Rhizopus delemar로 발효된 지황의 이화학적 성분 분석
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Abstract
This study was carried out to determine the physicochemical components of Rehmannia glutinosa (RG) fermented with Rhizopus delemar.
Physicochemical components such as changes in moisture content, pH value, total acidity, amount of reducing sugars as well as quantity of free sugars, free amino acids, and catalpol were investigated. Result showed that, the moisture content ranged from 64.26 to 65.51%. The pH and total acidity of the fermented RG decreased significantly during Fermentation. The reducing sugar content ranged from 0.10 to 1.34%. The most abundant main free sugars were identified as raffinose, xylose, glucose, fructose, and sucrose. The sucrose content in 80% ethanol and in water extracts increased during RG Fermentation. In total, 26 free amino acids were detected, including seven essential amino acids. In addition, the quantity of free amino acids decreased significantly during Fermentation. Finally, the catalpol content of the fermented RG was highest on the 2nd day of Fermentation at 2,028.67㎎/ 100 g.
These results indicated that Fermentation of Rhizopus delemar could be used to enhance biological activity, and that fermented RG could be used as a functional material and as an edible resource in food and functional materials industries.
Keywords:
Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel., Rhizopus delemar, Fermentation, catalpol, Extract서 언
지황 (Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel.)은 현삼 과에 속하는 약용작물로, 우리나라를 비롯하여 동아시아에 분 포하는 다년생 식물이다 (Jeong et al., 2004). 지황의 뿌리는 한약재로 이용되어지며, 용도에 따라 생것을 생지황, 건조시킨 것을 건지황, 쪄서 말린 것을 숙지황이라고 분류한다 (Kim et al., 2008).
생지황 및 건지황의 주요 성분으로는 catalpol과 더불어 rehmanin, carotene, β-sitosterol 및 stigmasterol, vitamin A, raffinose, fatty acid, arginine, stachyose, carbohydrate, norcarotenoid, γ-butyl amino acid 등의 다양한 성분이 알려 져 있다 (Ahn et al., 1998).
지황의 약리작용에 한 연구에서 catalpol이 치매 치료에 효 과가 있다고 보고되었다 (Jiang et al., 2008). 또 지황 추출물 의 경구 투여에 의한 토끼의 혈당강하효과 (Kubo et al., 1994), 면역에 효과가 있다는 등의 보고가 있다 (Tian et al., 2006). 지황의 효능 효과에 관한 연구가 많이 이루어지고 있 으나, 지황은 쓴맛이 강하여 다양한 식품 소재로 활용되지 못 하고 있는 실정이다.
최근 들어 유산균, 효모, 곰팡이 등의 미생물을 이용한 발효 기술의 연구로 다당체, 올리고당, 아미노산 펩타이드 등의 발 효산물을 얻고, 상호간의 시너지 작용으로 생리활성 효능이 상 승되는 것에 대한 연구가 많이 진행되고 있다 (Yang et al., 2007). 주로 탄수화물과 단백질을 분해하는 미생물 중의 하나 인 곰팡이는 분비하는 효소에 의하여 생성되는 아미노산류, 유 기산류, 당류 등의 맛 성분은 제품의 품질에 결정적인 영향을 준다. 뿐만 아니라 bioconversion에 의하여 다양한 생리활성작 용을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Lee et al., 2005).
국내에서 Rhizopus 속이나 Aspergillus 속 등의 곰팡이를 이 용하여 전분질 원료를 당으로 전환시킬 수 있는 당화 효소의 생성을 목적으로 곡자, 국 등을 제조해 막걸리 주조에 이용하 고 있다 (Kim et al., 2012). 전통누룩에서 Rhizopus 속 곰팡 이는 당화 아밀라아제 생성을 주도하는 것으로 알려져 있으며 (So and Lee, 2009), 누룩의 당화력을 향상시키기 위하여 Rhizopus 속을 인위적으로 접종하는 연구도 종종 보고되고 있 다 (So, 1993).
최근에 천연물 소재는 주목받는 분야이며, 식물유래 생리활 성물질은 대사증후군 및 성인병을 예방하는 기능성소재로서 각광받고 있다. 기존 천연물질을 이용한 추출 방법은 주로 단 순 추출하거나 액상발효방법을 활용하여 왔지만 효과가 낮은 한계가 있으므로, 최근 다양한 기질에서도 자랄 수 있는 곰팡 이류 등의 미생물을 활용해 고체 발효함으로써 발효 대상 기 질을 그대로 이용해 생 변환 효율을 높이는 기술을 사용하고 있다 (Bae et al., 2004).이는 미생물이 식물 섬유소 및 각종 천연물을 분해 및 변환하는 능력이 우수하므로 대부분 식물 유래 천연물질을 발효 대상으로 사용할 수 있는 장점 때문이 다 (Cho et al., 2006)
따라서, 본 연구에서 Rhizopus delemar로 지황을 발효하여 기능성뿐만 아니라 이용성을 증진시킨 식품 개발과 더불어 다 양한 용도로 쓰일 수 있는 소재를 개발하기 위한 기초자료로 제공하고자 한다.
재료 및 방법
1. 실험재료
본 실험에 사용된 균주는 국립농업과학원 발효가공식품과에 서 분리한 Rhizopus delemar 58-8 (KACC 46422)를 사용하 였으며 생지황 (Rehmannia glutinosa Licoxshitz ex Steudel) 은 경북 군위산 2년근으로 경동시장에서 구입하여 농촌진흥청 원예특작과학원 약용작물과에서 확인 후 사용하였다.
2. 균주 배지 및 배양조건
균의 보존용 배지로는 potato dextrose agar (PDA, Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) 배지를 사용하여, 30℃ 에서 24 시간 평판 배양하였다.
형성된 단일 colony를 potato dextrose broth (PDB, Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) 배지에 30℃에서 24 시간 3 회 계대 배양한 후, 접종원으로 사용하였다.
3. 균주 배양 및 발효 지황 제조
생지황 500 g을 세척하여 3 - 5㎝로 썰어 멸균 팩에 담아 autoclave (Vision Scientific Co., Ltd., Westland, MI, USA) 에서 121℃, 15 분 멸균시킨 후, 2% R. delemar를 접종하여 30℃ 온도의 incubater (VS-1203PFHLN, Vision Scientific Co., Ltd., Westland, MI, USA)에서 8 일 동안 배양하며 발 효시켰다.
균을 배양한 지황은 -80℃ 초저온냉동기 (deep freezer, Ilsin BioBase Co., Ltd., Dongducheon, Korea)에서 24 시간 동결시킨 후 동결건조기 (freeze dryer, Ilsin BioBase Co., Dongducheon, Korea)에서 72 시간 동안 동결 건조시킨 것을 분쇄하여 시료로 사용하였다.
4. 발효 지황의 수분 함량, pH 및 산도 측정
발효 지황의 수분 함량은 적외선 수분 측정기 (MS-70, AND Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. pH는 시료 2 g을 칭량하여 8㎖의 증류수를 가하여 균질화한 후 3,000 rpm에서 15 분간 원심분리 하여 상등액을 취한 후 pH meter (HM-30P, DKK-TOA, Tokyo, Japan)로 측정하였다.
총 산도는 pH 측정의 시료와 동일한 시료를 3,000 rpm에 서 15 분간 원심분리한 후 시료액 0.1㎖에 0.9㎖의 증류수 를 가하여 1㎖로 정용한 후, 0.1 N NaOH로 pH 8.3에 도달 할 때까지 적정하였다. 적정에 소비된 NaOH 소비량을 이용 하여 acetic acid 함량 (%)으로 환산하여 총산 함량을 표시하 였다. 실험은 3 회 반복하여 그 평균값으로 나타내었다.
5. 환원당 측정
환원당은 dinitrosalicylic acid (DNS)법 (Kim et al., 2012) 에 따라 시료 2 g을 칭량하여 8 ㎖의 증류수를 가하여 균질 화한 후 3,000 rpm에서 15 분간 원심분리 하여 상등액을 취 한 후 DNS reagent 1㎖을 가하여 15 분간 끓인 다음, 냉각 한 후 증류수 3㎖을 첨가하여 microplate reader (Biotek Syergy Mx, Biotek Instruments, Winooski, VT, USA)를 이 용하여 546㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 당의 정량은 glucose를 표준물질로 사용하였으며, 표준곡선으로부터 환산하 여 함량을 산출 하였다.
6. 발효 지황 추출물 제조
동결 건조한 발효 지황을 사용하여 물 추출물 및 80% 에 탄올 추출물을 제조하였다. 물 추출물의 제조는 다음과 같다.
각 발효물 5g에 끓인 증류수 100㎖을 혼합 후 ultrasonication (Power Sonic 420, 50/60 HZ, 700W, Hwashin Co., Seoul, Korea) 로 1 시간 씩 2 회 반복 추출한 후 Whatman No. 2 여과지를 이용하여 여과시킨 후, 여과액을 200 ㎖로 정용하여 rotary vacuum evaporator를 이용하여 50℃ 이하에서 감압·농축한 뒤, 이를 같은 추출용매로 용해하 여 본 실험의 분석용 시료로 사용하였다.
80% 에탄올 추출물의 제조는 다음과 같다. 각 동결건조 된 발효물 5 g에 80% 에탄올 수용액 100㎖씩 가하여 ultrasonicator (Power Sonic 420, 50/60 HZ, 700W, Hwashin Technology Co., Seoul, Korea)로 1 시간씩 2 회 sonication 하여 추출한 후 Whatman No. 2 여과지를 이용하여 여과시킨 후, 여과액을 200㎖로 정용하여 rotary vacuum evaporator를 이용하여 50℃ 이하에서 감압·농축하였고, 이를 같은 추출용매 로 용해하여 본 실험의 분석용 시료로 사용하였다.
7. 유리당 분석
유리당 분석은 HPLC (Waters 2695, Waters Co., Miliford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다.
발효 지황 추출물을 희석하여 0.45㎛ PVDF membrane filter (Waters Co., Miliford, MA, USA)를 여과한 것을 시험 용액으로 하였고, column은 YMC-PACK Polyamine II (5㎛, 4.6 × 250㎜, YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan)을 사용 하였으며, mobile phase는 acetonitrile : water 혼합액 (75 : 25, v/v), flow rate는 1.0㎖/min, detector는 ELSD Signal (Waters 2414, Waters Co., Miliford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다
8. 유리 아미노산 분석
유리아미노산 분석은 유리아미노산은 발효 지황 추출물에 5% TCA 용액을 5 배 넣은 후 원심분리 (12,000 rpm, 15 분)한 다음 상등액을 취하여 n-hexane 혼합하여 비극성 물질 을 처리한 후 0.25㎛ syringe filter에 통과시킨 후 아미노산 분석기 (Hitachi L-8900, Hitachi High Technologies America Inc., Schaumburg, IL, USA)로 분석하였다.
이때 column은 hitachi 4.6 × 60㎜ (seperation), hitachi 4.6 × 40㎜ (ammonia filtering)을 사용하였으며, column 온도 는 50℃, mobile phase는 buffer set (PH-SET KANTO, Hitachi High Technologies America Inc., Schaumburg, IL, USA), flow rate (㎖/min)는 buffer 0.4, ninhydrin 0.35, injection volume은 20㎕였다.
9. catalpol 함량분석
발효 지황의 80% 에탄올 및 물 추출물 시료의 성분분석은 UPLC (Waters 2626, Waters Co., Miliford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 추출물은 0.2㎛ PVDF membrane filter 를 여과한 것을 시험용액으로 하였고, 분석조건은 다음과 같다.
Column은 ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7㎛, 2.1 × 50.0㎜, Waters Co., Miliford, MA, USA), mobile phase 조성은 solvent A는 0.5%의 acetic acid를 포함한 water를 혼 합하여 사용하였으며 solvent B acetonitrile를 사용하였고, flow rate 및 column 온도는 각각 0.5㎖/min, 30℃, 검출 파 장은 280㎚로 detector는 Photodiode array detector ELSD Signal (Waters 204, Waters Co., Miliford, MA, USA)를 사 용하여 검출하였다.
표준물질 catalpol은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 로부터 구입하였고 UPLC에서 나타난 peak area의 3회 반복 평균값을 취한 후 표준품의 양과 peak area사이의 상관관계를 도출하여 검량선을 작성하여 계산하였다.
10. 통계처리
본 실험의 결과는 3 회 반복 실험을 실시한 뒤 평균과 표 준편차로 나타내었다. 각 실험결과에 대한 통계분석은 SPSS 25.0 program (Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago IL, USA)을 이용하여 ANOVA를 실시 한 후 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)방법을 사용하 여 각 처리구간의 유의적 차이를 검증하였다 (p < 0.05).
결과 및 고찰
1. 발효기간 중 지황의 이화학적 특성 변화
Rhizopus delemar를 접종하여 8 일간 발효한 지황의 수분함 량, pH 및 환원당의 측정 결과는 Table 1과 같다. 발효 지황 의 수분함량은 전반적으로 64.32 - 65.51%로 거의 유사하였다. 이는 발효 기간이 증가함에 따라 발효 지황의 수분 함량이 거 의 변화가 없는 것으로 나타났다.
Changes in moisture, pH, total acidity and reducing sugar content of fermented R. glutinosa
pH는 대조구가 pH 5.20인데 비하여 발효 4 일차에 pH 4.86로 가장 낮은 값을 나타났다. 이는 R. delemar 균주의 생 장은 알칼리보다는 pH 4 - 5 범위의 산성에서 배양이 잘된다 는 보고와 일치하였다 (Kim et al., 1999). 산도는 배양기간이 지남에 따라 감소하는 경향을 보는데 배양 0 일차 0.53%로 총 산도가 가장 높았으며 이후 배양 2, 4, 6, 8 일차 각각 0.52%, 0.22%, 0.17%, 0.26%로 대조구에 비해 감소하였다.
이 결과는 발효가 진행되면서 산성을 나타내는 유기산의 일 부분이 소모되면서, 세포내 탈 탄산효소에 의해 다른 물질로 전환되어 발효물의 산도를 감소시키거나 유지하는 경향을 나 타낸다는 연구결과와 유사하였다 (Lee et al., 2016).
발효 지황의 환원당 함량을 측정한 결과 발효 기간이 증가 함에 따라 함량 차이를 보였다. 발효 6 일차 환원당 함량은 1.34㎎/100 g으로 가장 높은 환원당 함량을 나타냈으며 대조 구 환원당 함량 0.10㎎/100 g에 비해 약 13 배 높은 환원당 함량을 나타내었다. Park 등 (2010)이 보고한 바에 따르면 α- amylase를 생성하는 미생물들이 발효식품 제조에서 전분질 원 료를 당화시키는 것이라고 하였는데, 본 연구에서도 R. delemar를 지황에 배양하여 발효기간이 증가함에 따라 효소활 성이 증가하여 당화되었음을 확인 할 수 있었다.
2. 발효 지황의 유리당 함량 분석
발효 지황의 추출용매에 따른 유리당 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 대조구의 80% 에탄올 추출물은 raffinose 356.17㎎/100 g, xylose 329.17㎎/100 g, fructose 1,177.53㎎/ 100 g, glucose 2,550.33㎎/100 g, sucrose 3,005.26㎎/100 g이 검출되었다.
The free sugars content of fermented Rehmannia glutinosa.
발효 4 일차 지황의 80% 에탄올 추출물의 경우 xylose의 함량이 661.52㎎/100 g으로 약 2 배, sucrose의 함량이 3,384.15㎎/100 g 으로 약 1.13 배 증가하였다. 반면 glucose 는 1,726.11㎎/100 g 으로 대조구에 비하여 감소하였다. raffinose, fructose는 발효 2 일차 이후에는 검출되지 않았다.
열수추출물에서 대조구의 유리당 함량은 raffinose 284.11㎎/ 100 g, xylose 365.47㎎/100 g, fructose 635.50㎎/100 g, glucose 2,114.78㎎/100 g, sucrose 1,903.53㎎/100 g이 검출 되었다.
발효 2 일차 지황의 열수추출물에서는 raffinose의 함량이 516.03㎎/100 g, xylose의 함량이 665.68㎎/100 g 으로 각각 약 1.82 배, sucrose의 함량이 3,097.94㎎/100 g 으로 약 1.63 배 증가하였다.
반면 glucose의 함량은 발효 2 일차에 1,653.37㎎/100 g으 로 감소하였다가 발효 8 일차에 2,180.45㎎/100 g으로 대조구 에 비해 증가하였다. fructose는 발효 2 일차 이후에는 검출되 지 않았다.
이는 발효 미생물이 amylase 분해효소에 의해서 glucose 등 과 같은 환원당으로 분해되어져 발효의 기질로 이용되어 진다 는 보고가 있으며 본 연구의 결과와 유사하였다 (Lee et al., 2015).
3. 발효 지황의 유리 아미노산 분석
발효 지황이 가지는 유리아미노산의 조성은 Table 3과 같다. 총 아미노산은 총 아미노산은 필수아미노산 7 종을 포함하여 26 종이 검출되었으며 배양기간이 경과함에 따라 유리 아미노 산이 유의적인 변화를 나타내었다.
Amino acid content of fermented Rehmannia glutinosa. (unit: ㎎/100 g)
80% 에탄올 추출물의 배양 2 일차의 경우 arginine이 106.88㎎/100 g 으로 구성성분 가장 높았으며, 그 다음으로 g-amino-N-butyric acid가 168.56㎎/100 g, glutamic acid 50.90㎎/100 g, aspartic acid 31.59㎎/100 g 순으로 나타났다. 그 외에도 cystine, methionine, tyrosine, phenylalanine, histidine 등이 검출되었다. 그 중 taurine과 phenylethylamine은 배양 0 일차에는 검출되지 않았으나, 배양 2 일차부터 검출되 었다. 반면에 citrulline, tyrosine, isoleucine, phenylalanine, β- amino isobutyric acid, ornithine은 발효 2 일차에는 검출되었 으나, 4 일차 이후부터는 검출되지 않았다. 또한 threonine, serine, histamine, arginine은 발효 6 일차 이후부터 검출되지 않았고, methionine은 발효 8 일차에 검출되지 않았다.
Lew 등 (1988)이 보고한 바에 따르면 미생물의 protease 활성으로 단백질이 가수 분해됨으로써 아미노산 생성 증가에 기인 한다고 보고하였는데, 본 실험에서도 발효 기간에 따라 R. delemar의 protease 활성의 증가로 지황의 단백질이 가수 분해됨으로써 아미노산이 증가함을 확인 할 수 있었다. 또한 미생물 증식이 왕성해짐으로써 아미노산의 생성보다 소비 증 가로 인해 아미노산 함량이 다시 감소한 것으로 판단되었다 (Park and Suh, 1995).
열수 추출물의 유리아미노산의 함량은 배양 2 일차의 경우 arginine이 46.00㎎/100 g 으로 구성성분 가장 높았으며, 그 다음으로 alanine이 9.24㎎/100 g으로 나타났다. 열수 추출물 에서는 80% 에탄올 추출물에 비해 소량의 아미노산이 검출되 었거나 또는 검출 되지 않았다.
아미노산의 조성과 함량은 발효 미생물 사용 여부 및 원료 및 발효기간 등의 조건에 따라 기인하며 (Youn et al., 2016) 미생물을 활용한 발효로 다양한 특성을 가진 아미노산이 증가 시킬 수 있다고 보고되고 있다 (Baek et al., 2016). 본 연구 의 결과를 볼 때 발효 미생물의 사용과 발효기간을 조정함으 로써 아미노산 조성을 증가시킬 뿐만 아니라 독특한 향미를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
4. 발효 지황의 Catalpol 함량 분석
발효 지황의 추출용매에 따른 성분 함량을 측정하였다. 본 실험에서는 지황에 존재하는 지표물질인 catalpol을 UPLC로 분석을 통해 확인하였고 함량을 Table 4에 나타내었으며, UPLC 크로마토그램은 Fig. 1 에 나타내었다.
The content of catalpol in fermented Rehmannia glutinosa. (unit: ㎎/100 g)
UPLC chromatograms of catalpol from Rehmannia glutinosa and fermented Rehmannia glutinosa.A; catalpol standard (10㎎/㎖), B; Rehmannia glutinosa catalpol, C; fermented Rehmannia glutinosa catalpol.
분석결과 대조구의 80% 에탄올 추출물은 260.77㎎/100 g, 물 추출물은 273.15㎎/100 g으로 나타났으며, 발효 지황을 분 석한 결과 4 일차에 80% 에탄올 추출물은 1,307.82㎎/100 g 으로 대조구에 비해 약 5 배 증가한 함량으로 높은 함량을 나타내었다. 또한 물 추출물은 발효 지황 2 일차에 2,028.67㎎/100 g으로 대조구 보다 약 7.4 배 이상 높은 함량 을 나타내었다.
본 실험에서 대조구와 비교 했을 때 발효 지황의 catalpol 함량이 높게 나타났다. 본 실험의 대조구 뿐만 아니라 Lee 등 (2017)이 보고한 지황의 catalpol의 함량과 대조하였을 때, 발 효 지황의 catalpol의 함량이 높게 나타났다. 이러한 발효공정 을 통한 약용소재 유효성분의 생물전환으로 약재의 효능 증가 및 새로운 효능 도출이 가능할 수 있으며, 체내 이용 및 흡수 율 증진 시켜 여러모로 식품산업에서 폭넓은 활용이 가능할 것으로 판단된다 (Cho et al., 2006).
감사의 글
본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업과학기술연구사 업(과제번호: PJ01270102)의 지원에 의해 이루어진 것으로 이 에 감사드립니다.
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