유산균 발효 배초향 추출물의 항산화 활성과 주름개선 효능

1. 시료 제조

추출에 쓰인 배초향은 2012년도 10월 경 수확 된 인도네시 아 원산지로 음건 된 줄기와 잎을 1 ~ 3cm정도 잘게 분쇄 후 추출에 사용하였다. 배초향 시료의 추출은 1 ~ 3cm로 잘게 잘 라진 건조 된 잎과 줄기 부분을 분쇄기를 사용하여 10분간 1300 mesh로 분쇄하였다. 분쇄한 샘플을 에탄올 및 발효 후 에탄올 추출 2가지 추출방법으로 각각 수직 환류냉각기가 설 치되어있는 둥근바닥 플라스크를 사용하여 실험을 진행하 였다. 에탄올 추출물은 건조 된 배초향 100 g을 사용하여 80°C 의 조건에서 70% 에탄올을 용매로 하여 24시간 추출하였 고, 발효 추출물의 경우 건조 된 배초향 100 g을 유산균 Lactobacillus rhamnosus와 Lactobacillus paracasei의 복합균 에 MRS broth 배지 (Difco^TM Lactobacilli MRS broth, BD, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 7일 동안 37°C, 120 rpm에서 배양하였다. 배양 후 에탄올 추출물과 동일하게 70% 에탄올 추출 후 아로니아 추출액을 감압여과기를 사용하여 여과하였다. 여과 후에 회전식 감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축한 후, 동결건조기 (PVTFA 10AT, ILSHINBioBase, Dongducheon, Korea)에 72시간 동안 동결건조하여 분말로 만들어 실험에 사용하였다.

2. 세포 및 시약

HDF (Human dermal fibroblasts)는 CCD-986sk으로 한국 세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 동결 된 것으로 구입하 였다. 구입한 CCD-986sk은 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 그 외 사용된 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)을 통하여 구입, 사용하 였다.

3. DPPH free radical scavenging activity

DPPH (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) free radical scavenging activity 실험은 Dietz (Dietz et al., 2005)의 방법을 변형하여 실험을 진행하였다. 각 공정 별 농도별로 시료 150μl을 첨가 후 methanol로 제조한 0.1 mM DPPH용액 150μl을 혼합하 여 상온에서 30분 간 암실에 방치 한 뒤 517nm의 파장에서 흡광도 측정하였다. 측정한 값은 아래의 식으로 구하여 DPPH radical scavenging activity (%)로 나타내었다.

EQ

4. Elastase 저해율 측정

Elastase 저해율 측정은 Kim 등의 방법을 참고하여 실험을 진행하였다 (Kim et al., 2011). 0.1 M 농도의 Tris-Cl buffer에 1.0 mM의 N-succunyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide을 용해시킨 용액 950μl에 배초향 추출물 50μl를 농도별로 첨 가하여 10분 간 상온에 방치하였다. 10분 뒤 마찬가지로 Tris- Cl buffer에 용해시킨 10μg/ml의 elastase를 50μl만큼 첨가 하여 20분 간 상온에서 배양한 후 410nm의 파장에서 흡광도 를 측정하여 저해율을 확인하였다.

5. MTT용액을 이용한 세포 독성평가

배초향 추출물의 세포 독성 평가에는 MTT 용액을 3-(4,5- dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 사용하였다. 세포 독성 평가에 피부섬유아세포 CCD-986sk를 사용하였고, 해당 세포 를 1.3 × 10⁵ cells/ml 농도로 96-well plate에 주입한 뒤 24시 간 동안 incubator에서 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 실 험하고자 하는 배초향 추출물을 각 농도별로 200μl씩 주입 하여, 다시 24시간 동안 배양하였다. 24시간 뒤 처리했던 상 등액을 제거하고, 200μg/ml 농도로 제조한 MTT 용액을 첨가 하고 37°C에서 빛을 차단한 채 다시 3시간 동안 배양한다. 그 후 MTT 용액을 제거하고, PBS로 2회 세척해준다. 세척 후 DMSO를 200μl 만큼 주입한 뒤 30분 동안의 반응을 시키고 microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 570nm의 파장에서 흡광도를 확인하여 세포 독성을 평가하였다.

6. Human dermal fibroblast (HDF)를 이용한 collagen 생성 실험

CCD-986sk 세포를 이용하여 실험을 진행하였으며, collagen 생성 측정은 Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA Kit (Takara, Otsu, Japan)제품을 사용하였다. Kit에 준비 된 plate 에 Antibody-POD Conjugate Solution을 100μl 넣고, 미리 세포에 처리하여 24시간 동안 배양한 배초향 추출물을 농도별 로 20μl를 첨가한다. 첨가 후 빛을 차단하고 37°C에서 3시 간 동안 배양한다. 3시간 후 배양액을 제거한 뒤, 각 well에 400μl의 washing buffer를 주입하여 4회 세척한다. 세척을 다 한 후 substrate solution을 각 well에 넣고 실온에서 15분 간 다시 방치한다. 배양이 끝나면 stop solution으로 사용 된 1 N H₂SO₄을 100μl을 넣고, plate를 약 1분 간 흔들어 준다. microplate reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, kit의 standard를 사용한 standard curve를 이용하여 정량하였다.

7. MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1) 생성 실험

MMP-1 생성 실험은 Human MMP-1 ELISA Kit (Ray Biotech, Norcross, GA, USA)를 사용하여 실험을 진행하였다. 실험 전 CCD-986sk 세포에 배초향 추출물을 2일 간 배양시 킨 후 배양한 상등액 샘플을 실험에 사용하였다. 키트에 준비 된 plate에 샘플과 standard를 100μl을 주입 한 뒤 상온에 서 2시간 30분 동안 배양한다. 그 뒤 배양액을 제거하고 wash buffer로 4회 반복하여 세척한 후 100μl의 detection Antibody MMP-1을 각 well에 주입하고 다시 1시간 동안 상 온에 방치한다. 1시간 후 다시 배양액을 버리고 4회 세척한 뒤 streptavidin solution을 넣고 45분 동안 상온에서 shaking 해준다. 그 뒤에 배양액을 제거하고 wash buffer로 세척하고 substrate reagent를 주입한 후 30분 동안 빛을 차단한 채 실 온에서 방치하였다. 배양이 끝나면 stop solution을 50μl 넣어 반응을 종결시키고 즉시 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

8. 통계처리

모든 실험의 데이터 통계처리는 3회 반복하였으며, 실험값 의 통계는 SAS (Statistical Analysis System 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 통하여 two-way ANOVA 방법으로 처리하였다. 처리구간의 최소 유의 수준의 차는 p < 0.05로 처리 하였다.

1. DPPH free radical scavenging activity

배초향 추출물의 항산화를 평가하고자 DPPH free radical scavenging activity을 확인하였으며, Fig. 1에 측정 된 결과를 표시하였다. DPPH는 파장 517nm에서 최대 흡광도를 나타내 고, 환원 시에 517nm에서 흡광도가 감소한다.

Fig. 1.

DPPH Free radical scavenging activity of the Agastache rugosa extracts by different extraction process.Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Mean with difference letter (A-C) within same sample are significantly different at p < 0.05 and mean with difference letter (a-b) within same concentration are significantly different at p < 0.05. 1)EE: 70% Ethanol Extract. 2)FEE: 70% Ethanol Extract by fermentation process.

양성대조군인 Ascorbic acid는 0.2mg/ml의 농도에서 82.22%의 DPPH 자유라디칼 소거능을 보였다. 이와 비교하여 배초향 추출물은 0.03mg/ml의 낮은 농도에서 70% 에탄올 추 출물 (EE)은 28.45%, 발효 에탄올 추출물 (FEE)은 34.81%로 유의적인 차이를 보였으나, 가장 높은 농도인 0.1mg/ml에서 EE는 62.71%의 소거능을, FEE의 경우에는 62.98%로 유의적 인 차이를 보이지 않았다. 모든 시료는 농도가 증가함에 따라 DPPH 소거활성이 증가하는 것을 확인하였다. 일반 에탄올 추 출물에 비해 발효 공정을 거친 에탄올 추출물의 소거활성이 더 높긴 하나 그 차이는 크지 않았다. 이를 바탕으로 항산화 효능과 연관지어 항 주름의 효능을 측정 한 연구를 참고하여 (Jang et al., 2013), 배초향 시료를 통한 주름개선효능에 대한 평가를 진행하였다.

2. Elastase 저해율 측정

피부조직에 탄력을 유지해주는 elastin을 저해하여 피부 주 름생성에 원인이 되는 elastase 저해율을 측정하여 그 결과를 Fig. 2에 확인하였다. 가장 높은 농도인 0.3mg/ml에서 70% 에탄올 추출물의 경우 20.3%의 저해율을 보였다. 농도가 증가 함에 따라 유의적인 차이를 보이며 저해율이 증가하였으며, 발 효 공정을 통한 70% 에탄올 추출물은 23.0%로 확인되었다. 발효 전 보다 발효 후에 elastase 저해율이 소량 증가하였으며, 상기와 같은 배초향 추출물의 저해율은 주름개선효과에 대하 여 연구 보고 된 도화 에탄올 추출물과 비교시, 도화 에탄올 추출물의 경우 0.5mg/ml의 농도에서 약 13%에 달하는 저해 율이 확인되었다 (Lee and An, 2010). 보다 낮은 농도에서 23.0%로 확인 된 배초향 추출물의 저해율을 보아 주름개선에 대한 효능을 확인하였다.

Fig. 2.

Elastase inhibition of the Agastache rugosa extracts by different extraction process.Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Mean with difference letter (A-C) within same sample are significantly different at p < 0.05 and mean with difference letter (a-b) within same concentration are significantly different at p < 0.05. 1)EE: 70% Ethanol Extract. 2)FEE: 70% Ethanol Extract by fermentation process.

3. MTT용액을 이용한 세포 독성평가

세포 실험을 실시하기 전 정상세포에 대한 배초향 추출물의 세포독성을 측정하기 위해 섬유아세포인 CCD-986sk 세포를 사용하여 독성평가를 실시하였다. 해당결과는 Fig. 3에 표시하 였다. 70% 에탄올 배초향 추출물은 1.0mg/ml의 농도에서 15.68%의 독성을 보였으며, 발효 공정을 거친 70% 에탄올 추 출물은 16.26%의 세포독성으로 유의적인 차이는 없었다. 각 추출물은 농도별 대부분 유의적인 차이를 보이며 독성이 증가 하였으나, 이와 같은 독성은 다른 세포독성을 실시한 연구와 비교하면 주름개선효능에 관한 같은 세포로 실시한 청미래덩 굴에 대한 연구를 확인하였을 때 (Lee and Lee, 2013), 실험 에 쓰인 가장 높은 농도에서 생존률이 약 83%에 달하였다. 이를 참고로 하였을 때, 배초향 추출물의 16.26%의 독성은 주 름개선 효능을 확인하는 세포실험에 있어 독성이 높지 않은 것으로 판단되어 세포 실험을 진행하였다.

Fig. 3.

Cell cytotoxicity of the Agastache rugosa extracts by different extraction process.Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Mean with difference letter (A-C) within same sample are significantly different at p < 0.05 and mean with difference letter (a-b) within same concentration are significantly different at p < 0.05. 1)EE: 70% Ethanol Extract. 2)FEE: 70% Ethanol Extract by fermentation process.

4. Human dermal fibroblast (HDF)를 이용한 collagen 생성 실험

배초향 추출물의 주름개선에 대한 효능을 확인하기 위하여, 피부의 탄력을 유지해주는 단백질인 collagen 생성 정도를 확 인하였다. Fig. 4을 보면, EE의 경우 농도에 따른 상승폭이 미미하였으며, FEE는 0.3mg/ml의 농도에서 EE와 생성량이 비슷하였으나 농도가 상승함에 따라 유의적인 차이를 보이 며 증가하였다. 1.0mg/ml의 농도에서 EE는 77.4 ng/ml의 collagen이 생성되었으며, FEE는 113.1 ng/ml의 생성량으로 EE에 비해 증가하였다. 이와 같은 결과는 발효공정이 collagen 생성량 증가에 도움이 되었다고 볼 수 있으며, 앞서 DPPH의 결과에 대한 항산화 활성 증가에 비해 collagen 생성량의 증 가가 더욱 뚜렷하게 확인 되었다. 추가적으로 주름생성의 또 다른 원인인 collagen 생성을 저해하는 효소 MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1)의 생성량을 측정하여 배초향 추출물의 항 주름 효능을 확인하였다.

Fig. 4.

Collagen production of the Agastache rugosa extracts by different extraction process.Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Mean with difference letter (A-C) within same sample are significantly different at p < 0.05 and mean with difference letter (a-b) within same concentration are significantly different at p < 0.05. 1)EE: 70% Ethanol Extract. 2)FEE: 70% Ethanol Extract by fermentation process.

5. MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1) 생성 실험

MMP-1은 피부탄력을 유지시켜주는 collagen을 분해하는 collagenase의 하나로 MMP-1의 생성량이 적을수록 주름개선 에 대한 효능은 높은 것으로 확인할 수 있다. MMP-1의 생성 량은 Fig. 5에 나타내었다. 모든 샘플이 농도가 증가함에 따라 MMP-1의 생성량이 감소하였다. 가장 높은 농도 1.0mg/ml에 서 EE는 1632 pg/ml의 생성량이 확인되었고, FEE는 1398 pg/ml로 EE에 비해 유의적인 차이를 보이며 감소한 것을 확 인할 수 있었다. 주름개선효능에 대하여 연구 된 바 있는 황 철나무등의 연구를 보면 (Shin et al., 2013), 황철나무 추출물 은 농도가 10배 낮은 0.1mg/ml에서 2030 ng/ml의 MMP-1의 생성량이 측정되었다. 배초향 추출물의 농도가 10배 높으나, 그 생성량의 차이가 20 ~ 30배 이상 낮은 것으로 보아 배초향 추출물에 대한 MMP-1의 생성량 저해 활성을 확인하였고, 항 주름 활성에 효능이 있음을 확인하였다. 발효 공정을 실시하 였을 때 MMP-1의 생성량이 저해 되어 발효가 주름개선에 도 움이 되었다 판단할 수 있다.

Fig. 5.

MMP-1 production (pg/ml) of the Agastache rugosa extracts by different extraction process. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Mean with difference letter (A-D) within same sample are significantly different at p < 0.05 and mean with difference letter (a-b) within same concentration are significantly different at p < 0.05. 1)EE: 70% Ethanol Extract. 2)FEE: 70% Ethanol Extract by fermentation process.

본 연구는 배초향의 항산화 효능을 본 후 항노화에 대한 효 과를 확인하기 위하여, 피부의 탄력 유지 단백질인 collagen 생성과 collagen의 생성을 저해하는 효소 MMP-1의 생성량을 측정하여 배초향 추출물의 주름개선에 대한 효과를 확인하였 다. 배초향에 발효공정을 도입함으로서 일반 종래 추출법에 비 하여 항주름에 대한 효능 증진을 확인하였다. 본 연구와 유사 한 유산균으로 발효한 도꼬마리 추출물과 톳 추출물 등의 경 우도 발효 후 추출물들의 항산화 활성이 증가된 것으로 나타 났으며, 이의 주된 원인은 발효에 의한 천연물 내 유용성분의 함량이 증가한 것으로 확인되었다 (Kang and Kim, 2010; Song et al., 2011). 본 실험 결과도 유사한 경향을 보여 배초 향의 경우도 항산화능의 증가가 동종의 균의 발효에 의한 배 초향 내 acacetin, agastachin 등의 유용성분 함량 증가에 의 한 것으로 예상되었으나 유산균 발효에 의한 배초향의 구체적 인 유효성분 변화에 대해서 향후 심도 있는 별도의 연구가 필 요할 것으로 판단되었다. 이와 같은 배초향의 항주름에 대한 결과로 향장소재로서 배초향의 새로운 가능성을 확인하였다.