게르마늄 처리에 따른 땃두릅나무의 생육 증진 효과 및 유기게르마늄 생산

1. 식물재료

실험에 사용된 재료는 강원대학교 실험농장의 땃두릅나무 (Oplopanax elatus)를 기내로 유도하여 유식물체 (plantlet)으로 분화시키고 이를 6개월 이상 계대배양된 기내배양체를 사용하 였다.

2. 게르마늄 처리

1/2 MS (Murashige and Skoog, Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands) 배지에 3% sucrose를 넣고 pH 5.8이 되도록 조절하고, 1% plant agar (Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands)를 이용하여 고체 배지를 제조하였다. 게르마늄 종류 및 처리 농도가 유식물체의 생육 및 흡수능에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 유기게르마늄 [O{Ge (= O)CH₂CH₂ CO₂H}₂, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA], 무기게르마늄 (GeO₂, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 각각 0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 및 250㎎/ℓ가 첨가되도록 제조하고, 기내배양 한 땃두릅나무 유식물체의 초 장이 3㎝ 이상으로 완전히 분화된 것을 치상하여 2달 동안 25℃의 16시간 광조건, 8시간 암조건하에서 배양하였다.

3. 광색소 함량

게르마늄 처리에 따른 광합성 효율을 알아보기 위하여, 광 색소인 클로로필 a, b 및 카로티노이드 함량을 Lichtenthaler 와 Buschmann (2001)의 방법으로 측정하였다. 각 처리구의 유식물체의 잎을 0.1 g 채취하여 아세톤 10㎖에 냉암소 상태 로 2일 동안 추출하고, 여과한 후 _663.2, _646.8 및 470.0㎚ 에서 흡광도를 측정하고, 아래의 산출식을 이용하여 함량을 측 정하였다.

• Chlorofila a (㎍/㎖) = [12.25A_663.2-2.79A_646.8]
• Chlorofila b (㎍/㎖) = [21.50A_646.8-5.10A_663.2]
• Carotenoid (㎍/㎖) = [(1000A₄₇₀-1.82a-85.02b)/198]

4. 게르마늄 분석

땃두릅나무 부위별 게르마늄 전이 여부 및 유기게르마늄 생 산능을 확인하기 위하여, 땃두릅나무 유식물체의 잎, 줄기 및 뿌리 부위별로 분리하여 5일 이상 음건하고, 60 mesh 이하로 분말 시료를 만들고, 분말 시료 0.5 g에 35% 질산 10㎖을 넣고 6시간 이상 실온에 방치하고, 여기에 과산화수소 (Daejung chemical and metal Co., Ltd., Siheung, Korea) 1㎖을 넣어 microwave를 이용하여 예비 분해하는 습식 분해 법을 수행하였다. 0.2㎛ 필터를 이용하여 여과한 습식분해 산 물에 다시 3차 증류수를 이용하여 50㎖이 되도록 정용하여 ICP-OES (Inductively coupled plasma optical emission spectrometer, OPTIMA 7300DV, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 게르마늄 함량을 분석하였다.

5. 항산화 활성

항산화 활성 및 항산화 물질 분석은 게르마늄 무처리구, GeO₂ 10 및 50㎎/ℓ 처리구에서 배양시킨 땃두릅나무를 부 위별로 분리하여 음건한 것의 80% EtOH (Daejung chemical and metal Co., Ltd., Siheung, Korea)를 20배를 이용하여 2 일 동안 추출한 것을 감압농축한 후, ppm별로 희석한 것을 사용하였다.

유기게르마늄 생산에 따른 항산화 활성 증진 효과는 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 및 2,2’-azino-bis-3-ethylbenzo thiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) radical 소거 활성을 측정하여 확인하였다. DPPH radical 소거 활성은 Blois (1958)에 의해 실 시된 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 100㎕에 0.2 mM DPPH 100㎕ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 혼 합하여 30분 동안 상온에서 암반응시킨 후, UV-VIS spectrophotometer (Multiskan FC Microplate Photometer, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하 여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 DPPH radical 소거 활성은 대조군에 대한 DPPH radical 소거능을 백 분율로 나타내었고, 소거 활성 양성 대조군으로는 ascorbic acid (Amresco LLC, Solon, OH, USA)를 사용하였다.

ABTS radical 소거 활성을 이용한 항산화 활성은 Re 등 (1999)에 의해 실시된 ABTS+ radical cation assay 방법을 변 형하여 측정하였다. 7 mM ABTS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 2.45 mM potassium persulfate (Daejung chemical and metal Co., Ltd., Siheung, Korea)를 1 : 1 비율 로 혼합하고 24시간 동안 실온에서 암소 조건에 두어 radical 을 형성시키고, 732㎚에서 흡광도 값이 0.68 - 0.72 값이 되도 록 phosphate saline (PBS, pH 7.4)을 이용하여 희석하였다. ABTS 반응액 990㎕에 시료 10㎕를 가하여 10분간 반응시 킨 후 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 ABTS radical 소거 활성은 대조군에 대한 ABTS radical 소거능을 백분율로 나타내었고, 소거 활성 양성 대조군으로는 ascorbic acid를 사 용하였다.

6. 항산화 물질 분석

총 페놀 함량은 Sato 등 (1996)에 의해 실시된 Folin- Ciocalteu 방법을 변형하여 측정하였다. 1,000 ppm 농도로 조제 한 시료 100㎕에 Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 50㎕를 가하여 5분간 상온에서 안정화 하였다. 20% sodium carbonate (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 200㎕를 가하고 30℃에 15분간 반응시킨 후, 증류수 1㎖를 넣어 혼합한 후 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 725㎚에서 흡광도를 측정하였다.

총 플라보노이드 함량은 Moreno 등 (2000)의 방법을 변형 하여 측정하였다. 시료 100㎕ (10 ㎎/㎖)에 80% EtOH 900㎕을 혼합하여 희석한 시료 500㎕에 10% aluminium nitrate (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 100㎕, 1M potassium acetate (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 100㎕를 혼합하고 40분간 상온에서 반응시킨 후 415㎚에서 흡광도를 측정하였다.

7. 통계처리

모든 실험은 3반복으로 수행하였고, 통계처리는 Statistical analysis system (SAS 9.2, USA)을 사용하였고, 유의성 검정 은 분산분석 (ANOVA)을 이용하여 통계적 유의성을 5% 수준 에서 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)으로 분석하였 다.

1. 게르마늄 종류 및 농도별 생육 증진 효과

잎, 줄기 및 뿌리의 각 부위로 완전히 분화한 땃두릅나무 (Oplopanax elatus)유식물체에 게르마늄 처리가 생육 및 광합 성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 2달 동안 배양한 땃두 릅나무 잎 생체 0.1 g을 이용하여 광색소 분석한 결과이다. 광 에너지를 흡수하고 광합성 장치로 옮기는 엽록소 a, b의 각각 의 함량을 살펴보면 유사한 경향을 보였는데 게르마늄 첨가 농 도에 따라 증가하여 무기게르마늄은 10㎎/ℓ에서 유기게르마 늄은 25㎎/ℓ의 농도에서 가장 높았으며 이보다 많은 게르마 늄을 첨가하였을 때는 게르마늄 무처리구의 음성 대조구와 유 사하거나 첨가 농도가 증가함에 따라 감소하였다 (Table 1).

Table 1

Effect of germanium concentration on photosynthetic pigment of plantlet of O. elatus after 8 weeks.

엽록소 a는 광합성의 주된 광수용체로 적색과 청색 및 보라 색 영역을 흡수하여 일반적인 식물의 엽록소 a와 b 함량의 비 는 3 : 1로 알려져 있는데 이는 식물의 유전학적 특성이나 환 경 조건에 따라 달라지는 것으로 알려져 있다 (Park et al., 2013). 땃두릅나무 유식물체의 게르마늄 처리에 따른 엽록소 a와 b의 함량의 비는 2.6 : 1 이상의 수준을 나타내었으며, 무 기게르마늄 처리구의 경우 고농도에서 급격하게 감소하였다. 무기게르마늄 25㎎/ℓ 이상 처리구와 유기게르마늄 50㎎/ℓ 이상에서 육안으로도 잎의 황화 현상되었으며 게르마늄 농도 가 높아짐에 따라 강하게 나타내는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 1).

Fig. 1

Effect of different germanium concentration on the growth of O. elatus plantlet after 8 weeks.(A); control, (B); IG1) 2.5㎎/ℓ , (C); IG 5㎎/ℓ , (D); IG 10㎎/ℓ , (E); IG 25㎎/ℓ , (F); IG 50㎎/ℓ , (G); IG 100㎎/ℓ , (H); IG 250㎎/ℓ , (I); OG2) 2.5㎎/ℓ , (J); OG 5㎎/ℓ , (K); OG 10㎎/ℓ , (L); OG 25㎎/ℓ , (M); OG 50㎎/ℓ , (N); OG 100㎎/ℓ , (O); OG 250㎎/ℓ . 1)IG; Inorganic germanium, 2)OG; Organic germanium.

카로티노이드는 광합성 시스템에 에너지를 기여하고 광에너 지 초과시 광합성 체계의 손상을 회피하는 역할을 하는 것으 로 알려져 있다. 엽록소는 식물이 스트레스 받거나 노화하는 과정에서 카로티노이드보다 급감하는 경향을 보이는데, 땃두 릅나무 유식물체의 게르마늄 처리에서의 카로티노이드 함량을 살펴보면 엽록소 a와 b 함량과 동일한 경향을 보여 적정 농도 에서는 무처리구보다 많이 합성되나 고농도에서는 급감하였다 (Table 1).

게르마늄 처리가 땃두릅나무 유식물체의 생육에 미치는 영 향을 알아보기 위하여, 부위별 생체중 및 건조중을 측정한 결 과는 Table 2와 같다. 게르마늄의 생육 증진 효과는 광합성 색소의 함량과 동일한 경향을 보여 무기게르마늄은 10㎎/ℓ 에서 유기게르마늄은 25㎎/ℓ의 농도에서 생체중과 건조중 모두에서 가장 많이 수확되었고, 게르마늄 처리 농도가 높아 짐에 따라 수확량은 급감하였다. 특히, 유기게르마늄 25㎎/ℓ 처리구는 무처리구인 음성 대조구보다 잎 및 뿌리의 생체중과 건조중 모두에서 1.47배 이상 증가하였다. 적정 게르마늄 처 리는 땃두릅나무 유식물체의 생육에 있어 지상부 및 지하부 생육의 증진을 유도한 것을 확인할 수 있었다 (Table 2). 무기 게르마늄은 식물조직이나 세포와의 결합력이 약화로 인해 벼 에 게르마늄 과잉 처리시 일부는 유기화되지 못하고 무기게르 마늄 독성으로 식물에서 황백화 현상을 나타낸다 (Park et al., 2012). 따라서 본 연구결과인 저농도 유기게르마늄 처리는 땃 두릅나무 유식물체의 생육 및 광합성 효율을 증진시키는 효과 를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

Table 2

Effect of germanium on the growth of plantlet of O. elatus after 8 weeks.

무기게르마늄은 갓, 배추 및 청경채를 이용한 채소 종자 발 아에 있어, 100㎎/ℓ의 고농도를 제외하고는 무처리구의 발 아 수준이 유지되고, 육묘 처리시 10 - 100㎎/ℓ 농도에서 뿌 리의 생장에 심각한 저해를 보였으나, 지상부의 생육에는 10 - 25㎎/ℓ 저농도에서는 촉진하는 효과를 보이기도 하였다 (Han et al., 2007). 또한, 신고배의 무기게르마늄 엽면 살포에 따라 엽면적 및 비중이 증가하여 지상부의 생육 증진 효과를 보여 비료로서의 활용도를 확인한 바 있다 (Choi et al., 2011). 게르마늄 처리는 식물의 배양 및 재배에 있어 생육 증 진 효과를 나타내며, 게르마늄 처리는 일반적으로 식물의 지 상부 생육을 증진시킨다는 보고가 있었으나, 본 연구를 통하 여 지상부와 지하부의 생육을 모두 증진시키는 효과를 확인하 였다. 게르마늄의 적정 처리 농도는 식물종 및 상태에 따라 다르므로, 적합한 농도 및 처리시기에 대한 연구가 필요하겠다.

2. 땃두릅나무 유식물체 부위별 게르마늄 함량

게르마늄 종류, 처리농도 및 땃두릅나무 유식물체 부위별 게 르마늄 함량 분석을 통하여, 뿌리, 줄기 및 잎으로의 게르마늄 전이 및 축적 양상을 분석하였다. 체내 게르마늄의 축적 및 전이는 유기게르마늄 보다 무기게르마늄을 처리하였을 때 효 과적으로 이루어졌다. ICP-OES 분석을 통하여 체내 게르마늄 축적량을 확인하고 이 값에 유식물체 건조중을 곱하여 식물체 별 유기게르마늄 생산량을 확인한 결과, 무기게르마늄 50㎎/ℓ 처리구의 뿌리에서 40.87㎍/plantlets로 가장 많이 생 산하였다 (Table 3).

Table 3

Effect of germanium concentration on organic germanium accumulation and production in the plantlet of O. elatus after 8 weeks.

게르마늄 전이 양상은 2.5㎎/ℓ의 저농도에서는 유기게르 마늄 처리구는 모든 부위에서 축적되지 않았고, 무기게르마늄 처리구의 뿌리 부위에서만 축적되기 시작하여 5㎎/ℓ의 농도 에서는 뿌리 및 줄기까지 전이되었고, 10㎎/ℓ 이상 농도를 처리해야, 잎으로까지 게르마늄이 전이되어 체내 유기게르마 늄을 생성하였다. 유기게르마늄 체내 축적량은 뿌리에서 가장 효과적이었고, 게르마늄 처리 농도가 높아짐에 따라 증가하여 100㎎/ℓ 농도에서 가장 많이 축적되었고, 250㎎/ℓ에서는 급감하였다. 뿌리에서 잎으로의 게르마늄 전이 및 축적은 유 기게르마늄 처리가 효과적이었고, 특히 고농도 처리구에서 게 르마늄 축적 및 생산이 이루어져 뿌리의 게르마늄 생산량과 유사한 수준을 보였다 (Table 3). 이와 대조적으로 게르마늄 엽 면시비시 벼의 줄기와 잎에서 게르마늄 흡수량은 높았으나, 상 대적으로 뿌리는 매우 적은 흡수량을 보인 결과가 있다 (Park et al., 2012). 이는 게르마늄을 처음 흡수하는 식물 부위에서 다른 부위와는 달리 직접적인 영향을 받으므로, 이에 따라 게 르마늄 함량도 가장 높은 것으로 사료된다.

인삼 부정근의 무기게르마늄 처리는 10 ppm의 저농도에서 생장을 증진시켰고, 부정근 내 게르마늄 함량이 가장 높은 것 은 100 ppm 처리구였으나, 이는 무처리구의 1/2 정도의 생육을 보였다 (Chung and Oh, 2005). 배양 식물 종류 및 특성에 따 라 게르마늄 처리에 따른 생육 및 축적 양상이 다르므로, 생육 과 유기게르마늄 생산에 좋은 조건을 확립할 필요가 있다.

새포아풀 (Poa annua L.)을 이용한 게르마늄과 규소의 전 이 양상 연구에서 게르마늄과 규소 모두 뿌리의 세포벽에 축 적되었고, 잎으로의 전이는 규소는 활발히 이루어져 뿌리 세 포벽만큼 축적된 반면, 게르마늄의 전이는 드물게 전이된 것 으로 보고된 바 있다 (Sparks et al., 2011). 본 연구를 통해 서, 땃두릅나무 유식물체 뿌리에서 잎으로의 게르마늄 전이는 비교적 고농도에서 이루어지고, 잎에서의 게르마늄 축적량 또 한 뿌리에 1/2 이하의 수준으로 나타났다. 이로써, 게르마늄은 식물체내에 비교적 느리게 전이되는 원소임을 다시 한 번 확 인할 수 있었다 (Table 3).

3. 항산화 활성 및 물질 분석

항산화 활성 및 식물의 강력한 항산화를 가진 것으로 알려 진 물질인 총 페놀 및 플라보노이드 함량 검정은 게르마늄 무 처리구와 생육 증진효과를 가졌던 무기게르마늄 10㎎/ℓ 처 리구, 체내 유기게르마늄 생산에 효과적이었던 무기게르마늄 50㎎/ℓ 처리구를 분석에 사용하여 게르마늄의 게르마늄 증 진 효과를 확인하였다.

항산화 활성은 DPPH 및 ABTS free radical을 50% 소거 하는 RC50 ㎍/㎖값으로 나타내었다. 항산화 활성은 DPPH와 ABTS 소거 활성에서 비슷한 양상을 보였는데, 땃두릅나무 유 식물체의 잎 부위가 높은 항산화 활성을 가지고 그 다음으로 뿌리, 줄기 순으로 나타났다. 항산화 활성은 게르마늄 처리에 따라 증진하였는데 free radical을 50% 소거에 사용하는 시료 양은 무처리구의 1/2 수준의 함량으로도 가능한 것을 확인할 수 있었다 (Table 4). 게르마늄은 끈적끈적한 산성상태의 혈액 을 알카리성으로 전환시켜 혈액정화를 하며, 몸속에 있는 산 화물질을 제거하여 노화방지에 효과가 있다 (Kim, 2004). 이 는 게르마늄 처리 시 증가된 땃두릅나무 유식물체의 유기게르 마늄이 DPPH와 ABTS assay를 통하여 항산화 작용을 일으킨 것으로 사료된다.

Table 4

Effect of germanium concentration on antioxidant activities of O. elatus after 8 weeks.

페놀은 하나 이상의 수산기를 가지는 구조로 이는 강력한 항 산화의 기작이될 뿐만 아니라 항균, 항알러지, 항암, 충치예방, 심장질환 및 당뇨병 예방에 효과가 있는 것으로 보고되고 있 다 (Azuma et al., 1999). 이와 동시에 페놀 계열의 플라보노 이드 (flavonoid)는 방향족 고리 2개와 탄소 3개로 이루어진 일련의 기본 링 구조 (C6-C3-C6)를 갖는 화합물로, 항산화제, 자유라디칼 소거제, 양이온의 킬레이트 등으로 작용하는 천연 물질로 관심이 집중되고 있는 실정이다 (Knekt et al., 2002;Cha and Cho, 1999;Zhoh and Kim, 2002).

본 연구에서의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량은 각각 gallic acid와 quercetin의 흡광도를 측정한 후 표준곡선을 작성 하여 Table 5와 같이 결과를 산출하였다. 총 페놀 및 플라보 노이드 함량은 항산화 활성이 우수하였던 잎, 뿌리 및 줄기 순으로 많이 함유하고 있었다. 특히, 잎에서 총 페놀 함량은 게르마늄 무처리구에서 132.8㎍• GAE/㎖를 나타낸 반면, 무 기게르마늄 50㎎/ℓ 처리구에서는 309.5㎍• GAE/㎖로 그 함량이 2.3배 이상 급증하였으며, 줄기 및 뿌리에서도 게르마 늄 처리에 따라 총 페놀 함량이 증가하는 양상을 보였다. 총 플라보노이드 함량의 경우 잎과 줄기에서 급증하였고, 뿌리에 서는 다소 증가하였다 (Table 5).

Table 5

Effect of germanium concentration antioxidant activities of O. elatus after 8 weeks.

항산화 활성과 항산화 물질 분석의 결과로, 잎에서의 무기 게르마늄 처리구의 항산화 활성 증가는 총 페놀 및 총 플라보 노이드의 급증에 의한 것이고, 뿌리에서의 항산화 활성 급증 은 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량 및 유기게르마늄 축적에 의한 것으로 사료된다.

이와 같이 땃두릅나무에 저농도의 게르마늄 처리를 통하여 지상 및 지하부 생육, 항산화 활성 증진 효과 및 유효한 유기 게르마늄 생산 방법을 구축함으로써 희귀 약용작물인 땃두릅 나무의 기능성 증진 및 소재 확보에 기여하였고, 이를 이용한 고부가 가치 제품으로 다양하게 이용될 수 있을 것으로 사료 된다.