율무 종자 오염 Fusarium 속 진균 저감화를 위한 이화학적 처리

1. 율무 분리 Fusarium 속 진균 대상 종자 소독 약제 약효 검정

실험에 사용한 Fusarium 속 진균 10종은 F. miscanthi, F. kyushuense, F. concentricum, F. asiaticum, F. incarnatum, F. fujikuroi, F. armeniacum, F. graminearum, F. thapsinum, F. polyphialidicum 으로 2012년도에 경기 연천, 전남 화순 농 가포장과 충북 음성 인삼특작부 약용작물 시험포장에서 수확 한 율무 (Coix lacryma-jobi L.) 종자에서 분리 • 동정 하였으 며 –70°C 초저온 냉동고 (Fisher Scientific, Seoul, Korea)에 서 보관하면서 사용하였다 (Fig 1). 사용 약제는 국내 재배 작 물에 종자소독약제로 등록되어 있는 헥사코나졸 • 프로클로라 즈 유제 (Hankooksamgong Co., Suwon, Korea) 등 11품목 과 NaOCl (Daejung Chemicals, Siheung, Korea) 4% 용액 을 이용하였다. 각각의 처리 약제를 작물보호제사용지침서에 명시된 사용기준량에 따라 증류수에 희석한 potato dextrose agar (BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) 약제배지 (100 × 15mm 페트리디시)를 제조하였으며 페트리디시 (SPL, Pocheon, Korea)의 중앙부에 25°C 5일간 암배양한 균주에서 균사의 생육이 가장 왕성한 외곽 부위를 6mm cork borer (DH-KA0049, Daihan Scientific, Wonju, Korea)로 잘라내어 agar plug를 접종한 후 25°C 항온기 (WIM-RL4, Daihan Scientific, Wonju, Korea)에서 7일간 암배양 후 균총의 직경 을 측정하여 항균활성 여부를 조사하였다.

Fig. 1.

Ten species of Fusarium isolated from adlay.Scale bar = 10 μm. A; Fusarium fujikuroi, B; Fusarium asiaticum, C; Fusarium concentricum, D; Fusarium graminearum, E; Fusarium thapsinum, F; Fusarium armeniacum, G; Fusarium miscanthi, H; Fusarium kyushuense, I; Fusarium polyphialidicum, J; Fusarium incarnatum.

2. 율무 종자 오염 진균 대상 이화학적 처리 효과 검정

실험에 사용한 율무 종자는 2013년 11월 충북 음성 국립원 예특작과학원 인삼특작부 약용작물 포장에서 수확한 조숙, 단 간, 다수성 율무 품종 ‘조현’ (Jang et al., 2005)으로 수확 후 7개월간 비닐하우스에서 상온보관하고 자연건조 시킨 수분 함량 15%의 종자를 사용하였다. 율무 종자를 헥사코나졸 • 프 로클로라즈 유제 등 11품목의 농약과 NaOCl 4% 용액에 24 시간 침지시킨 시료와 80°C water bath (WCB-22, Daihan Scientific, Wonju, Korea)에서 각각 1분, 10분 침지시킨 시료 를 만들어 다시 15%의 수분함량이 될 때까지 건조기 (DS- 80-1, Dasol Scientific, Hwaseong, Korea)에서 40°C로 건조시 킨 후 분쇄기 (WF2211214, Waring Commercial, Torrington, CT, USA)를 이용 곱게 갈아 대한민국약전의 미생물한도시험 법에 의거하여 멸균 증류수에 희석하고 streptomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 포함한 1/10 PDA 항생제 배지 (100 × 15mm 페트리디시)를 제조 한 후 도말하고 율무 시료 g 당 총 진균수를 측정하였다.

3. 이화학적 처리가 율무 종자에 미치는 약해 검정

율무 종자와 처리내용은 종자 오염 진균 대상 이화학적 처 리효과 검정과 동일하게 하였으며 종자의 발아율, 유아, 유근 의 생체중, 초기생육을 측정하여 무처리구와 비교하고 약해유 무를 판단하였다. 처리구별 종자의 발아율은 100 × 15mm 페트 리디시에 2장의 여과지 (110mm, Whatman, Buckinghamshire, England) 를 깔고 증류수를 흘러내리지 않을 정도로 여과지에 충분히 적신 다음 처리 종자를 3회 멸균 증류수에 세척하고 30립씩 3반복으로 파종한 후 셀로판테잎으로 밀봉하여 25°C 항온기에서 배양하면서 파종 7일 후 최종 발아율을 조사하였 다. 유아, 유근의 생체중은 페트리디시에 파종 7일 후 유아와 유근을 잘라 개체 당 평균 무게를 측정하였고 초기생육은 200 × 200mm 사각포트에 원예용 범용상토를 멸균기 (LS1508- 20W, Dasol Scientific, Hwaseong, Korea)에서 30분간 2회 멸균한 후 담고 각각의 처리 종자를 3회 멸균 증류수에 세척 하고 2cm 깊이로 1립씩 포트당 5립, 3반복으로 파종하고 매 일 1회씩 충분한 관수를 해주면서 파종 1개월 후 출아한 유 묘의 간장 (plant height)을 측정하였다.

4. NaOCl 처리농도 및 시간에 따른 율무 종자오염 진균 사 멸효과와 약해 검정

본 실험은 율무 종자를 각각 1과 4% NaOCl 용액에 침종 시간을 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간으로 세분화 하여 처리하였다. 처리 후 3회 멸균 증류수에 세척하 고 건조기에서 40°C로 건조시킨 후 분쇄기를 이용 곱게 갈아 대한민국약전의 미생물한도시험법에 의거하여 멸균 증류수에 희석하고 streptomycin을 포함한 1/10 Potato dextrose agar (BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) 항생제 배지 (100 × 15mm 페트리디시)를 제조 한 후 도말하고 plate 당 총 진균수를 측정하여 율무종자에 오염된 진균의 사멸 효과를 무 처리구와 비교하여 검정하였다. 종자의 발아율, 출아율, 간장, 지상부 생체중을 측정, 무처리구와 비교하여 약해유무를 판단 하였다. 처리구별 종자의 발아율은 이화학적 처리가 율무 종 자에 미치는 약해 검정과 동일한 처리 방법으로 처리 후 측정 하였다. 출아율은 각각의 처리 시료를 200 × 200mm 사각포트 에 원예용 범용상토를 121°C에서 30분간 2회 멸균한 후 담아 2cm 깊이로 1립씩 포트당 5립, 3반복으로 파종하고 각 처리 구당 3반복으로 매일 1회씩 물 관리를 해주면서 출아가 완료 된 1개월 후 조사하였다. 간장, 지상부 생체중은 사각포트 파 종 70일 후 측정하였다.

5. 통계분석

통계분석은 SAS Enterprise 4.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 사용하여 일원분산분석 (one-way anaysis of variance)을 하였으며 Duncan’ Multiple Range Test (p < 0.05)를 이용하여 유의성을 검정하였다.

1. 종자 소독 약제 처리에 따른 Fusarium 속 균의 균사생장 억제 효과

율무 (Coix lacryma-jobi L.)에서 분리한 Fusarium graminearum 등 10종의 균을 대상으로 실험한 결과 볍씨 종자 소독 약제로 등록되어 있는 프로클로라즈유제, 헥사코나졸프로 클로라즈유제 등 2종의 약제가 모든 균에 대해 균사생장 억제 효과를 보였으며 4% NaOCl 의 경우 균사생장 억제 및 용균 작용을 나타내었다. 반면 보리 겉깜부기병 (병원균 : Ustilago), 줄무늬병 (병원균 : Helminthosporium) 등에 방제약제로 등록되 어 있는 카복신티람분제와 벼 도열병 (병원균 : Pyricularia), 깨 씨무늬병 (병원균 : Cochliobolus), 키다리병 (병원균 : F. fujikuroi), 당귀 점무늬병 (병원균 : Phoma), 더덕 녹병 (병원 균 : Coleosporium) 등에 방제약제로 등록되어 있는 테부코나졸 유제, 벼 모썩음병 (병원균 : Achlya)에 등록되어 있는 하이멕사 졸메타락실엠액제는 10종의 시험 대상 Fusarium 속 진균 중 일 부균에 대해 접종한 agar plug 위로만 균사가 생장하는 기중균 사 (aerial hyphae)를 형성하여 특정균주에 대한 균사 생장억제 효과가 다소 떨어지는 경향이었다. 그 외 시험약제인 톨클로포 스메틸분제, 티오파네이트메틸•트리플루미졸수화제, 프로클로 라즈코퍼클로라이드•테부코나졸액상수화제, 플루디옥소닐액상 수화제, 플루퀸코나졸•프로피네브수화제, 플루퀸코나졸수화제 는 무처리 대비하여 Fusarium 속 균에 대해 일정 수준의 균사 생장 억제 능력은 인정 되었으나 프로클로라즈유제, 헥사코나졸 프로클로라즈유제와 4% NaOCl 처리에 비해서는 균사생장 억 제 효과가 현저히 떨어지는 경향이었다 (Table 1. and Fig. 2.).

Table 1.

Mycelial growth inhibition of seed disinfectants to ten Fusarium species.

Fig. 2.

Antifungal activity of seed disinfectants to ten Fusarium species.Number of treatments are same with No. of Table 1.

2. 이화학적 처리가 율무 종자오염 진균 및 종자에 미치는 영향

율무 종자를 대상으로 실험한 결과 무처리 대조구 (7.7 × 10⁴ CFU/g) 에 비해 카복신티람분제, 티오파네이트메틸 트리플루미졸수화제, 프로클로라즈유제, 헥사코나졸프로클로라 즈유제는 각각 1.6 × 10⁴, 1.1 × 10⁴, 1.7 × 10⁴, 1.2 × 10⁴ CFU/ g으로 유의적으로 총균수가 낮게 검출되었으며 테부코나졸유 제, 톨클로포스메틸분제, 프로클로라즈코퍼클로라이드테부코나 졸액상수화제, 플루디옥소닐액상수화제, 플루퀸코나졸프로피네 브수화제, 플루퀸코나졸수화제, 하이멕사졸메타락실엠액제는 무처리 대비하여 유의성이 없거나 유의적으로 높게 총균수가 검출되었는데 특히 톨클로포스메틸분제와 플루디옥소닐액상수 화제의 경우 균 검출량이 각각 1.0 × 10⁵, 3.0 × 10⁵CFU/g으로 매우 높은 수준으로 검출되었다 (Fig. 3.).

Fig. 3.

Total number of fungi according to seed treatments.Number of treatments (1 to 12) are same with No. of Table 1, Number 13 and 14 mean treatments of soaking in 80°C water during one and ten minute, respectively. Number 15 mean non treated control. Means with the different letter (a - d) are significantly different at p < 0.05.

이 실험의 결과는 종자 소독 약제 처리에 따른 Fusarium 속 균의 균사생장 억제 효과와도 매우 유사한 경향이었지만 본 실험에서 검출된 균은 미동정 진균과 함께 Fusarium 속 진균을 함께 포함하고 있어 24시간 농약 침지 시 종피 안쪽에 들어가 있는 일부 Fusarium 속 진균에는 약효가 미치지 않았 을 것으로 사료된다. 처리에 따른 율무 종자의 발아율은 무처 리 대비 11개 품목 약제가 유의적으로 높은 수준이었다 (Fig. 4.). 또한 24시간 4% NaOCl, 1분, 10분 80°C온탕 처리의 경 우 균검출이 전혀 없었으나 이 경우 종자의 발아율도 0%로 약해가 인정되었다 (Fig. 3, 4.).

Fig. 4.

Seed germination rate according to seed disinfectants.Number of treatments are same with No. of Fig. 2. Means with the different letter (a - d) are significantly different at p < 0.05.

약제 처리 후 페트리디시에서 최아시킨 종자의 유아 (plumule) 및 유근 (radical) 생체중은 11개 처리약제 모두 무 처리 보다 낮았으나 (Fig. 5.) 상토 파종, 출아 후 초기생육은 오히려 무처리 대비하여 차이가 없었으며 페트리디시상에서 발아가 전혀 되지 않았던 4% NaOCl 처리의 경우 상토에 파 종 시 발아하여 출아가 되는 종자가 관찰되었는데 (Fig. 6.) 이러한 결과는 4% NaOCl 처리 후 종자 발아 실험 시 페트 리디시에 파종한 종자에 잔존하는 NaOCl 성분에 의한 약해로 판단되며 반면 상토 파종 시에는 매일 1회씩 포트에 관수를 해주어 종자에 잔존하는 발아저해 성분이 희석되고 점차 줄어 들었을 것으로 사료된다. 결과를 종합해 보면 24시간 이화학 적 처리 시 11개 약제는 약해가 인정되지 않으나 종피 안쪽에 들어가 있는 균방제가 어렵고 반대로 4% NaOCl 처리 시 약 해는 인정되나 완전한 균 방제가 가능하였다. 이에 NaOCl을 농도별, 시간별로 세분화 하여 실험을 수행하였다.

Fig. 5.

Fresh weight of plumule and radical according to seed disinfectants.*Means with significant difference in the fresh weight of plumule and radical, respectively (p < 0.05).

Fig. 6.

Plant height of seedlings according to seed disinfectants.Number of treatments are same with No. of Fig. 2. Means with the different letter (a - e) are significantly different at p < 0.05.

3. NaOCl 처리농도 및 시간이 율무종자 오염 진균 및 종자 에 미치는 영향

NaOCl을 율무 종자에 처리 하였을 때 침종시간 (10 min, 30 min, 1 hr, 3 hr, 6 hr, 12 hr, 24 hr)에 따른 균검출은 1% NaOCl 처리의 경우 24시간 까지 계속 되었으나 4% NaOCl 의 경우 3시간 침종 후부터 검출이 거의 없다가 6시간 후부터 는 완전히 무검출 되었고 (Fig. 7.) 또한 율무 종자 침종시간 에 따른 발아율은 1과 4% NaOCl 처리 모두 침종시간이 길 어짐에 따라 낮아지는 경향이었으나 (Fig. 8.) 출아율은 12시 간 침종 때까지 무처리 대비 유사하다가 24시간 침종시에는 유의적으로 낮아지는 경향을 보였다 (Fig. 9.). 본 실험의 결과 는 Fig. 6.에서 보여주는 결과와 마찬가지로 발아 시험에서는 치상한 종자에 NaOCl 성분이 잔존하여 약해를 주었을 것으로 판단하며 반면 상토 파종 시에는 매일 1회씩의 관수에 의해 종 자에 잔존하는 NaOCl 성분이 희석되고 점차 줄어들어 12시간 침종처리 까지는 약해가 나타나지 않았을 것으로 사료된다.

Fig. 7.

Number of total fungi in the adlay depending on NaOCl soaking period.

Fig. 8.

Germination rate of adlay depending on NaOCl soaking period.Means with the different letter (a - d) are significantly different in the germination rate by 1 and 4% NaOCl, respectively (p < 0.05).

Fig. 9.

Emergence rate of adlay depending on NaOCl soaking period.*Means with significant difference in the emergence rate by 1 and 4% NaOCl, respectively (p < 0.05).

1과 4% NaOCl 처리 시 율무 종자 침종시간 (10 min, 30 min, 1 hr, 3 hr, 6 hr, 12 hr)에 따른 식물체 크기와 지상부 생체중은 유의성이 없이 무처리 대비 유사하여 약해가 인정되 지 않았다 (Fig. 10, 11, 12, 13.). 따라서 본 실험들의 결과 를 종합할 때 율무 종자를 4% NaOCl 에 6 - 12시간 침종하 여 파종하면 Fusarium 속 균을 포함한 종자오염균의 효과적 방제가 가능할 것으로 사료된다. 수확 후 한약재 및 식품용도 로 섭취하는 율무 종자를 대상으로 곰팡이독소 및 곰팡이 오 염 저감화를 위한 건조저장 조건이 선행 연구로 제시된 바 있 는데 (Choi et al., 2014) 본 연구는 종자 전염으로 인해 야 기될 수 있는 곰팡이독소 오염 가능성을 사전에 차단하기 위 한 이화학적 처리로서 율무 오염 Fusarium 속 진균을 저감화 하기 위한 재배 단계에서의 효과적 방안으로 제시하는 바이다.

Fig. 10.

Plant height after 70 days later depending on soaking period in the 1% NaOCl treatment.Means with the same letter is not significantly different at p < 0.05.

Fig. 11.

Plant weight after 70 days later depending on soaking period in the 1% NaOCl treatment.Means with the same letter is not significantly different at p < 0.05.

Fig. 12.

Plant height after 70 days later depending on soaking period in the 4% NaOCl treatment.Means with the same letter is not significantly different at p < 0.05.

Fig. 13.

Plant weight after 70 days later depending on soaking period in the 4% NaOCl treatment.Means with the same letter is not significantly different at p < 0.05.