참소리쟁이 뿌리 추출물 및 분획의 항균 활성과 항생제 증강 활성
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Abstract
The objective of this study were to determine the antibacterial activity and antibiotic activity-enhancing effect of 70% ethanol extract of the root of Rumex japonicus Houtt. and its fractions when used in combination with gentamicin against aerobic skin flora.
The antibacterial activity and antibiotic (gentamicin) activity enhancing effect against aerobic skin flora were determined using the disc diffusion assay. Chloroform fraction (CF) and ethyl acetate fraction (EF) showed higher activities against Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis than those shown by other fractions. Regarding the antibiotic (gentamicin) activity-enhancing effect against aerobic skin flora, the n-hexane fraction (HF) and CF showed strong activity. The combination of HF and CF with gentamicin was evaluated using the broth dilution assay to determine the inhibitory effect on the growth of aerobic skin flora. The combination of CF with gentamicin exhibited the highest inhibitory effect on the growth of S. aureus and S. epdermidis. MTT assay performed to determine the viability of L929 cells revealed that EF treatment resulted in viability of 33.96 - 116.76% at the tested concentration. The combination of 70% ethanol extract and its other fractions with gentamicin showed low cell toxicity.
Appropriate use of antimicrobial agents is important prior to the development of new antibiotics. The 70% ethanol extract of the root of R. japonicus Houtt. and its fractions showed significant synergism with gentamicin when used in combination against S. aureus and S. epdermidis. Thus, R. japonicus Houtt. could be used as a functional materials in antimicrobial-related fields.
Keywords:
Rumex japonicus Houtt., Antibacterial Activity, Cytotoxicity, Antibiotic Activity Enhancing Effect서 언
포도상 구균 중 Staphylococus aureus는 직경이 0.5 - 10㎛ 정도의 황색 구균으로 불규칙적인 포도송이 형태를 이루며 겨 드랑이, 피부, 비강, 회음부 등에서 존재하는 상재균이며, 상처 난 피부에 화농을 일으키며, 피부 표면의 종기, 부스럼, 여드 름 및 아토피 등 여러 피부질환의 원인균이다 (Winston and Shalita, 1991; Raimer, 2000). Staphylococus epidermidis는 피부의 적당한 pH를 유지하여 밖으로부터 침투하는 세균을 방 어하기도 하지만 원발성 피부질환 및 여드름 증상을 악화시키 는 속발성 원인균으로 점액 (slime)을 생성하여 항생제로부터 균체를 보호하고, 혈구 응집 능력과 식균작용을 억제하며 숙 주의 면역계를 손상시키기도 한다 (Peter and Smith, 1977; Feibleman and Tasmusaen, 1980; Sohn et al., 2006).
항생제는 미생물에 의해 만들어진 항균효과를 가지는 물질 로서, 세포벽 합성 저해, 단백질 합성저해, 핵산 합성저해, 대 사경로 저해로 분류된다. 여러 항생제 중 gentamicin은 30S ribosomal RNA에 결합하여 단백질 합성을 방해하는 aminoglycosid계 항생제로 그람 음성균 감염 치료시 전 세계에 서 널리 이용되는 항생제이다 (Yoshizawa et al., 1998; Barton- Davis et al., 1999). Gentamicin과 같은 aminoglycosid계 항 생제는 항균작용에 있어서 매우 효과적이지만 이독성과 신장 독성 등의 부작용을 유발하며, gentamicin에 의해 유도된 이독 성은 약물 처리 시간 또는 용량에 비례하여 증가한다고 알려 져 있다 (Tablan et al., 1984; Forge and Schacht, 2000).
또한 항생제 사용의 증가는 다양한 다중약제내성의 발견으 로 이어졌으며, 항생제 내성을 나타내는 유전자를 다른 균주 에 전달하여 항생제에 대하여 빠른 저항성을 갖는 진화를 한 다 (Neu, 1992; Goossens et al., 2005). 따라서 항생제 내성 균주는 사람과 동물 등 다양한 곳에서 급증하였다. 내성 균주 의 발현 빈도를 감소시킬 수 있으며, 독성 및 부작용이 있는 항생제의 독성을 약화시킬 수 있는 항생제 병용 투여는 세균 의 복합 감염의 경우 보다 넓은 항균 범위를 갖는 등의 기대 효과가 크기 때문에 항생제의 항균 효과를 증대시키면서 인체 에 무해하며 부작용이 없는 천연물 유래의 항균물질에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다 (Cha et al., 2007; Lee et al., 2010, 2014).
본 연구에서는 마디풀과 (Polygonaceae)에 속하는 다년초 식물인 참소리쟁이 (Rumex japonicus Houtt.) 뿌리의 추출물 및 분획과 gentamicin의 항생제 증강 효과를 그람 음성 세균 인 S. aureus와 S. epidermidis에서 확인하여 보고하는 바이다.
재료 및 방법
1. 재료
본 연구에 이용한 참소리쟁이 (Rumex japonicus Houtt.)는 2016년 삼홍건재약업사에서 구입하여 냉장 보관 (4℃ 이하)하 며 실험에 사용하였으며, 약재 (DSUBIC-16-0002)는 동신대학 교 BIO센터에 냉장 보관되어 있다.
2. 추출 및 분획
마쇄한 참소리쟁이 뿌리를 70% ethanol (EtOH)을 이용하여 2 시간씩 3 회에 걸쳐 80℃에서 환류냉각추출을 실시한 후 추 출액은 여과 후 농축기 (BUCHI, Flawil, Switzerland) 및 동 결건조기 (Sam Won Industry, Seoul, Korea)를 이용하여 추 출물을 획득하였으며, 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사 용하였다. 분말화된 추출물 중 일부를 증류수에 분산시킨 후 nhexane, chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (BuOH)을 이용하여 순차적으로 용매분획을 수행하였다. 용매분 획으로 획득한 시료는 여과 후 농축 및 동결건조를 이용하여 분말화 하였으며 냉장보관 (4℃ 이하)하면서 실험에 사용하였 다.
3. 사용 균주와 세포주 및 시약
미생물 균주 Staphylococus epidermidis (KCTC1917)와 Staphylococus aureus (KCTC3881), 동물세포주 L929 cell은 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양 받아 사용 하였다. 미생물 균주 2 종은 nutrient agar (NA) 및 broth (NB) 배지를 사용하였으며, 세포주는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 혼합한 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, WelGENE Inc., Gyeongsan, Korea)을 이용하여 실 험에 사용하였다. 그 외 실험에 사용된 시약들은 Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 실험에 사용하 였다.
4. Disc diffusion assay에 의한 항균활성 측정
참소리쟁이 뿌리 추출물 및 분획과 gentamicin의 및 병용 효과를 확인하기 위하여 disc diffusion assay를 이용하여 각 균주를 대상으로 항균효과를 측정하였다. 각 균주를 계대 배 양한 배양액 100㎕를 항균시험용 평판배지에 분주한 후 멸 균 면봉을 이용하여 도말하여 준비하였고, 직경 6㎜의 paper disc에 여러 농도의 시료를 천천히 흡수시킨 뒤 용매를 휘발 시키는 건조과정을 거쳐 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 37℃ 에서 배양하였다. 24 시간 배양 후 disc 주면에 생성된 생육 저해환 (clear zone, ㎜)의 지름을 측정하여 항균활성 및 병용 효과를 확인하였다.
5. Broth dilution assay에 의한 생육 저해 활성 측정
Disc diffusion assay를 통해 우수한 항생제 병용 효과를 나 타낸 시료가 S. epidermidis와 S. aureus의 생장에 어떠한 영 향을 미치는지 조사하기 위해 broth dilution assay를 이용하여 항균활성을 측정하였다 (Mulyaningsih et al., 2010).
2 배 희석법을 이용하여 여러 농도로 제조한 gentamicin과 0.1㎎/㎖의 농도가 되도록 n-hexane 분획 (HF)과 CHCl3 분 획 (CF)을 각각 30㎕씩 처리한 후 균액을 30㎕씩 첨가하여 37℃에서 24 시간 배양하였다. 배양액을 200㎕를 취하여 96 well plate에 옮겨 600㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대 신 PBS를 사용한 음성 대조군의 흡광도를 기준으로 생육 저 해 활성을 산출하였다.
6. 세포 생존율 측정
참소리쟁이 뿌리 추출물 및 분획과 gentamicin의 세포 생존 율은 세포독성 실험에 많이 이용되는 생쥐의 섬유모세포의 일 종인 L929 세포주를 이용하여 MTT assay로 확인하였다 (Shin et al., 2003).
1 × 104 cells/well이 되도록 96 well plate에 L929 세포를 분주한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 24 시간 동안 안정화 및 부착을 시킨 후, 농도별로 희석한 시료액을 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. PBS에 5㎎/㎖의 농도로 제조한 MTT 용액 을 10㎕씩 각 well에 첨가하고, MTT가 환원되도록 4 시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 반응시켰다. 배지를 제거한 후, 100㎕의 DMSO를 첨가하여 각 well에 생성된 formazan 결 정을 용해시킨 후 흡광도를 540㎚에서를 측정하였으며, 시료 대신 PBS를 첨가한 well의 평균 흡광도를 이용하여 세포 생 존율 산출하였다.
7. 통계분석
모든 측정값은 3 회 이상 반복하여 실험한 결과의 평균값과 표준편차 (means ± SD)로 표기하였으며, 각 실험군 간의 통계 학적 분석은 windows용 SPSS (Statistical Pakage for Social Science, version 12.0, SPSS Inc., Chicago. IL, USA)를 이 용하여 수행하였다. 각 군 간의 측정치 비교는 One-way analysis of variance (ANOVA)를 시행한 후 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의성은 신뢰구간 p < 0.05 에서 의미를 부여하였다.
결과 및 고찰
1. 추출 및 분획수율
참소리쟁이 (Rumex japonicus HOUTT) 뿌리 추출물과 용 매분획의 수율은 Table 1과 같다. 참소리쟁이 뿌리를 70% EtOH로 80℃에서 환류추출을 이용하여 얻은 추출물의 수율은 34.64%이었다.
Yields of 70% ethanol extract and its fractions from the root of Rumex japonicus.
이러한 결과는 Rhim 등 (2012)의 소리쟁이의 95% EtOH 추출 수율 14.5%에 비해 높은 수율이었다. 또한 뿌리를 사용 하는 약재인 적작약의 EtOH 추출 수율이 3.25%, 해당화 뿌 리의 EtOH 추출 수율이 4.97%로 다른 식물의 뿌리 EtOH 추출물보다 높은 수율을 보여주었다 (Lee et al., 2003; Bak et al., 2011). 분획의 경우 58.13%로 aqueous 분획 (AF)이 가장 높은 분획수율을 나타내었으며, HF, CF, EtOAc 분획 (EF), BuOH 분획 (BF)은 각각 3.56%, 2.45%, 10.54%, 25.33%의 분획수율을 보여주었다.
2. 추출물 및 분획의 항균활성
Disc diffusion assay를 이용하여 참소리쟁이 뿌리 추출물과 분획의 항균활성을 Table 2에 나타내었다. S. aureus에 대한 항균활성 결과를 살펴보면, 3㎎/disc로 sample을 처리하였을 때 추출물은 8.83㎜의 생육저해환을 형성하였으며, CF과 EF 이 각각 11.20㎜, 11.40㎜의 생육저해환을 형성함으로써 다 른 분획보다 높은 활성을 보여주었다. S. epidermidis의 경우 S. aureus의 결과와 마찬가지로 CF과 EF을 3㎎/disc로 처리 하였을 때 각각 10.00㎜, 9.63㎜의 생육저해환을 형성함으로 써 추출물과 다른 분획보다 높은 활성을 나타내었다. S. aureus와 S. epidermidis 두 균주에서 실험을 실시한 모든 sample은 농도 의존적인 활성을 보여주었다.
Antibacterial activities of 70% ethanol extract and its fractions from the root of Rumex japonicus.
소리쟁이 80% methanol (MeOH) 추출물 및 그 분획의 항 균활성의 경우 BF과 EF에서 가장 높은 활성을 보여주었다 (Jeong et al., 2006). 이러한 결과는 싸리나무 줄기 추출물의 추출 용매에 따른 활성 차이와 오적산의 추출 용매에 따른 항 염증 활성 차이 등의 결과로 미루어보아 추출 용매의 차이에 서 기인된 결과인 것으로 판단되어 진다 (Lee et al., 2011; Yoo et al., 2012). S. aureus에 대한 지유 추출물 및 분획의 항균활성의 경우 시료를 3㎎/disc로 처리하였을 때 8.85 - 13.67㎜의 생육저해환을 형성하였다는 보고 (Seo et al., 2016)와 S. aureus와 S. epidermidis에 대한 산벚나무 가지 추 출물 및 분획의 향균활성을 측정한 결과 1㎎/disc로 처리하였 을 때 S. aureus에서는 8.37 - 10.08㎜의 생육저해환을 S. epidermidis에서는 8.25 - 9.78㎜의 생육저해환을 보여주었다 는 보고 (Yang et al., 2016)와 비교하여 볼 때 항균물질로의 활용가능성이 충분하다고 판단되었다.
3. Disc diffusion assay에 의한 추출물 및 분획의 항생제 증강 효과
참소리쟁이 뿌리 추출물 및 분획과 상용 항생제중 하나인 gentamicin을 병행하여 처리하였을 때 항균효과의 변화를 비 교한 결과, S. aureus의 경우 gentamicin을 0.5㎍/disc의 농도 로 단독 처리하였을 때 19.13㎜의 생육저해환을 형성하였으 나, gentamicin 0.5㎍/disc와 HF와 CF을 1㎎/disc의 농도로 병행 처리하였을 때 각각 30.37㎜, 35.70㎜의 생육저해환을 형성하여 gentamicin을 단독으로 처리하였을 때보다 약 1.5 - 2 배 정도 더 높은 항균활성을 나타내었다 (Table 3). 하지만 S. aureus에 높은 항균활성을 보여주었던 EF의 경우 gentamicin과의 상승작용은 나타나지 않았다. S. epidermidis에 gentamicin을 1㎍/disc의 농도로 처리하였을 때 16.43㎜의 생 육저해환을 형성하였으며, S. aureus의 결과와 마찬가지로 gentamicin 0.5㎍/disc와 HF와 CF을 1㎎/disc로 병행하였을 때 25.00㎜, 26.70㎜의 생육저해환을 형성하면서 상승작용을 보여주었다 (Table 3).
Enhancing antibiotic effect of 70% ethanol extract and its fractions from the root of Rumex japonicus.
EF의 항균 효과를 나타내는 물질과 HF와 CF의 항생제 증 강효과를 나타내는 물질이 다르다는 것을 확인 할 수 있었으 며, 이러한 결과는 용매의 극성에 따른 분리로 인한 시료 간 활성 성분의 차이로 인해 나타나는 결과로 판단되었다. 추후 연구 진행 시 물질 분리 및 정제를 통해 항균 효과와 항생제 증강효과를 나타내는 물질을 규명한다면 새로운 항균 물질 개 발이 가능할 것으로 생각되었다.
4. Broth dilution assay에 의한 분획의 항생제 증강 효과
Disc diffusion assay를 통해 우수한 항생제 병용 효과를 나 타낸 시료가 S. epidermidis와 S. aureus의 생장에 어떠한 영 향을 미치는지 조사하기 위해 broth dilution assay를 이용하여 항균활성을 측정한 결과를 Fig. 1에 나타내었다.
Inhibitory effect of 70% ethanol extract and its fractions from the root of Rumex japonicus on growth of S. aureus and S. epdermidis.GM; Gentamicin, HF; n-Hexane fraction of Rumex japonicus, CF; Chloroform fraction. Values are means ± SD (n = 3).
S. aureus의 생장 저해 곡선을 살펴보면 고농도에서는 gentamicin을 단독으로 처리한 실험군이 높은 저해능을 보여 주었지만 저농도에서는 급격히 활성이 낮아지는 것으로 확인 되었으며 CF와 gentamicin을 병행하여 처리한 실험군에서는 저농도에서도 약 60%의 저해 활성을 나타내었다 (Fig. 1a). HF을 병행 처리한 경우 고농도에서는 CF 병행 처리구보다 높 은 저해활성을 보였지만 저농도에서는 약 15%의 저해활성을 나타냄으로서 gentamicin을 단독으로 처리한 실험군보다는 높 았지만 CF와 병행 처리한 실험군보다는 낮은 활성을 보여주 었다. S. epidermidis의 생장 저해 곡선도 S. aureus의 결과와 마찬가지로 저농도의 CF와 gentamicin을 병행 처리하였을 때 약 70%의 저해활성을 보여줌으로써 1.19%의 저해활성을 나 타낸 gentamicin 단독 처리군보다 높은 활성을 보여주었다 (Fig. 1b).
시료의 특성상 여러 활성 성분의 복합적인 작용으로 정확한 메카니즘을 확인하기에는 어려움이 있으므로 추가적으로 물질 분리 및 정제를 통해 활성 성분을 규명하고 활성 메카니즘을 연구함으로써 천연 항균 소재로 개발할 수 있을 것으로 생각 되었다.
5. MTT assay에 의한 세포독성
상용 항생제 중 하나인 gentamicin을 참소리쟁이 뿌리 추출 물 및 분획과 병행하여 처리하였을 때의 세포독성을 MTT assay를 이용하여 측정한 결과를 Fig. 2에 나타내었다.
L929 cell viabilities of the extract and fractions from the root of Rumex japonicus HOUTT and gentamicin by MTT assay.GM; Gentamicin, ER; 70% Ethanol extract of Rumex japonicus HOUTT, HF; n-Hexane fraction, CF; Chloroform fraction, EF; Ethyl acetate fraction, BF; n-Butanol fraction, AF; Aqueous fraction. Means values ± SD form triplicate separated experiments are shown. Means within a column followed by the same letter are not significant based on the DMRT (*p < 0.05).
Gentamicin을 단독으로 처리하였을 때에는 실험이 실시된 모든 농도에서 95.00% 이상의 세포 생존율을 보였으나, 10㎎/㎖ 농도의 EF을 gentamicin 1㎎/㎖과 병행하여 처리한 실험군의 세포 생존율이 33.96%로 세포독성이 있음을 확인할 수 있었다. 항생제 증강 효과가 우수하였던 HF을 2㎎/㎖ 이 하의 농도로 gentamicin 1㎎/㎖과 병행하여 처리하였을 때, 100.84 - 112.89%의 세포 생존율을 나타냄으로써 gentamicin을 단독 처리한 실험군보다 높은 세포 생존율을 보여줌으로써 세 포 생장을 촉진하는 결과를 확인할 수 있었다. 또한 CF을 2㎎/㎖ 이하의 농도로 gentamicin 1㎎/㎖과 병행하여 처리하 였을 때, 76.44 - 99.56%의 세포 생존율을 나타냄으로써 우려 할 만한 독성을 나타내지는 않았다. 하지만 CF을 10㎎/㎖의 농도로 gentamicin 1㎎/㎖과 병행하여 처리하였을 때, 50.80%의 세포 생존율을 보여줌으로써 세포의 생장을 저해시 키는 것으로 확인되었다.
참소리쟁이 뿌리 70% EtOH 추출물 및 분획과 상용 항생 제인 gentamicin의 항생제 증강 효과를 그람 음성 세균인 S. aureus와 S. epidermidis에서 disc diffusion assay를 이용하여 확인한 결과, 두 균 모두 추출물과 분획을 단독으로 처리하였 을 때에는 CF과 EF이 높은 항균활성을 보여주었지만, gentamicin을 병행하여 처리하였을 때에는 HF과 CF에서 높은 항생제 증강 효과를 나타내었다.
우수한 항생제 증강 효과를 나타내었던 HF과 CF이 S. epidermidis와 S. aureus의 생장에 어떠한 영향을 미치는지 조 사하기 위해 broth dilution assay를 이용하여 항균활성을 측정 한 결과 CF을 항생제와 병행하여 처리하였을 때 두 균 모두 낮은 농도에서도 균의 생장을 유의적으로 억제시키는 것을 확 인할 수 있었다. 또한 MTT assay를 이용하여 참소리쟁이 뿌 리 70% EtOH 추출물과 분획과 상용 항생제인 gentamicin (1㎎/㎖)을 병행하여 처리하였을 때 세포독성을 확인한 결과, HF와 CF를 2㎎/㎖ 이하의 농도로 처리하였을 때에는 우려할 만한 독성은 없는 것으로 확인되었다. 하지만 CF를 10㎎/㎖ 의 고농도로 처리하였을 때 50.80%의 세포 생존율을 나타냄 으로써 세포의 생장을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 이러 한 결과를 바탕으로 참소리쟁이 뿌리는 항생제 보조제로서의 활용 가치가 높은 것으로 생각되었다.
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