인삼 약 배양을 통한 체세포배 발생 유도 및 토양 순화

서 언

고려인삼 (Panax ginseng C. A. Meyer)은 두릅나무과에 속하는 초본성 다년생 작물로 대한민국의 대표적인 약용작물이며, 주로 대한민국, 중국의 만주 지방, 러시아의 극동지방에서 재배되고 있다. 인삼의 대표적인 기능성 성분은 진세노사이드로, 약 150여 종의 진세노사이드가 보고 되었으며 (Zhao et al., 2015), 다양한 질병에 대한 진세노사이드의 약리 효능이 검증되었다 (Shao et al., 2020).

인삼은 유전자원의 다양성이 부족한데, 이러한 특성으로 인삼의 품종 육성은 매우 어렵다. 또, 인삼의 종자와 종묘는 일정 기간 휴면하는 특성이 있어 급속한 세대의 진전 역시 어렵다 (Kim et al., 2015; Lee et al., 2016; Lee et al., 2018). 현재까지 개발된 모든 인삼 품종은 순계 분리 육종방법으로 육성되었다. 기후변화와 이상기상에 대응한 재해 및 병 저항성 품종의 개발이 필요하지만, 이러한 형질은 복잡한 메커니즘을 가지고 있다. 따라서 순계 분리를 이용한 품종 육성에는 한계가 있으며 새로운 육종방법의 도입이 필요하다 (Lee et al., 2020).

인공교배를 통한 교배 육종은 많은 작물의 품종 육성에 사용되는 방법이다. 고려인삼은 자가수정을 원칙으로 하지만 인공교배 역시 가능하다고 알려져 있다 (Bang et al., 2020). 하지만 인삼은 종자 파종 후 3 년 이상이 지나야 개화할 수 있다 (Kim et al., 2016a). 이러한 특성으로 인공교배 후에 유전적인 고정을 위해서는 최소 30 년 이상의 오랜 시간이 걸리게 된다. 또, 1 년에 50 개 내외의 후대 종자만이 생산되어 다양한 재조합이 있는 후대를 얻기 힘들다 (Lee et al., 2019).

동정생식은 소포자가 배우체로 발달하지 않고 포자체로 발달하여 배 또는 식물체를 형성하는 것을 말하는데, 1 세대 만에 반수체 또는 배가 반수체 등 동형접합성인 식물체를 얻을 수 있는 장점이 있다 (Ahmadi and Ebrahimzadeh, 2020). 반수체는 Blakeslee 등 (1922)에 의하여 최초로 발견되었는데, 자연적인 반수체의 발생 빈도는 매우 낮아 육종에 실질적으로 활용이 어렵다. 조직배양을 통한 반수체 유도는 Guha와 Maheshwari (1964)이 약 배양에 성공하면서 최초로 보고되었는데, 약 배양은 많은 작물에서 동형접합성 식물체를 얻기 위한 수단으로 광범위하게 사용되고 있다 (Germanà, 2010).

약 배양을 이용한 성공적인 배 발생을 위해서 가장 먼저 고려해야 할 사항은 적합한 배양배지의 선발이다. 그중에서도 적절한 호르몬의 종류와 비율의 선발은 가장 중요하게 고려해야 하는 요소이다 (Qiao et al., 2013). 지금까지 많은 인삼 조직 배양 연구가 이루어져 왔지만 (Choi et al., 1998; 1999; Lee et al., 2019; Lee et al., 2021), 인삼 약 배양에 관한 연구는 2 건만이 보고되었을 뿐 약 배양을 통한 배 발생과 식물체의 토양 순화는 지금까지 보고되지 않았다 (Lee et al., 2009; Lee et al., 2013).

본 연구에서는 인삼 약 배양 시 배 발생 캘러스 유도에 적합한 옥신과 사이토키닌 종류를 탐색하고자 하였다. 또한 약 배양으로 형성된 배의 적정 발아 조건을 조사하였으며 재분화 식물체의 배수성을 검정하고 토양 순화 가능성을 밝히고자 하였다.

재료 및 방법

결 과

1. 캘러스 유도

화뢰에서 분리한 약을 캘러스 유도배지에 치상하였다 (Fig. 1A - 1C). 치상 10 일 후, 캘러스처럼 보이는 형태가 최초로 나타났으며 (Fig. 1D), 2 주 후에는 뚜렷한 캘러스 형태를 보였고 (Fig. 1E), 4 주 후에는 육안으로도 확인될 정도로 캘러스가 성장하였다 (Fig. 1F).

Fig. 1.

Callus induction from anther culture of P. ginseng.(A) collected flower bud, (B) flower bud with petals removed to collect anthers, (C) inoculated anther, (D) callus-like structure 10 days after culture, morphology of callus 20 (E) and 30 (F) days after inoculation, respectively. Scale bar; 1 ㎝.

배양 8 주 후, 캘러스 유도배지의 호르몬 종류 및 조합에 의한 영향을 조사하였다. 그 결과, 호르몬이 전혀 첨가되지 않은 배지에서는 캘러스가 형성되지 않았으며, NAA 0.5 ㎎/ℓ와 BA 0.1 ㎎/ℓ가 첨가된 배지에서 캘러스 유도율은 62.9%로 다른 호르몬이 첨가된 배지에 비하여 유의미하게 낮았다. 나머지 호르몬이 첨가된 배지의 캘러스 유도율은 74.9% - 83.8% 범위로, 처리 별로 유의미한 차이는 발견되지 않았다 (Table 1).

Table 1.

Effect of hormones on callus induction from anther culture of P. ginseng.

캘러스 크기는 호르몬의 종류와 농도에 따라 중요한 차이가 관찰되었다. 2,4-D와 NAA의 농도가 증가할수록 캘러스 크기는 점차 증가하였는데, NAA에 비하여 2,4-D를 첨가하였을 때, 캘러스 크기가 전반적으로 컸다 (Fig. 2A and 2B).

Fig. 2.

Callus induction from anther culture of P. ginseng.(A) callus derived from the medium containing 2,4-D 1.0 ㎎/ℓ, (B) NAA 1.0 ㎎/ℓ and BA 0.1 ㎎/ℓ, (C) 2,4-D 1.0 ㎎/ℓ and BA 0.1 ㎎/ℓ and (D) 2,4-D 1.0 ㎎/ℓ and KT 0.1 ㎎/ℓ. Scale bar; 1 ㎝. 2,4-D; 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, NAA; α-naphthaleneacetic acid, BA; benzyladenine, KT; kinetin.

사이토키닌을 캘러스 유도배지에 첨가하였을 때, 첨가하지 않은 경우보다 캘러스 크기가 증가하였는데, 2,4-D 1.0 ㎎/ℓ와 BA 0.1 ㎎/ℓ를 첨가한 캘러스 유도배지에서 캘러스 크기가 가장 컸다. BA를 첨가한 캘러스 유도배지가 KT를 첨가한 배지 보다 캘러스 크기가 전반적으로 컸지만, 사이토키닌 종류에 의한 유의미한 차이는 없었다 (Fig. 2C and 2D). 부정근 유도는 2,4-D를 단독으로 첨가한 배지가 다른 배지 보다 대체로 높았으며, 2,4-D 농도의 증가는 부정근 유도에 부정적인 영향을 나타내었다.

2. 체세포배 유도

캘러스를 체세포배 유도배지로 계대배양한 8 주 후 체세포배 형성 여부를 조사하였으며, 그 결과는 Table 2와 같다.

Table 2.

Effect of hormones on embryogenesis from anther culture of P. ginseng.

호르몬 무첨가 배지에서는 체세포배가 전혀 형성되지 않았던 반면, 호르몬을 첨가한 배지에서는 체세포배가 형성되었는데, 배 형성률은 0.4% – 4.2%로 매우 낮은 수준이었다. 2,4-D를 단독으로 1.0 ㎎/ℓ 첨가한 배지에서 배 형성률이 4.7%로 가장 높았고, 유도된 체세포배의 개수는 절편당 6.0 개로 가장 많았다 (Fig. 3A). 다음으로 2,4-D 1.0 ㎎/ℓ와 KT 0.3 ㎎/ℓ를 조합 처리한 배지에서 2.2%의 배 형성률과 절편체 당 평균 3.5 개 배가 형성되었는데 (Fig. 3B), 2,4-D 단독 처리보다는 높지 않았다. 전반적으로 사이토키닌을 첨가하였을 때 배형성률이 감소하였다. 특히, BA는 KT보다 배 형성에 더 불리한 경향이 있었다.

Fig. 3.

Induction of embryo from anther culture of P. ginseng.Embryos derived from the medium containing (A) 2,4-D 1.0 ㎎/ℓ and (B) 2,4-D 1.0 ㎎/ℓ and BA 0.3㎎/ℓ. Scale bar; 1 ㎝. 2,4-D; 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, KT; kinetin.

3. 체세포배 발아 및 유식물체 유도

유도된 배는 세 가지 농도의 GA₃가 첨가된 발아배지와 GA₃ 무첨가 발아배지에 치상하였으며, 4 주 후에 발아 여부를 조사하였다. 그 결과 GA₃ 무처리 배지에서는 11.4%의 체세포배 발아율을 보였으나, GA₃ 첨가 배지에서는 발아율이 78.1% – 84.8%로 무처리 대비 7 배 이상 증가하였다 (Fig. 4A and 4B). GA₃의 농도가 증가할수록 발아율은 점차 증가하였으나 통계적으로 유의적인 차이는 보이지 않았다.

Fig. 4.

Germination of embryos from anther culture of P. ginseng.(A) comparison of embryo germination rates based on GA3 concentration. (B) formation of shoots and roots after 4 weeks of culture on germinaton media. Scale bar; 1 ㎝. GA3; gibberellic acid. NS; not significant. *, **, *** indicates significant differences (p < 0.05, 0.01, 0.001, respectively) as revealed by One-way ANOVA. Different letters are significantly different by Duncan’s Multiple Range Test (DMRT, p < 0.05).

4. 유식물체 형성 및 토양순화

발아한 신초는 생육배지에 계대배양 한 후 지속적으로 성장하였다 (Fig. 5A). 계대배양 없이 생육배지에서 약 5 개월 이상 생육하였을 때 지상부는 노화되었다. 이때, 배지에서 뿌리를 수확하였는데, 잠아를 가지고 있는 굵은 주근이 발달한 형태였다 (Fig. 5B). 수확한 뿌리는 GA₃를 처리한 후 상토로 이식하였으며 20 개 중 16 개의 뿌리가 출아하여 출아율은 80.0%였다 (Fig. 5C).

Fig. 5.

Plantlet formation from anther culture and acclimatization of P. ginseng.(A) plantlet formation after 12 weeks of culture on the growth media. (B) harvested in vitro grown roots after 5 months of culture on elongation media. (C) shoot sprouting after acclimatization. Scale bar; 1 ㎝.

5. 재분화 식물체의 배수성 검정

유세포기를 이용하여 발아한 재분화 식물체의 배수성을 검정하였다. 그 결과 16 개의 재분화 식물체와 대조 식물체는 모두 상대적 형광 강도 (flouorescence intensity)가 약 400 에서 peak를 보였다(Fig. 6A and 6B).

Fig. 6.

Ploidy level analysis of the regenerated plants derived of anther culture using flow cytometry.Histogram fluorescence intensity documenting the relative DNA content of the nuclear suspension from young leave of (A) regenerated plant and (B) control plant.

고 찰

약 배양은 반수체와 배가 반수체 등 동형접합성 식물체를 얻기 위하여 사용되는 조직배양 기술이다 (Germanà, 2011). 약 배양에 성공하기 위해서는 적절한 호르몬을 적정 수준으로 사용하는 것이 필수적이다 (Li et al., 2013; Qiao et al., 2013). 인삼의 약으로부터 캘러스를 유도하기 위해 가장 많이 사용되는 옥신 호르몬은 2,4-D와 NAA이며, 사이토키닌 호르몬은 옥신과 함께 사용하였을 때, 캘러스의 유도에 효과적이라고 하였다 (Lee et al., 2013).

본 연구에서 호르몬을 첨가하지 않은 배지에서는 캘러스가 유도되지 않았다. 이러한 결과로 보아 인삼의 약 배양 시 호르몬의 첨가는 캘러스의 유도에 필수적 요소로 판단된다 (Table 1). 이번 연구 결과와 대조적으로 Lee 등 (2009)은 호르몬 첨가 없이 인삼의 약 배양에서 31.8%의 캘러스를 유도하였다. 이 경우를 제외하고 다른 인삼 조직배양 연구에서는 호르몬의 첨가가 캘러스 유도에 필수적인 요소였다 (Zhang et al., 2014; Kim et al., 2019).

본 연구에서 캘러스 유도율은 NAA 0.5 ㎎/ℓ와 BA 0.1㎎/ℓ가 첨가된 배지에서 다른 배지에 비하여 유의미하게 낮았는데, NAA는 2,4-D에 비하여 캘러스 유도율이 전반적으로 낮은 경향이 있었다 (Table 1). 2,4-D 1.0㎎/ℓ와 BA 0.1㎎/ℓ를 첨가한 캘러스 유도배지에서 83.8%의 가장 높은 캘러스 유도율을 나타내었는데, 사이토키닌이 첨가에 의한 유의미한 차이는 발견되지 않았다. 이와 유사하게 인삼의 엽병을 이용한 캘러스의 유도 연구에서 2,4-D를 단독으로 2.0 ㎎/ℓ – 4.0 ㎎/ℓ 첨가한 배지에서 100%에 가까운 캘러스 형성이 보고되었다 (Kim et al., 2019). 이번 연구 결과와 대조적으로 타 작물의 약 배양 연구에서 NAA를 사용한 효과적인 캘러스 유도 (Qiao et al., 2013; Blasco et al., 2015)와 BA 같은 사이토키닌 첨가에 의한 캘러스 유도율의 증가가 보고되었다 (Wang et al., 2018).

캘러스 유도율과는 다르게 캘러스 크기는 호르몬 종류와 농도에 의하여 크게 차이가 발생하였다. 캘러스 유도배지 내 옥신의 농도 증가는 캘러스 크기에 긍정적인 영향을 끼쳤으며, 2,4-D가 NAA보다 캘러스 크기 증가에 효과적이었다 (Fig. 2A and Fig. 2B). 또한, BA와 KT 같은 사이토키닌류의 첨가는 캘러스 크기를 증가시켰다 (Fig. 2C and 2D). 이와 유사하게 Lee 등 (2013)은 적당한 2,4-D와 BA를 첨가한 배지의 캘러스 크기가 NAA배지의 캘러스 크기보다 크다고 보고한 바 있다.

캘러스 유도율과 캘러스 크기를 고려하였을 때, 2,4-D 1.0㎎/ℓ와 BA 0.1 ㎎/ℓ를 첨가한 캘러스 유도배지가 인삼 약배양에 가장 적합한 것으로 판단된다.

인삼 약 배양에서 캘러스 형성률이 60% 이상으로 높았던 것과는 다르게 배 형성률은 4.7% 미만으로 매우 낮았다 (Table 2). 호르몬을 첨가하지 않은 배지에서는 배 형성이 전혀 관찰되지 않았다. 이와 유사하게 Kim 등 (2019)의 연구에서 고려인삼과 미국삼의 캘러스를 호르몬이 첨가되지 않은 배지에 치상하였을 때 배가 형성되지 않았다고 하였다. 본 연구에서 2,4-D를 단독으로 첨가한 배 유도배지에 캘러스를 치상하였을 때, 배 형성률이 4.7%로 가장 높았으며 가장 많은 6.0개의 배 형성이 확인되었다 (Table 2 and Fig. 3A).

BA와 KT를 첨가한 배지에서 2.5 ㎎/ℓ 농도까지는 KT를 첨가한 배지의 배 형성률과 배의 형성 개수가 많았으나 사이토키닌 호르몬의 첨가에 의한 배 형성률의 증가는 확인할 수 없었다. (Table 2 and Fig. 3B). 이러한 결과로 보아 인삼의 약 배양 시 배 형성에 적합한 호르몬 조건은 2,4-D 1.0㎎/ℓ의 단독적인 사용으로 판단된다.

Hu (1997)는 약 배양 시 옥신류는 배 형성을 증가시키지만, 사이토키닌은 캘러스 형성을 촉진한다고 보고한 바 있다. 이번 연구 결과와 대조적으로 보리지의 약 배양 연구에서는 호르몬이 첨가되지 않은 배지에서도 배가 유도되었으며 2,4-D 2.0 ㎎/ℓ와 BA 1.0 ㎎/ℓ를 함께 첨가한 배지의 배 유도 효율성이 가장 높다고 하였다 (Eshaghi et al., 2015).

이러한 사실은 약 배양 시 배 유도의 적정 조건은 작물별로 다르며 해당 작물의 성공적인 약 배양을 위해서는 적정 배지 조건을 다시 확립해야 함을 시사한다. 이전에 인삼 약 배양을 통한 식물체 재분화와 4배체 뿌리 형성은 보고 되었지만, 배 형성은 보고된 바 없었다 (Lee et al., 2009; Lee et al., 2013).

조직배양으로 유도된 인삼 배의 발아를 위해서는 GA₃ 처리가 필수적이라고 알려져 있다 (Zhang et al., 2014; Lee et al., 2019). 본 연구에서도 유사한 결과가 확인되었는데, GA₃를 첨가하지 않은 발아배지에서는 11.4%의 배가 발아한 것에 비하여, GA₃를 1.0 ㎎/ℓ 이상 첨가한 배지에서는 발아율이 78.1% 이상으로 향상되었다 (Fig. 4). 하지만 GA₃ 농도에 의한 발아율 차이는 확인되지 않았다. 조직배양의 결과로 유도된 인삼의 배는 휴면상태에 있으며, 이것의 휴면을 타파하기 위해서는 GA₃ 처리나 저온처리가 필수적이라고 판단된다 (Choi et al., 1999).

조직배양으로 형성된 인삼 재분화 식물체는 순화율이 매우 낮은 편이다. Choi 등 (1998)은 재분화 식물체를 토양으로 이식하였을 때, 생존율이 23%에 불과하다고 하였다. GA₃를 처리한 후 토양에 이식하였을 때도 순화율은 59.6%로 낮은 수준이었다 (Kim et al., 2013).

조직배양으로 형성된 유식물체는 수개월 동안 추가로 배양 하였을 때, 잠아를 갖는 굵은 뿌리가 생성되는데, 이 뿌리를 이용하면 순화율이 향상된다는 연구가 최근에 보고되었다 (Kim et al., 2016c; Lee et al., 2021). 이와 유사하게, 본 연구에서도 약 배양을 통하여 생성된 유식물체는 5 개월의 추가 배양 후에 굵은 뿌리가 형성되었으며 (Fig. 5A and 5B), 이것을 토양으로 옮겨 심었을 때, 출아율은 80.0%로 높았다 (Fig. 5C).

동정생식을 통한 반수체 및 배가배수체의 발생은 많은 작물에서 보고되었다 (Li et al., 2013; Wang et al., 2018; Lee et al., 2022). 인삼의 경우에도 약 배양을 통하여 4배체 부정근의 유도가 보고된 바 있다 (Lee et al., 2009). 유세포 분석기는 신속하고 정확하여 배수체 확인에 널리 활용되는 기기로 알려져 있다 (Rebelo et al., 2022).

본 연구에서는 유세포 분석기를 이용하여 약 배양으로 형성된 재분화 식물체의 배수성을 검정하였다. 그 결과 16 개의 재분화 식물체와 대조 식물체 사이에 유의미한 차이를 발견할 수 없었다 (Fig. 6). 타 작물에서 약 배양으로 형성된 반수체는 콜히친 처리 없이도 자연적으로 배가 반수체를 형성할 수 있다고 하였다 (Hoveida et al., 2017). 이러한 사실로 보아 인삼 약 배양으로 형성된 재분화 식물체의 일부는 배가 반수체일 가능성이 있다고 판단된다. 하지만 약 벽과 같은 체세포조직에서 캘러스가 유래될 가능성도 있으므로 마커를 활용한 추가적인 연구가 필요하다.

본 연구에서는 인삼의 약 배양을 이용하여 배의 발생과 식물체의 재분화 가능성을 증명하였다. 이번 연구에서 사용된 약배양의 재료는 순도가 높은 연풍 품종이었기 때문에 약 배양으로 형성된 재분화 식물체의 동형접합성을 DNA 마커로 확인할 수는 없었다. 또, 유세포 분석기의 분석 결과, 반수체 및 배수체의 발생도 확인할 수 없었다. 하지만 본 연구로 확립된 인삼 약 배양의 배 발생과 재분화 식물체의 토양 순화 조건은 인삼 약 배양을 통한 동형적합성 식물체의 생산에 크게 기여할 것으로 기대된다. 앞으로의 연구는 품종 간 교배로 형성된 F₁ 계통을 약 배양하여 동형접합성 인삼을 유도하고 이를 확인하는 데 중점을 둘 예정이다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청에서 주관하는 인삼 육종효율 증진을 위한 기반기술 개발(과제번호: PJ01018702)의 연구비 지원에 의해 이루어진 결과로 이에 감사드립니다.

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