catechin, quercetin, vanillic acid를 대조군으로 상호 비교하였다.

4) 복분자 안토시아닌 분획의 환원력 검정

복분자 안토시아닌 분획의 환원력은 Oyaizu (1986)의 방법에 따라 측정하였다. 0.2M sodium phosphate buffer (pH6.6) 1㎖, 시료 1㎖ 및 1% potassium ferricyanide 1㎖를 가하고, 이 혼합물을 50℃에서 20분간 반응시킨 후 10% triobarbituric acid (TCA) 1㎖ 넣었다. 반응이 끝난 혼합물을 1000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상징액 2㎖와 메탄올 2㎖을 넣고 0.1% iron chloride 용액 0.1㎖을 넣은 후 UV/VIS spectrophometer를 이용 흡광도 700㎚에서 측정하였다. 반응액은 Fe3+과 Fe2+간의 transformation에 의하여 청록색을 나타내며 흡광도 값이 클수록 높은 환원력을 나타낸다. 대조구로는 합성 항산화제인 BHT와 (+)-catechin, quercetin, vanillic acid를 사용하였다.

4. 복분자 안토시아닌 분획의 항암활성 검정

복분자 안토시아닌 분획이 가지는 높은 라디칼 소거활성 및 환원력에 기인하여 면역체계와 연관된 감염성 질환의 주요 인자인 NF-κB활성을 통한 암의 생장에 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료되어 복분자 안토시아닌 분획물의 처리에 따른 암세포주의 생육억제 효과를 SRB (Sulfo Rhodamine B)법으로 조사하였다. 암세포주는 전립선암 세포주인 LNCaP, 결장암 세포주인 HCT-15, 위암 세포주인 ACHN, 폐암 세포주인 A549, 백혈병 세포주인 MOLT-4F를 사용하였다. 정상세포에 대한 독성을 확인하기 위하여 간세포주인 293 (human embryo liver)을 Korea Cell Line Bank (KCLB)로부터 구입하여 대조구로 사용하였다. 상기 암세포주는 10% 소 태아 혈청이 포함된 RPMI 1640배지를 사용하여 배양하였고, 배양된 세포는 일주일에 한 번 또는 두 번 정도 분주하여 유지하였다. 

항암활성을 측정하는데 사용된 세포 농도는 3,000-6,000개/㎖이었으며, 상기 방법에 사용한 모든 시약은 100% DMSO에 녹이고, 이를 단계적으로 희석하여 복분자 안토시아닌 분획물의 농도를 30, 10, 5, 2.5, 1, 0.1㎍/㎖로 조제하였다. 세포의 수를 측정하여 일정한 농도로 96-well plate에 분주하고 하루가 경과한 다음 세포가 나타내는 기본적인 흡광도를 나타내는데 필요한 Tz plate로서 시료를 처리할 플레이트와 동일한 세포농도를 가진 다른 플레이트를 50% TCA를 사용하여 고정하였다. 그리고 시료를 처리할 플레이트는 시료의 최종 농도를 0.1% DMSO로 맞추어 5개의 농도로 처리하였다. Tz plate는 1시간이 경과하면 수돗물로 세척하고, 시료를 처리한 plate는 2일이 경과한 다음 50% TCA를 well당 50㎕씩 처리하여 고정하고 역시 1시간이 경과하면 수돗물로 세척하였다. 세척한 plate는 상온에서 건조시키고, 그 후 0.4% SRB 용액을 well 당 100㎕씩 가한 다음 30분이 경과하면 1% 아세트산 용액으로 세척하였고, 이를 다시 상온에서 건조시켰다. 다음 10 mM Tris 염기(pH 10.5)를 well 당 100㎕씩 가하여 다시 용해시키고, ELISA 해독기를 사용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 암세포의 성장을 50% 억제하는 화합물의 농도를 GI50 (㎍/㎖)으로 나타내었고, 대조군으로 adriamycin을 사용하였다. 

5. 복분자 안토시아닌 분획의 면역증진 활성 검정

복분자 안토시아닌 분획의 면역기능 증강 효과를 구명하기 위하여 면역세포 생육 증진 효과를 알 수 있는 인간 면역 세포인 T cell (Jurkat, ATTC, USA)과 B cell (Raji, ATTC, USA)을 이용하여 면역세포 증식 및 면역세포 증식 촉진인자에 미치는 영향을 평가하였다. 세포의 생육은 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 5% CO₂, 37℃에서 배양하였으며 복분자 안토시아닌 분획의 면역세포 생육에 미치는 효과를 구명하기 위하여 24well plate에 세포를 2.0 × 10⁴ cells/㎖의 농도로 조절한 후 다시 24시간을 배양하였고 0.2㎛ filter로 여과된 복분자 안토시아닌 분획물 0.5㎎/㎖를 각각의 well에 첨가한 후 8일까지 다시 배양하였다. 배양 후 매일 hemacytometer를 이용하여 세포수를 측정하였으며 복분자 안토시아닌 분획물을 대조구와 비교하여 세포의 생육과 세포수에 따라 면역활성을 측정하였다. 또한 면역세포들이 배지로 분비하는 cytokine인 tumor necrosis factor α와 interleukin 6의 양을 ELISA kit (Genzyme, USA)를 이용하여 측정하였다. 24 well plate에 배양된 세포를 2.0 × 10⁴ cells/㎖의 농도로 조절한 후 900㎕씩 첨가하여 24시간 동안 배양 (5% CO₂, 37 ℃) 시킨 후 복분자 안토시아닌 분획의 최종 농도를 0.5㎎/㎖ 로 하여 100㎕씩 첨가하여 다시 8일 간 배양 (5% CO2, 37℃) 하였다. 배양기간 8일 동안 매일 배양액을 취하여 원심분리한 후 상등액을 대상으로 microplate reader (2030 multilabel reader, VictorTMX3, Perkinelmer, USA)를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였고 표준물질을 이용해 작성된 표준 검량곡선과 비교하여 cytokine 양을 측정하였다. 

6. 통계처리 및 분석

데이터의 통계처리는 각 시료를 3회 반복으로 행해졌으며, 실험값의 통계는 SAS(Statistical Analysis System) 프로그램을 사용하여 실험 간의 평균을 구하였으며, 각 처리구간의 최소유의차 (P < 0.05) 수준에서 통계처리 하였다. 

결과 및 고찰

1. 복분자 안토시아닌 분획의 정성적 확인

복분자의 안토시아닌 분획에서 안토시아닌의 조성를 확인하기 위하여 RP-HPLC/DAD/MS로 분석하고 530㎚에서 기록되어지는 피크의 머무름 시간 (RT, retention time)과 MS를 이용한 이온화 단편 양상 (mass fragmentation pattern)을 분석한 결과, 복분자 안토시아닌 분획은 크게 3개의 안토시아닌 종류가 있음을 확인하였다 (Fig. 1, Fig. 2). 

Fig. 1. HPLC chromatogram of major anthocyanin species in anthocyanin fraction of Rubus coreanus Miquel fruits. An 1, cyanidin 3-O-sambubioside; An 2 cyanidin 3-O-xylosylrutinoside; An 3, cyanidin 3-O-rutinoside.

Fig. 2. Mass spectra of major anthocyanin species in anthocyanin fraction of Rubus coreanus Miquel fruits.

HPLC 분석을 통하여 분리된 3개의 피크에 대한 MS 데이터 분석결과 (Table 1, Fig. 2) 복분자 안토시아닌 분획 함유 안토시아닌 1 (An 1)의 m/z(M+)가 581, 449 및 287을 나타내었는데, 이는 각각 하나의 xylose(132)와 하나의 glucose (162) 분자가 쪼개짐으로 인해 나타나는 양상으로 분자구조에 sambubioside가 존재하고 있었음을 의미하며, m/z 287의 fragment로 볼 때 aglycone은 cyanidin이므로 결국 안토시아닌 1은 cyanidin 3-O-sambubioside로 동정되었다. 안토시아닌 2 (An 2)는 m/z(M+)가 727, 595 및 287을 나타내어 모분자에서 하나의 xylose (132)가 결여된 m/z(M+) 595 및 rutinoside (308)가 결여된 cyanidin (m/z 287) 구조를 나타내어 cyanidin 3-O-xylosylrutinoside로 동정되었다. 아울러 안토시아닌 3 (An 3)은 동일한 분자 쪼개짐 현상의 해석으로 안토시아닌 2의 구조에서 xylose (132)가 결여된 m/z(M+) 595로 부터 rutinoside (308)가 결여된 cyanidin (m/z 287) 구조를 나타내어 cyanidin 3-O-rutinoside로 동정되었다 (Table 1). 상기 분석된 복분자의 안토시아닌 종류에 대한 결과를 재확인하기 위하여 소량 고순도 분리 후 각 안토시아닌에 대한 분자구조를 확인하기 위해 NMR을 수행하였으며 ¹H-NMR과 ¹³CNMR결과를 (자료 미제시) 통하여 분리된 모든 안토시아닌이 MS 데이터에 의해 동정된 구조와 동일함을 재확인하였다. 이러한 결과는 red rapsberry (Rubus idaeus)나 black rapsberry (Rubus occidentalis) 열매를 구성하는 안토시아닌 프로파일링 결과 (Chen et al., 2007; Tian et al., 2006) 및 복분자를 이용한 전통 와인의 생산 과정에서 부산물로 생기는 복분자박에서부터 안토시아닌을 추출하기 위한 최적의 추출방법을 확인하는 과정 중에 복분자박에서 6개의 안토시아닌 (cyanidin 3-O-sambubioside, cyanidin 3-O-xylosyl-rutinoside, cyanidin 3-O-rutinoside, pelargonidin 3-O-rutinoside, delphinidin 3-O-rutinoside group, delphinidin 3-O-glucuronide) 종류가 확인 되었다는 결과 (Ku and Mun, 2008a)와 유사하였다. 

Table 1 . Characterization of anthocyanins in anthocyanin fraction of Rubus coreanus Miquel fruits.

2. 복분자 안토시아닌 분획의 DPPH radical 소거 활성

복분자 안토시아닌 분획물의 DPPH free radial 소거 활성을 일반적으로 식물체에 많이 존재하는 polyphenol 화합물인 (+)- catechin, quercetin, vanillic acid와 비교하였다 (Table 2). 전자공여능은 지질과산화 반응을 연쇄적으로 일으키는 반응에 관여하는 산화성 free radical에 전자를 제공하여 산화의 진행과정을 정지시킨다. 산화성 free radical은 생체 내에 존재하는 단백질과 세포막의 지질 등을 산화시켜 막에 쌓인다거나 DNA 등에 손상을 일으켜 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다 (Ames et al., 1993). DPPH는 항산화 물질에 존재하는 페놀성 화합물들의 전자를 공여하여 방향족 화합물 및 방향족아민류에 의해 환원되어 짙은 자주색이 탈색되는 정도를 지표로 항산화 능력을 측정하는 방법이다. 하지만 이 방법은 DPPH가 pH, 빛 그리고 온도에 민감하게 영향을 받는 것이 단점으로 알려져 있다 (Yoo et al., 2007).

Table 2 . DPPH free radical scavenging activities of several antioxidants and anthocyanin fraction of Rubus coreanus Miquel fruits.

복분자 안토시아닌 분획물의 DPPH radical 소거활성은 vanillic acid를 제외하고 합성 항산화제나 polyphenol성 화합물 대조군과 비교하여 낮은 활성을 보였고 RC50(㎍/㎖) 값이 약 31.45㎍/㎖로 나타났다. 이와 비교하여 대조군으로 사용된 합성 항산화제인 BHT가 8.13㎍/㎖, ascorbic acid가 7.71㎍/㎖의 결과 값을 나타냈고 (+)-catechin은 2.27㎍/㎖, quecetin은 1.98㎍/㎖를 나타냈었는데 (+)-catechin, quecetin의 라디칼 소거활성이 높은 것은 동일한 o-catechol 그룹을 가지고 있는 단량체 형태의 polyphenol의 특성을 가지고 있기 때문으로 사료되며 복분자 안토시아닌 분획의 경우 이러한 ocatechol 그룹을 가지고 있는 단량체 형태의 polyphenol과 유사한 정도의 활성을 가지기 위해서는 30㎍/㎖ 이상의 농도가 적용되어져야 한다는 것을 알 수 있었다. 반면 vanillic acid의 경우 300㎍/㎖의 이상의 경우에서도 RC50값을 나타내지 못하였고 이러한 경향은 농도가 증가하여도 매우 낮게 유지되었는데 이는 vanillic acid가 가지는 o-methoxyphenol 구조에 기인하여 분자안정화에 있어 전자편중(electron delocalization)이 결여되어 있기 때문으로 생각되어진다. 

복분자 안토시아닌 분획물의 DPPH radical 소거활성이 합성항산화제나 polyphenol성 화합물 대조군보다 낮은 활성을 보였지만 복분자 열매의 에탄올 농도별 추출물의 DPPH radical 소거활성에 있어 RC50 값이 미숙과의 경우 24.98에서 38.21㎍/㎖로 나타나고 완숙과의 경우 104.40에서 154.70 ㎍/㎖의 범위에서 나타난다는 보고 (Kwon et al., 2011)와 비교하여 보면 복분자의 에탄올 추출물보다 복분자 안토시아닌 분획물의 경우 안토시아닌이 가지는 특이성에 의하여 전자공여능이 높고 radical을 소거하는 활성이 높다는 것을 알 수 있었다. 또한 이러한 결과는 한국산 참다래 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성의 측정한 결과 RC50값이 참다래 과피의 경우 297.9~1,210.8㎍/㎖의 수치를 나타내었으며, 과육 추출물의 경우 2,904.9~6,192.0㎍/㎖의 결과를 나타내었다는 보고 (Park et al., 2008)와 가시오갈피 열매의 RC50값은 추출조건에 따라 57.30㎍/㎖에서 1194.83㎍/㎖의 결과 값을 나타내었다는 결과 (Kim et al., 2006)와 비교하여 볼 때에도 복분자 안토시아닌 분획물은 전자공여능에 의해 radical을 소거하는 활성이 매우 크다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 오미자 종자의 메탄올 추출물의 경우 RC50 값이 33.2㎍/㎖이며 (Jung et al., 2000) 섬고사리 잎의 RC50 값이 13.02㎍/㎖ (Lee et al., 2005)을 나타내었다는 보고에 기인하여 활용부위가 다른 약용식물 보다 안토시아닌을 포함하고 있는 berry류 형태의 과실을 가진 복분자가 강한 항산화 활성을 나타내는 것으로 판단된다. 

3. 복분자 안토시아닌 분획의 hydroxy radical 소거 활성

Hydroxy radical(OH)은 활성산소 중 반응성이 매우 강하여 생체 산화에 주된 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Chung et al., 1997). 특히 hydroxyl radical은 DNA의 purine과 pyrimidine염기를 무차별적으로 공격하여 다양하게 변형시킬 뿐만 아니라 deoxyribose부분을 공격하여 DNA사슬의 절단(scission)을 일으킨다. 암, 동맥경화증, 자가면역 질환, 관절염, 폐질환, 당뇨병, 심근경색증, 뇌 및 신경질환 등의 발생과 진행경과에 free radical이 관여하고 있다는 증거들이 많이 보고되고 있다 (Rice-Evance et al., 1996). 

복분자 안토시아닌 분획물의 hydroxy radical 소거활성을 합성 항산화제와 식물기원의 polyphenol 화합물과 비교한 결과(Fig. 3), 모든 처리에서 농도 의존적으로 hydroxy radical 소거활성이 증가한 경향을 나타낸 반면 vanillic acid의 경우 그들이 가지는 2-methoxyphenol의 구조적 특성 때문에 수소이온의 공여에 의해 hydroxy radical을 환원시키는 능력이 적은 것으로 판단되며 모든 농도에서 음의 값을 나타내었다. Tochpherol과 quercetin의 경우 모든 농도에서 hdyroxy radical소거 능력이 양의 값을 나타내었으나 tocopherol의 경우 5.263㎍/㎖ 처리 시 11.05%를 나타내 저 농도에서는 농도가 증가할수록 소거활성이 증가하는 비율을 나타내다 5.263㎍/㎖이상의 농도에서는 유사한 수준으로 유지되는 경향을 나타내었다. 또한 quercetin의 경우 5.263㎍/㎖ 처리 시 64.51%의 hydroxy radical 소거활성을 나타내었으며 농도가 증가할수록 소거활성이 높아져 52.263㎍/㎖ 처리 시 90.62%의 소거활성을 나타내었고 그 이후의 농도에서는 일정한 수준으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 반면 (+)-catechin이나 복분자 안토시아닌 분획물의 경우 52.263㎍/㎖ 처리 시 각각 52.65%, 59.29%로 최대의 hydroxy radical 소거활성을 나타내다가 그 이상의 농도에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 hydroxy radical의 소거에 있어 항산화 소재의 구성 및 화학적 구조의 특성을 반영한 것이라 할 수 있다. Quercein의 경우 hydroxy radical에 대한 소거 활성이 매우 높아 효과적인 hydroxy radical을 소거제로 활용될 수 있는데 이러한 이유는 quercetin은 전자편중 (electron delocalization)에 대한 높은 안전성을 가지므로 hydorxy radical에 쉽게 proton 이온을 공여할 수 있기 때문으로 사료되어진다. 반면 (+)- catechin이나 복분자 안토시아닌 분획물의 경우 quercetin보다 다소 낮은 활성을 나타내었는데 이러한 것은 (+)-catechin이나 복분자 안토시아닌 분획물의 경우 hydrogen peroxide를 소거하는 기능뿐만 아니라 hydrogen peroxide 작용을 억제하여 hydroxy radical의 발생을 방지하는 기전으로 작용하는 것으로 생각되어진다. 실제 Fenton 반응에서 2-deoxyribose, FeSO₄EDTA, hydrogen peroxide (H₂O₂)만 첨가된 것에 비하여 2-deoxyribose, FeSO4EDTA, hydrogen peroxide (H2O2)의 혼합물에 (+)-catechin이나 복분자 안토시아닌 분획물이 처리된 경우 파장 532㎚에서 흡광도가 다소 증가하였고 이러한 이유는 복분자 안토시아닌 분획물에 존재하는 안토시아닌성분이나 (+)-catechin 성분이 2-deoxyribose 등과 접합형 축합(conjugation condensate)을 형성하였기 때문이라고 생각되며 이를 통해 hydroxy radical에 의한 손상을 억제하였기 때문으로 생각된다. 이러한 결과는 (+)-catechin과 같은 항산화제가 guaicol-HRP (horse radish peroxidase)-H₂O₂ system을 이용하여 hydrogen peroxide의 소거활성 검정하는데 있어 hydrogen peroxide 소거 활성이 다소 낮으며 HRP에 의해 산화된 guaicol이 (+)-catechin과 같은 phenol성 항산화제와 축합반응을한 결과라고 보고 (Ku and Mun, 2008b)한 것과 유사하였다. 

Fig. 3. Hydroxy radical scavenging activity of several antioxdiant and anthocyanin fraction of Rubus coreanus Miquel (AFRC) fruits. Bars represented mean ± SD (n = 3).

4. 복분자 안토시아닌 분획의 superoxide anion radical 소거 활성

정상적인 산화적 인산화의 과정 동안 소모되는 전체 산소의 0.4-4% 정도는 free radical, superoxide(O₂ · -)로 전환되며, 생성된 superoxide는 다른 ROS로 전환되어 직접적 또는 간접적으로 세포손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 정상적으로는 superoxide는 내인성 항산화 방어기전에서 superoxide dismutase (SOD)에 의해 빠르게 과산화수소 (H₂O₂)로 전환된다. 그러나 이 내인성 항산화 방어체계가 세포내 산화 환원균형을 유지하는데 문제가 생길 경우 결과 적으로 산화적 스트레스가 일어나게 되며, 이 산화적 스트레스는 직접적으로 세포 내 거대분자의 손상을 일으키거나 세포손상을 일으키는데 중요한 역할을 한다 (Korycka-Dahl et al., 1979).

복분자 안토시아닌 분획의 superoxide anion radical 소거활성을 측정하여 합성 항산화제와 polyphenol 화합물과 비교한 결과 (Table 3), 복분자 안토시아닌 분획물의 superoxide anion radical 소거활성은 ascorbic acid나 quercetin 보다는 낮았으나 (+)-catechin 이나 vanillic acid 보다 높은 활성을 나타내어 복분자의 열매로부터 추출한 안토시아닌 분획의 경우 단일 항산화제 성분과 비교할 정도로 높은 superoxide anion radical 소거활성을 가지고 있다고 생각된다. 이러한 결과는 한국 약용식물의 총 폴리페놀 함량과 superoxide 소거활성과 상관관계를 분석한 결과, 상관계수가 0.8111로 높은 것으로 보고 (Kim and Chung, 2002)한 결과와 비교하여 볼 때 복분자 안토시아닌 분획물에 포함되어진 폴리페놀성 화합물인 안토시아닌이 superoxide anion radical 소거활성을 나타내는 것으로 판단되어진다. Vanillic acid의 경우 DPPH radical 소거활성이나 hydroxy radical 소거활성에서 낮은 활성을 나타낸 반면 superoxide anion radical 소거활성에서는 (+)-catechin과 유사한 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 potassium superoxide와 9-benzylacridine로부터 생성된 chemiluminescence를 사용하여 superoxide radical anion에 대한 다양한 phenolic acid의 소거활성을 검정한 결과 (Triantis et al., 2005)와 유사하였다. 

Table 3 . Superoxide anion radical scavenging activities of several antioxidants and anthocyanin fraction in Rubus coreanus Miquel fruits.

5. 복분자 안토시아닌 분획의 환원력 검정

복분자 안토시아닌 분획의 환원력을 검정하여 다른 항산화제와 비교하여 본 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 모든 항산화제와 복분자 안토시아닌 분획의 환원력은 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 복분자 안토시아닌 및 항산화제를 2.976㎍/㎖의 저농도로 적용하는 경우 환원력에 큰 차이를 나타내지 않았으나 5.952㎍/㎖을 적용하는 경우 다른 항산화제의 흡광도가 증가하여 환원력이 높아진 반면 복분자 안토시아닌 분획물의 경우에는 증가되는 흡광도가 다른 항산화제에 미치지 못하였고 이러한 경향은 11.904㎍/㎖으로 농도가 높아짐에 따라 그 차이는 더욱 크게 나타났다. 반면 23.809㎍/㎖을 적용하는 경우 복분자 안토시아닌 분획물의 환원력은 BHT의 환원력에 미치지 못하였고 BHT의 환원력을 100%로 산정하는 경우 약 63%의 환원력을 나타내었으나 같은 농도에서 (+)-catechin이나 quercetin과는 유사한 환원력을 나타내었다. Song 등 (2004)은 겨우살이와 칡뿌리 추출물의 DPPH 및 NO radical에 대한 소거활성과 환원력을 검정하였는데 환원력이 높은 겨우살이 추출물이 라디칼 소거활성 및 환원력에 기인하여 NF-κB 활성을 억제할 수 있다고 보고 하였다 (Song et al., 2004). 복분자 안토시아닌 분획물은 BHT와 같은 합성 항산화제처럼 강한 라디칼 소거활성 또는 reducing power를 나타내었고 일반적으로 식물에 존재하는 폴리페놀성 성분에 비교할 만한 항산화 효과를 지니는 것으로 판단된다. 이러한 결과를 통하여 복분자에 포함되어진 안토시아닌은 강한 항산화 물질로서 높은 환원력 및 라디칼 소거활성을 나타냄으로써 NF-κB활성 조절에 효과적인 소재로 활용되어질 수 있음을 예측할 수 있다.

Fig. 4. Reducing power of several antioxidants and anthocyanin fraction of Rubus coreanus Miquel fruits. AFRC: anthocyanin fraction of Rubus coreanus. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Difference letter (a-b) within a column are significantly different at p < 0.05.

6. 복분자 안토시아닌 분획의 항암활성 검정

생체유전자의 발현을 조절하고, 면역과 스트레스 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NF-κB는 다양한 환경적자극 즉, tumor necrosis factor, IL-I, lipopolysaccharides, ultraviolet (UV)에 대한 반응으로 활성화되는 유도 전사 인자이다 (Li and Karin, 1999). NF-κB활성의 조절은 면역체계와 연관된 감염성 질환 (Baeuerle and Naichwal, 1997) 및 암의 치료에 대한 중요한 목표를 세우는 것으로 제안되어 왔으며 (Calfee-Mason et al., 2002), NF-κB활성을 이끄는 연속된 단계들을 억제할 수 있는 즉, N-acetylcysteine, vitamin E, vitamin C와 같은 항산화제를 포함한 생리활성을 지닌 안전하고 강력한 천연물질들에 대한 연구는 현재까지 관심있는 분야가 되어왔다. 상기 기술한 바 복분자 안토시아닌 분획물의 높은 라디칼 소거활성 및 환원력에 기인하여 암세포의 생육을 억제할 수 있을 것으로 기대되어 복분자 안토시아닌 분획의 인체 암세포주에 대한 세포생육 억제효과를 SRB법으로 검정하여 본 결과는 Table 4와 같다. 암세포주 (LNCaP, 전립선암; HCT-15, 결장암; ACHN, 신장암; A549 폐암; MOLT-4F 백혈병)를 대상으로 세포독성을 실험한 결과, 백혈병 세포주인 MOLT-4F, 신장암세포주인 ACHN 및 결장암 세포주인 HCT-15 에서 복분자 안토시아닌 분획물은 약 500㎍/㎖ 이상에서 암세포 생장 저해 효과를 내어 활성을 나타내지 않는다고 판단된 반면, 전립선암 세포주인 LNCaP와 폐암 세포주인 A549세포에서는 암세포의 생육을 50% 억제하는 농도가 각각 27.6, 16.4㎍/㎖으로 우수한 세포독성 효과를 나타내었다. 복분자 안토시아닌 분획물이 정상 간세포주인 293에 대해 독성을 나타내는가를 확인하기 위해 복분자 안토시아닌 분획물의 농도를 100㎍/㎖로 조제하고 상기 공시된 모든 인간 암세포주에 처리한 결과 60% 전후의 억제율을 나타낸 반면, 정상 간세포주인 293에서는 5% 이하의 생육 억제율을 나타내었다. 이는 복분자 안토시아닌 분획물이 암세포주에 대해서는 높은 생육억제 효과를 나타내지만 정상세포에 대해서는 억제효과가 거의 없는 것을 의미하며 복분자 안토시아닌 분획물이 일반 세포에 대하여서는 높은 안전성이 있음을 시사한다고 하겠다.

Table 4. Cytotoxic activities of anthocyanin fraction from Rubus coreanus Miquel fruits against human cancer cell lines.

이러한 결과는 복분자 미성숙 종자의 물 추출물이 capspase3 효소를 활성화하는 것을 매개로 하여 인간 HT-29 대장암세포로부터 apoptosis를 유발하는 효과를 얻었다는 결과보고 (Kim et al., 2005)와 유색감자 추출물이 전립선암 세포주 중 androgen receptor에 의존적인 LNCaP cell과 androgen receptor에 비의존적인 PC-3 cell에 대한 세포사멸에 관여하며 그 원인 물질이 유색감자에 포함되어 있는 안토시아닌에 근거한다는 보고 (Park et al., 2008) 및 결장암에 대한 길항대사치료제인 5-Flurouracil (5-Fu) 투여 시 암세포뿐만 아니라 소장의 상피세포와 같이 급속하게 생장하는 정상세 포도 손상되는 부작용이 나타나며, 이를 막기 위하여 안토시아닌이 함유된 추출물 (50㎍/㎖ 이상)을 병용 처리할 경우 암세포의 성장억제 효율이 30% 상승될 뿐만 아니라 정상세포에 대한 부작용도 억제된다고 하는 보고 등과 비교해 보면 복분자 안토시아닌 분획물이 정상세포의 생장에는 영향을 미치지 않으면서 특정 암세포주에 대한 높은 항암활성을 나타내어 기존 항암제의 안정성 확보를 위한 병용처리제 및 치료효율을 높일 수 있는 상승 처리제로 활용되어질 수 있음을 나타낸다고 하겠다.

7. 복분자 안토시아닌 분획의 면역증진 활성

인간 면역체계에서 항체 생성의 중요한 역할을 하는 인간 B cell과 T cell에 대한 복분자 안토시아닌 분획물이 생육촉진 효과를 검정한 결과 (Fig. 5, 6), 복분자 안토시아닌 분획물을 0.5㎎/㎖ 수준으로 첨가하는 경우 B cell의 생장은 1일부터 5일까지 증가하는 경향을 나타내었으며, 세포의 초기 밀도가 5.2 (× 10⁴ cell/㎖) 인데 반하여 5일 후에는 12.5 (× 10⁴ cell/㎖)로 나타나 가장 높은 생육도를 나타내었으며 초기 세포 농도의 약 2.4배까지 증가하였다. 단일클론 항체의 생성에 관여하는 cytokine인 IL-6는 배양 초기 32.6 pg/㎖의 농도를 나타내었는데 복분자 안토시아닌 분획물을 처리한 지 6일째 최고 약 78.6 pg/㎖의 분비량을 나타내었다 (Fig. 5). T cell의 경우에서는 배양 초기 밀도가 10.6 (× 10⁴ cell/㎖)를 나타내었는데 복분자 안토시아닌 분획물을 처리한 이후 6일 이후 세포밀도가 24.1 (× 10⁴ cell/㎖)로 나타나 최대 생육 상태를 나타내었고 복분자 안토시아닌 분획물의 처리에 따라 초기 밀도에 약 2.2배 이상의 생육 증진 효과를 나타내었으며, 세포사멸과 면역조절 등의 기능을 수행하고 신호전달계를 활성화를 통해 세포사멸을 유도하거나 암세포괴사, 세포분열, 세포분화, 세포사멸을 유발할 수 있는 cytokine인 TNF-α의 분비량에 있어서도 배양 초기 세포에서 약 29.6 pg/㎖의 농도를 나타낸 반면 복분자 안토시아닌 분획물을 처리한 지 약 7일 이후에 최대의 분비량을 나타내었고 농도는 78.2 pg/㎖의 수준이었다 (Fig. 6). 이러한 결과는 복분자의 안토시아닌 성분이 높은 면역세포생육 증진활성을 나타낸 다는 것을 의미하며 복분자 증류수 및 에탄올 추출물의 B cell과 T cell에 대한 생육 증진효과를 검정한 결과 복분자 열수 추출물을 첨가한지 6일 만에 B cell의 경우 1.5배, T cell의 경우 1.8 배의 세포주 생육 증진효과를 나타내었으며 물 추출물의 경우 0.5㎎/㎖ 처리 시 초기 IL-6 및 TNF-α의 분비량 (35.4, 21.2 pg/㎖)을 6일 후에 70, 78.8 pg/㎖으로 증가시켰다는 결과 (Lee et al., 2003)와 유사하였다. 

Fig. 5. The effect of growth of human immune B-cell (line) and secretion of cytokinin IL-6(bar) by adding 0.5㎎/㎖ of the anthocyanin fraction from Rubus coreanus Miquel fruits. Bars represented mean ± SD (n = 3).

Fig. 6. The effect of growth of human immune T-cell (line) and secretion of cytokinin TNF-α(bar) by adding 0.5㎎/㎖ of the anthocyanin fraction from Rubus coreanus Miquel fruits. Bars represented mean ± SD (n = 3).

상기 결과를 통하여 복분자의 안토시아닌 분획은 합성항산 화제나 식물기원의 단일 폴리페놀 화합물과 비교할 만큼 높은 항산화 효과를 가지고 있고 암세포 생육 억제효과 및 면역 기능 개선 효과를 지니고 있음이 확인되었으며 복분자의 안토시아닌 분획은 식품산업의 건강 기능성 소재로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

Reference

1.Acquaviva R, Russo A and Galvano F. (2003). Cyanidin and cyanidin 3-O-beta-D-glucoside as DNA cleavage protectors and antioxidants. Cell Biology and Toxicology. 19:243-252.
2.Ames BN, Shigenaga MK and Hagen TM. (1993). Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United states of America. 90:7915-7922.
3.Baeuerle PA and Baichwal VR. (1997). NF-kappa B as a frequent target for immunosuppressive and anti-inflammatory molecules. Advances in Immunology. 65:111-137.
4.Byamukama R, Kiremire BT, Andersen ØM and Steigen A. (2005). Anthocyanins from fruits of Rubus pinnatus and Rubus rigidus. Journal of Food Composition and Analysis. 18:599- 605.
5.Calfee-Mason KG, Spear BT and Glauert HP. (2002). Vitamin E inhibits hepatic NF-κB activation in rats administered the hepatic tumor promoter, phenobarbital. Journal of Nutrition. 132:3178-3185.
6.Cha HS, Youn AR, Park PJ, Choi HR and Kim BS. (2007). Physiological characteristics of Rubus coreanus Miquel during maturation. Korean Journal of Food Science and Technology. 39:476-479.
7.Chen F, Sun Y, Zhao G, Liao X, Hu X, Wu J and Wang Z. (2007). Optimization of ultrasound-assisted extraction of anthocyanins in red raspberries and identification of anthocyanins in extract using high performance liquid chromatography mass spectrometry. Ultrasonics Sonochemistry. 14:767-778.
8.Choung MG. (2004). Analysis of anthocyanins. Korean Journal of Crop Science. 49(S):55-67.
9.Chung HY, Baek BS, Song SH, Kim MS, Huh JI, Shim KH, Kim KW and Lee KH. (1997). Xanthine dehydrogenase/ xanthine oxidase and oxidative stress. Age. 20:127-140.
10.Felgines C, Texier O, Besson C, Fraisse D, Lamaison JL and Rémésy C. (2002). Blackberry anthocyanins are slightly bioavailable in rats. Journal of Nutrition. 132:1249-1253
11.Halliwell B, Gutteridge JM and Aruoma OI. (1987). The deoxyribose method: a simple “test-tube” assay for determination of rate constants for reactions of hydroxy radicals. Analytical Biochemisry. 165:215-219
12.Hollman PC. (2001). Evidence for health benefits of plant phenol: local or systemic effects? Journal of the Science of Food and Agriculture. 81:842-852.
13.Jeong HS, Han JG, Ha JH, Kim Y, OH SH, KIm SS, Jeong MH, Choi GP, Park UY and Lee HY. (2009). Antioxidant activities and skin-whitening effects of nano-encapsuled water extract from Rubus coreanus Miquel. Korean Journal of Medicinal Crop Science. 17:83-89.
14.Joo NM, Lee SM and Jeong HS. (2009). Optimization of jelly made with Rubus coreanus (Bokbunja) using response surface methodology. Journal of Food Science and Nutrition. 14:148- 155
15.Jung GT, Ju IO, Choi JS and Hong JS. (2000). The antioxidative, antimicrobial and nitrite scavenging effects of Schizandra chinensis RUPRECHT (Omija) seed. Korean Journal of Food Science and Technology. 32:928-935.
16.Kim EJ, Lee YJ, Shin HK and Park JH. (2005). Induction of apoptosis by the aqueous extract of Rubus coreanum in HT-29 human colon cancer cells. Nutrition. 21(11-12):1141-1148.
17.Kim MK, Jin YS, Heo SI, Shim TH, Sa JH and Wang MH. (2006). Studies for component analysis and antioxidant effect, antimicrobial activity in Acanthopanax senticosus HARMS. Korean Journal of Pharmacognosy. 37:151-156.
18.Kim SH, Chung HG, Jang YS, Park YK, Park HS and Kim SC. (2005). Characteristics and screening of antioxidative activity for the fruits by Rubus coreanus Miq. clones. Journal of Korean Forest Society. 94:11-15.
19.Kim TG, Park MS, Han HM, Kang SY, Jung KK, Rheu HM and Kim SH. (1999). Inhibitory effects of Terminalia chebula, Sanguisorba officinalis, Rubus coreanus and Rheum palmatum on Hepatitis B virus replication in HepG2 2.2.15 cells. Yakhak Hoeji. 43:458-463.
20.Kim YC and Chung SK. (2002). Reactive oxygen radical species scavenging effects of Korean medicinal plant leaves. Food Science and Biotechnology. 11:407-411.
21.Korycka-Dahl M, Richardson T and Hicks CL. (1979). Superoxide dismutase activity in bovine milk serum and its relevance for oxidative stability of milk. Journal of Food Protection. 42: 867-871.
22.Ku CS and Mun SP. (2008a) Optimization of the extraction of anthocyanin from Bokbunja (Rubus coreanus Miq.) marc produced during traditional wine processing and characterization of the extracts. Bioresource Technology. 99:8325-8330.
23.Ku CS and Mun SP. (2008b) Antioxidant activities of ethanol extracts from seeds in fresh Bokbunjda (Rubus coreanus Miq.) and wine processing waste. Bioresource Technology. 99:4503- 4509.
24.Kwon JW, Lee HK, Park HJ, Kwon TO, Choi HR and Song JY. (2011). Screening of biological activities to different ehtanol extracts of Rubus coreanus Miq. Korean Journal of Medicinal Crop Science. 19:325-333.
25.Lazze M, Pizzala R, Savio M, Stivala L, Prosperi E and Bianchi L. (2003). Anthocyanins protect against DNA damage induced by tert-butyl-hydroperoxide in rat smooth muscle and hepatoma cells. Mutation Research. 53:103-115.
26.Lee MK, Lee HS, Choi GP, Oh DH, Kim JD, Yu CH and Lee HY. (2003). Screening of biological activities of the extracts from Rubus coreanus Miq. Korean Journal of Medicinal Crop Science. 11:5-12.
27.Lee SO, Lee HJ, Yu MH, Im HG and Lee IS. (2005). Total polyphenol contents and antioxidant activities of methanol extracts from vegetables produced in Ullung island. Korean Journal of Food Science and Technology. 37:233-240.
28.Lefevre M, Howard L, Most M, Ju Z and Delany J. (2004). Microarray analysis of the effects of grape anthocyanins on hepatic gene expression in mice. The FASEB Journal. 18:A851.
29.Li N and Karin M. (1999). Is NF-κB the sensor of oxidative stress? The FASEB Journal. 13:1137-1143.
30.Nagai T, Nagashima T, Suzuki N and Inoue R. (2005). Antioxidant activity and angiotensin I-converting enzyme inhibition by enzymatic hydrolysates from bee bread. Zeitschrift für Naturforschung. 60:133-138.
31.Oyaizu M. (1986). Studies on product of browning reaction prepared from glucosamine. Japanese Journal of Nutrition. 44:307-315.
32.Park JH, Lee HS, Mun HC, Kim DH, Seong NS, Jung JK, Bang JK and Lee HY. (2004). Effect of ultrasonification process on enhancement of immuno-stimulatory activity of Ephedera sinica Stapf and Rubus coreanus Miq. Korean Journal of Biotechnology and Bioengineering. 19:113-117.
33.Park JH, Oh SM, Lim SS, Lee YS, Shin HK, Oh YS, Choe NH, Park HY and Kim JK. (2006). Induction of heme oxygenase-1 mediates the anti-inflammatory effects of the ethanol extract of Rubus coreanus in murine macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications. 351:146-152
34.Park YE, Jeong JC, Cho HM, Hwang YS, Lee HJ, Choi SS, Lee SJ, Park ES, Ko EA, Kim NS, Lim JD and Choung MG. (2008). Amntimutagenic effect and cytotoxicity to human cancer cell lines of colored potato extracts. Korean Journal of Crop Science. 53:75-84.
35.Park YS, Kim BW, Kim TC, Jang HG, Chon SU, Cho JY, Jiang SH and Heo BG. (2008). Physiological activity of methanol extracts from Korean kiwifruits. Korean Journal of Horticultural Science and Technology. 26:495-500.
36.Ramirez-Tortosa C, Andersen O and Gardner P. (2001). Anthocyanin-rich extract decreases indices of lipid peroxidation and DNA damage in vitamin E depleted rats. Free Radical Biology and Medicine. 31:1033-1037.
37.Rice-Evans CA, Miller N and Paganga G. (1996). Structure antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology and Medicine. 20:933-956.
38.Rossi A, Serraino I and Dugo P. (2003). Protective effects of anthocyanins from blackberry in a rat model of acute lung inflammation. Free Radical Research. 37:891-900.
39.Shin TY, Kim SH, Lee ES, Eom DO and Kim HM. (2002). Action of Rubus coreanus extract on systemic and local anaphylaxis. Phytotherapy Research. 16:508-513.
40.Song HS, Lee YJ, Kim SK, Moon WK, Kim DW, Kim YS and Moon KY. (2004). Downregulatory effect of AGI-1120 (α- glucosidase inhibitor) and chaga mushroom (Inonotus obliquus) on cellular NF-κB activation and their antioxidant activity. Korean Journal of Pharmacognosy. 35:92-97.
41.Tian Q, Giusti MM, Stoner GD and Schwartz SJ. (2006). Characterization of a new anthocyanin in black raspberries (Rubus occidentalis) by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Food Chemistry. 94:465- 468.
42.Triantis T, Stelakis A, Dimotikali D and Papadopoulos K. (2005). Investigations on the antioxidant activity of fruit and vegetable aqueous extracts on superoxide radical anion using chemiluminescence techniques. Analytica Chimica Acta. 536:101-105.
43.Wu X, Cao G and Prior RL. (2002). Absorption and metabolism of anthocyanins in elderly women after consumption of elderberry or blueberry. Journal of Nutrition. 132:1865-1871.
44.Yoo KM, Kim DO and Lee CY. (2007). Evaluation of different methods of antioxidant measurement. Food Science and Biotechnology. 16:177-182.
45.Yoon I, Cho JY, Kuk JH, Wee JH, Jang MY, Ahn TH and Park KH. (2002). Identification and activity of antioxidative compounds from Rubus coreanum fruit. Korean Journal of Food Science and Technology. 34:898-904.
46.Yoon I, Wee JH, Moon JH, Ahn TH and Park KH. (2003). Isolation and identification of quercetin with antioxidative activity from the fruits of Rubus coreanus Miquel. Korean Journal of Food Science and Technology. 35:499-502.