국내 유통중인 약용작물의 생물학적 위해요소 모니터링
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Abstract
The public has increasing concerns about herbal crops owing to insufficient information on biological hazards such as foodborne pathogens. Therefore, the objective of this study is the development of a herbal crop quality control system through monitoring with biological hazard analysis. Today, it is estimated that millions of people become ill every year from food contamination. The public demands agricultural products of stable and consistent quality. Governments have the responsibility of establishing the standards, legislation and enforcement programs necessary to control food quality and safety. However, research on the biosafety of herbal crop products is still insufficient. Therefore, the implementation of monitoring systems with high standards is critical for public safety.
In this study, we collected 52 samples of herbal crop products, and conducted both quantitative and qualitative biological hazard analysis. With biological hazard analysis, aerobic bacteria, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Escherichia coli, Coliforms, and Listeria spp. could be detected.
Herbal crops were found to be contaminated with aerobic bacteria at 3.69 ± 0.32 log CFU/g. Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Escherichia coli, Coliforms, and Listeria spp. were not detected in any of the samples. This research suggests that continuous monitoring of biological hazards is required to improve the quality of herbal crops.
Keywords:
Biological Hazard Analysis, Food Safety, Herbal crops, Natural Product서 언
2015년 통계청에서 발표한 “2014년 사망원인통계’에 따르 면, 우리나라 국민의 사망원인 중 47.7%를 차지하고 있는 3대 사인은 악성신생물 (암), 뇌혈관 질환, 심장질환 순이며, 이러한 질병의 발생과 진행에 선진국형 경제사회적 구조에 의 한 식생활의 변화, 환경오염 그리고 스트레스 등과 같은 생활 양식의 변화에 큰 영향이 있으므로, 오늘날 성인병 내지 생활 습관병으로 부른다 (Sung et al., 2004; Han et al., 2006; Ryu et al., 2012; Lee et al., 2014a). 우리나라는 의료수준향 상으로 평균수명이 증가하고 고령화 사회로 변화하면서, 과거 와는 다르게 물질만능주의에서 개인의 건강을 더 중시하는 웰 빙 (well being)이 시대적 트렌드로 부상하고 있으며, 치료의 개념이 더해진 힐빙 (heal being)으로 점차 확대되고 있다 (Lee, 2013; Lee et al., 2014b). 힐빙의 주역으로 주목받고 있는 약용식물은 식약동원 (食藥同源)의 개념과 함께 식의약 소재로 발전되어왔으며, 최근에는 차, 음료수 또는 간편한 식 사대용품과 함께 과학적 근거를 통한 천연물신약으로서 새로 운 가치를 인정받고 있다 (Lee, 2013; Park et al., 2012, 2015).
그러나 일정기간 보관되었다가 한약재 등으로 공급되는 약 용작물은 성상, 순도, 유효성분 등의 품질규격화 연구에만 초 점이 맞추어져 왔으며, 재배, 수확 후 저장, 가공, 포장, 유통 등의 과정에서 비의도적으로 발생할 수 있는 미생물에 의한 품질하락에 대해서는 아직 연구가 미진한 실정이다 (Kim, 2006; Park et al., 2012). 특히 농식품은 수확 후 흙이 묻어 있는 상태로 보관 또는 유통될 수 있으며, 건조가 제대로 안 되거나 수분이 다시 흡수될 경우에는 주변 환경을 통한 오염 가능성이 매우 높다 (Choi et al., 2000; Park et al., 2012).
우리 주변 환경에서 흔히 존재하는 식중독균인 황색포도상 구균 (Staphylococcus aureus)의 경우, 80℃에서 30분간 가열 하면 사멸되기 때문에 탕제나 가공 후 사용되는 약용작물은 미생물에 대하여 안전하다고 오인될 수 있으나, 황색포도상구 균이 생산한 장독소 (enterotoxin)는 100℃에서 30분간 가열하 더라도 파괴되지 않고 건조, 냉장, 냉동, 상온 등의 대부분의 유통 조건에서 안정하며 방사선에 의해서도 잘 파괴되지 않는 다 (Hwang et al., 2010; Oh and Kim, 2013; Ryu and Lee, 2011). 또한 황색포도상구균은 거의 모든 종류의 항생제 에 광범위한 내성을 획득한 메티실린-내성 황색포도상구균 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 등의 슈퍼박테리 아로 발달된 경우가 많으므로 품질관리에 신중을 기해야 할 것으로 사료되며, 미생물에 의한 품질저하는 약용작물에 대한 소비자의 신뢰를 하락시킬 수 있고 소비위축과 생산재배의 감 소 등의 부정적인 영향을 초래할 수 있다 (Hwang et al., 2010; KFDA, 2010; Kim and Park, 2015). 또한 지구 온난화 등의 기후변화에 따라 농작물에 고온 및 염류장애 발생으로 인 한 생산량과 품질이 크게 변화할 가능성이 있으므로 품질하락 이 발생되지 않도록 보관조건에 따른 분석연구가 필요하며 품 질을 관리하고 향상시키기 위해서는 각 생산 단계별 품질관리 를 위한 별도의 기술개발이 시급히 요구된다 (Jo et al., 2014).
그러므로 본 연구에서는 약용작물 품질향상기술개발을 위하 여 2013년부터 2015년까지 시중에 한약규격품으로 유통 중인 한약재를 선별하여 세균수 측정을 통한 품질 모니터링을 실시 하고 세균을 분리 및 동정하여 안전한 식의약소재로 개발하기 위한 기초자료를 확보하고자 하였다.
재료 및 방법
. 실험재료 및 전처리
실험에 사용된 약용작물은 국내에서 판매되는 한약규격품을 유통구조와 경제성을 고려하여 제약회사를 구분하지 않고 한 국생약협회 및 서울 경동시장 등에서 한약규격품으로 구입하 여 사용하였다. 즉, 일반 소비자가 구입하는 방법과 최대한 동 일하게 원산지로서 생산국가에 대해서만 구분하였고 생산자나 유통업자, 제조회사에 대한 조사는 있었으나 농가보호차원에 서 이번 연구에서는 공개하지 않았다. 따라서 원산지별 구분 은 총 52품목 중 국산이 12품목, 중국산 37품목, 기타 3품목이 며, 식물부위별 구분은 aerial part (지상부), leaf, whole pant (전초) 각 2품목, seed 5품목, bark 4품목, fruit 10품목, fruit pell, spike, flower, stem, stem 및 rhizome, tuber는 각 1품목으로서, 국립원예특작과학원 약용작물과 냉동고에 보관 하면서 사용하였다. 구입된 모든 시료는 biosafety cabinet (Labconco Co., Kansas City, MO, USA)에서 무균적으로 처리 되었으며, 모든 검체는 멸균한 시약스푼이나 멸균한 가위를 이 용하였다.
. 총호기성균 (Total aerobic bacteria) 정량분석
총호기성균의 정량분석은 petrifilm aerobic count plate (3M Co., St. Paul, MN, USA)를 사용하여 제조사에서 제공 한 실험방법에 따라 수행하였다. 수집된 약용작물의 시료를 무 균적으로 균질화한 뒤에 채취된 검체 25 g에 225㎖의 Buffered Peptone Water (BPW, KisanBio, Seoul, Korea)를 가하여 stomach (Daihan Scientific, Wonju, Korea)를 이용하여 2분간 균질화하였고 1㎖을 취하여 9㎖의 BPW를 사용하여 단계별로 10배 계열 희석하였다. BPW의 용량은 (시료의 무 게 ×희석배수)-시료의 무게로 계산하였다. 이후, 각 단계의 희석액에서 1㎖씩을 3매의 plate에 무균적으로 분주하였고 37℃에서 28시간에서 48시간 배양 후 plate에 포함되어 있는 Triphenyl- Tetrazolium Chloride (TTC) 지시약에 의하여 산화환원 반 응으로 생성된 붉은색 집락을 계수하였다. 또한 하나의 plate 위 에 30 - 300개의 집락이 있는 plate만을 계수하였으며 시료로 사 용된 약용작물 1 g당 세균 집락 수 [Colony Forming Units (CFU)/g = plate 위에 형성된 평균 집락 수 시료의 희석 배수] 로 계산하였다. 시료의 특성에 따라 수화 (liquefier)현상이 나 타날 경우 petrifilm rapid aerobic count plate (3M Co., St. Paul, MN, USA)를 이용하여 24시간 배양 후 평균 집락 수 를 계산하였다. Table 1
The aerial parts of herbal crop for investigation of microorganism contamination.
. 대장균 및 대장균군 정량분석
대장균 (Escherichia coli) 및 대장균군 (Coliform)의 정량분 석은 E. coli/Coliform count plate petrifilm (3M Co., St. Paul, MN, USA)를 사용하였다. 약용작물을 분쇄한 시료 25 g 에 225㎖ BPW를 가한 후 stomach를 이용하여 2분 동안 균질화 하였다. plate에 균질화한 시료 1㎖를 접종한 후 35℃ 에서 24시간 배양 후 plate에 포함되어 있는 TTC 지시약에 의하여 산화환원 반응으로 생성된 붉은색 집락 중 주위에 기 포를 형성하고 있는 집락수를 계산하고, 그 평균 집락 수에 희석배수를 곱하여 대장균군의 개수를 산출하였고 24 - 48시간 배양한 후 plate에 포함되어 있는 5-Bromo-4-Chloro-3-Indoxyl- β-D-Glucuronide (BCIG) 지시약에 의하여 생성된 푸른 집락중 기포를 주위에 형성하고 있는 집락수를 계산하고 그 평균 집락 수에 희석배수를 곱하여 대장균의 개수를 산출하였다.
. 황색포도상구균 정량분석
황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)의 정량분석은 Staph express count plates and disk (3 M Co., St. Paul, MN, USA)를 사용하였다. 약용작물을 분쇄한 시료 25 g에 225㎖ BPW를 가한 후 stomach를 이용하여 2분 동안 균질 화 하였다. plate에 균질화한 시료 1㎖를 접종한 후 35℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 plate 위에 적자색 집락이 있을 경우, 황색포도상구균의 Deoxyribonuclease (DNase)생성을 확 인할 수 있는 디스크를 이용하여 다시 35℃에서 3시간 배양 후에 plate에 포함되어 있는 toluidine blue-O 지시약에 의하여 핑크색으로 변환된 집락을 계수하였다. 약용작물 1 g당 세균 집락 수 (CFU)/g = plate위에 형성된 평균집락 수 ×시료의 희 석 배수로 계산하였다. Table 2
The subterranean parts of herbal crop for investigation of microorganism contamination.
. 살모넬라 정량분석
살모넬라 (Salmonella spp.)의 정량분석은 Salmonella express count plates and disk (3M Co., St. Paul, MN, USA)를 사용하였다. 약용작물을 분쇄한 시료 25 g에 225㎖ BPW를 가한 후 stomach를 이용하여 2분 동안 균질화 하였다. plate에 균질화한 시료 1㎖를 접종한 후 35℃에서 24시간 배 양 후 생성된 집락수를 계수하고 평균 집락 수에 희석배수를 곱하여 균수를 산출하였다. 또한 약용작물을 분쇄한 시료를 무 균적으로 균질화한 뒤 25 g을 취해서 BPW 225㎖에 넣은 뒤 24시간 배양하였다. 선택배양은 증균 배양액 10㎕를 취해서 각 선택배지에 도말하고 18 - 24시간 배양하였다. 의심집락은 API test (bioMerieux, Marcy l’Etoile, France), Latex test (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England), PCR, 16s rRNA sequencing을 수행하여 동정하였다.
. 리스테리아 및 대장균 O157의 정성 분석
약용작물에서 리스테리아 (Listeria spp.) 및 대장균 O157 존재여부를 확인하기 위하여 BioSignTM Listeria 및 BioSignTM E. coli O157 Kit (Princeton BioMeditech Co., Princeton, NJ, USA)를 이용하였다. 이들 키트는 1.7 × 104/㎖ 이상 시 검 출되며, 식품공전에 의한 검사법과 비교 시 sensitivity는 평균 91.8%, specificity는 평균 94.1%, accuracy는 평균 92.7%로 보고되어 있다 (Yu et al., 2011).
리스테리아의 경우, 약용작물을 분쇄한 시료 25 g을 LEB (Listeria Enrichment Broth) 225㎖와 혼합한 후 30℃에서 48시간 동안 배양하였고, 배양액 0.1㎖를 10㎖의 Fraser배지 에 첨가하여 35℃에서 24 - 48시간동안 다시 배양하였다. 배양 후 kit에 동봉된 점적기를 이용하여 배양액 2 - 3 방울 (약 100㎕) 점적한 다음 5 - 10분 사이에 결과를 판독하였으며, 양 성인 경우는 2개의 밴드 (대조부위 밴드와 실험부위 밴드)를 볼 수 있으며, 음성인 경우에는 1개의 밴드만 볼 수 있었다 (Yu et al., 2013).
대장균 O157의 경우에도, 약용작물을 분쇄한 시료 25 g과 Modified E. coli broth with 0.02% Novobiocin을 broth 225㎖과 섞어 37℃에서 16 - 24시간 배양하였고, kit에 동봉 된 점적기를 이용하여 배양액 2 방울 (약 80㎕)을 점적한 다 음 5 - 10분 사이에 결과를 판독하였다. 결과의 판정은 리스테 리아와 동일하였다. Table 3
Levels of total aerobic bacteria in aerial parts of herbal crop.
결과 및 고찰
. 약용작물의 총호기성균 분석결과
대부분의 농산물 표면에는 많은 미생물이 서식하고 있으며, 대부분 토양에서 유래되며, 일부 수확 후 유통 등의 관리과정 에서 유래되기도 한다. 특히 약용작물에서는 유효성분 누출과 무게증가를 위하여 세척을 기피할 경우, 미생물에 오염될 가 능성이 크다고 할 수 있다. 따라서 본 연구를 통하여 국내에 서 판매되고 있는 약용작물을 대상으로 총호기성균을 정량적 으로 조사하였다. Table 4
Levels of total aerobic bacteria in subterranean parts of herbal crop.
총호기성균은 생물 오염의 지표로 사용되며, 검체 중에 존 재하는 세균 중 표준 한천배지 내에서 발육할 수 있는 세균으 로 식품의 생산, 가공 및 유통 상의 위생조건 및 잠재적 식 품 부패 등을 판정할 수 있는 지표로 유용하게 사용된다 (Forsythe, 2010; Yu et al., 2011). 일반적으로 채소류에서의 총호기성균 수는 103- 109CFU/g 범위로 알려져 있으며 우리 나라에서 유통 중인 상추, 깻잎 및 오이의 총호기성균의 오염 도는 평균 5.27 - 7.10 log CFU/g, 유통중인 치커리, 미나리, 부추, 배추, 상추, 깻잎, 참나물의 총호기성균은 평균 2.2 × 106- 6.0 × 107CFU/g으로 보고되어 있다 (Yu et al., 2013). 약용작물분야에서 현재까지 보고된 총호기성균 수는 재 배단계의 당귀 뿌리에서 6.71 log CFU/g 수준으로 검출되었으 며, 판매중인 당귀에서 총호기성균 수는 5.6 - 6.0 log CFU/g 수준으로 보고되었다 (Park et al., 2012). 이번 모니터링에서 약용작물의 총호기성균 수는 7.25 ± 0.25에서 1.77 ± 0.26 log CFU/g 범위 (평균 3.64 ± 0.33 log CFU/g)이었으며, 이전 보고 와는 다르게 상대적으로 낮은 세균 오염율을 나타내었다.
. 약용작물의 대장균, 대장균군, 황색포도상구균, 살모넬라 분석결과
식중독은 증식된 미생물을 섭취함으로서 병의 증세를 나타 내는 감염형 식중독과 미생물이 생산한 독소로 인하여 증세를 나타내는 독소형 식중독으로 나뉜다 (Kim et al., 2005). 식중 독에 원인이 되는 대표적인 세균은 대장균, 대장균군, 황색포 도상구균, 살모넬라, 리스테리아 등으로 대장균군은 병원성이 없으나 검출되면 같은 장내세균과에 속하며 병원성이 있는 살 모넬라, 이질균 등과 같은 균의 존재 가능성을 타진할 수 있 으며 대장균의 경우 식품위생상의 분변오염의 지표세균이다 (Kim et al., 2008; Forsythe, 2010; Yu et al., 2011). 특히 황색포도상구균은 건강한 사람이라도 비강을 통해 옮겨질 수 있으므로 손으로 얼굴이나 신체부위를 만진 후 전파될 수 있 으며, 살모넬라는 식중독의 가장 흔한 원인균으로 최근 검출 률이 증가되고 있다. 한국에서도 최근 채소에서 비롯된 식중 독 사례가 증가추세에 있으며, 미국에는 신선편이식품으로 유 통되는 채소에서 살모넬라, 대장균 O157, 리스테리아, 이질균 등이 검출되거나 식중독을 유발한 사례가 보고되어 있다 (Choi et al., 2005). 따라서 최근 국제적으로 식중독을 일으키 는 병원성 미생물에 오염된 농식품에 대한 우려가 증가되고 있으며 생산과정 및 처리과정에서 교차오염이 발생할 가능성 이 있다고 알려져 있다 (Koseki and Isobe, 2005). 미국 FDA에서는 GAP (Good Agricultural Practices)를 통하여 재 배, 수확, 수확 후 처리에 이르기까지 미생물의 교차오염 예방 을 위해 노력하고 있으며, 국내에서는 약용작물 안전성 확보 및 품질관리를 위한 연구로 판매단계 약용작물의 생물적 위해 요소 분석에 관한 연구가 수행되고 있으나 아직 연구는 미비 한 실정이다 (Hong et al., 2012).
약용작물분야에서 현재까지 보고된 대장균군은 재배단계의 당귀 뿌리에서 4.13 log CFU/g, 판매중인 당귀에서 대장균군 은 2.4 - 2.6 log CFU/g 수준으로 보고된 바가 있으며, 살모넬 라, 황색포도상구균, 리스테리아와 같은 유해세균은 검출되지 않았다 (Park et al., 2012). 이번 조사에서 의심되는 집락에 대해서는 selective enrichment broth와 selective agar에 배양 후 PCR, 16s rRNA sequencing으로 재확인하였으나 대장균, 대장균군, 황색포도상구균, 살모넬라는 발견되지 않았다. Table 5
Result for the detection of S. aureus, Salmonella spp., E. coli and Coliforms form aerial parts of herbal crop.
. 리스테리아 및 대장균 O157 분석결과
리스테리아는 토양이나 물에서 흔히 발견되는 식중독 원인 균이며, 대장균 O157은 10개 정도의 균으로도 출혈성 장염을 일으키며 냉장 저장된 농산물 및 부적절한 가공에 의해 오염 될 수 있고 신선과채류 및 주스 제품으로도 쉽게 전파될 수 있다 (Youm et al., 2004). 리스테리아 및 대장균 O157 Kit 를 이용한 분석에서도 대장균, 대장균군, 황색포도상구균, 살 모넬라 분석결과와 동일하게 리스테리아 및 대장균 O157은 확인되지 않았다. 그 이유로 총호기성균과 동일하게 일반적으 로 한약규격품으로 포장되어 유통되고 있는 약용작물을 대상 으로 조사하였기에 접촉에 의한 오염이 거의 없을 뿐 아니라 건조된 상태이므로 세균이 증식하기 어려운 조건이었을 것으 로 판단된다.
미국의 환자 수 기준 식중독 발생 현황에서 농산물에 의한 식중독 사례가 가장 많은 것으로 보고되어 있다 (Yu et al., 2013). 우리나라에서도 농산물에 의한 식중독이 1988년 119건 에서 2010년 271건으로 증가되었다고 보고되었으며, 이는 농산 물 재료 자체에 문제가 있는 경우도 있지만, 농산물의 유통, 손 질 및 조리시 취급자 혹은 주변의 다른 재료와의 접촉으로 교 차오염이 원인인 것으로 사료된다. Table 6
Result for the detection of S. aureus, Salmonella spp., E. coli and Coliforms form subterranean parts of herbal crop.
따라서 본 연구는 한국에서 유통되는 약용작물의 총호기성 세균 및 유해세균 오염실태를 조사하여 약용작물의 미생물학 적 안전성을 평가하는 기초자료로 활용하고자 수행되었다. 그 결과 총호기성균수는 일반농산물 보다 낮은 수준을 보였으며 병원성 미생물은 전혀 검출되지 않았기 때문에 약용작물에 의 한 식중독 위험은 현저히 낮을 것이라고 생각한다. 그러나 미 생물로 인한 오염은 그 경로가 다양하고, 건조된 상태에서 유 통되는 한약규격품에 한정된 것이므로 비건조상태인 신선편이 식품 등으로 유통될 경우에는 추가연구를 통하여 생산단계에 서부터 철저한 안전성을 확보해야만 한다. 수확 후 절단 등의 처리과정이 다른 농산물에 비하여 복잡한 약용작물에 대한 생 물학적 위해요소 모니터링은 품질관리를 위하여 반드시 수행 되어야할 필수요소라 생각한다.
생산단계에서는 멀칭 등 토양피복을 통하여 교차오염을 예 방하고, 적절한 퇴비를 사용하여 토양이 오염되지 않도록 관 리하고, 수확 후에는 철저한 세척으로 토양미생물로 인한 오 염이 발생하지 않도록 관리하는 것이 우선시 되어야 할 것이 며, 장염 및 패혈증 원인균인 비브리오균에 대한 모니터링, 토 양피복 유무에 따른 세균 수 측정 등에 대한 추가연구가 필요 할 것으로 판단된다 (Kim et al., 2013). 따라서 본 연구를 통 하여 약용작물 품질관리에 대한 기초자료를 확보하고, 약용작 물 품질에 대한 소비자신뢰 회복 및 소비증가를 위하여 지속적 인 유해세균 모니터링이 반드시 수행되어야할 것으로 사료된다.
감사의 글
본 연구는 농촌진흥청 연구사업(과제번호: PJ009622)의 지 원에 의해 이루어진 결과로 이에 감사드립니다.
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