증숙 및 초고압 증숙 공정을 통한 더덕의 면역활성 증진

1. 증숙더덕 및 초고압 더덕의 제조

더덕 (Codonopsis lanceolata)은 2012년 8월에 강원도 횡성 에서 채취한 것을 사용하였다. 채취한 더덕을 깨끗이 세정한 후 마하스팀기 (Daechang stainless, Korea)를 사용하여 증숙 가공을 하였으며, 50, 60, 90°C로 2시간씩 단계적으로 온도를 증가시켜 가열하였고, 추가로 100°C에서 3시간 증숙 가공하 였다. 1차적으로 증숙 가공을 거친 더덕은 다시 12시간 음건 시킨 후 위와 같은 증숙 가공 공정을 5번 반복 실시하였다. 증숙 가공 더덕의 유효기간 및 사용가능 기간을 늘리기 위해 20 ~ 30°C로 조절하여 음건한 뒤 시료로 사용하였다. 초고압 공정은 더덕 100 g을 비닐 팩에 10배수 70% 에탄올 용매와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압 추 출장치 (Ilshin Autoclave, Korea)를 이용하여 3,000 bar 압력 으로 25°C에서 30분간 초고압 추출을 실행하였다.

2. 추출물 제조

환류 냉각기와 온도 조절 장치가 부착된 열수추출기 (TL200-6Point(K), Misung Scientific Co., Korea)에 일반 생 더덕 (FC; Fresh C. lanceolata extract)과 초고압 공정 처리 더덕 (HC; High preesure processed C. lanceolata extract), 증숙 더덕 (SC; Steamed C. lanceolata extract), 초고압 처리 증숙 더덕 (SHC; Steamed and High Pressure Process C. lanceolata extract.)을 각각 100 g 씩 10배수 70% 에탄올 용 매를 사용하여 80°C에서 24시간 추출하였으며, 감압여과펌프 (KNF Laboport Pressure Pump, Cole-Parmer, USA)와 Whatman 사의 20 ~ 25µm . 불순물이 제거된 여액을 감압회전농축기 (Rotary Vacuum Evaporator N-N series, Eyela, Germany)를 이용하여 농축한 후 동결건조기 (PVTFA 10AT, Ilsin, Korea)를 사용하여 3일 간 동결건조 시킨 후 분말 상태로 준비하여 실험에 사용하였 다 (Kim et al., 2008).

3. 총 페놀 함량 측정

Folin-Denis법에 따라 각 공정별 추출물 샘플 1ml에 Folin- Ciocalteau 시약과 10% Na₂OH₃ 용액을 각각 1ml씩 차례대 로 가한 다음 상온에서 1시간 방치한다. 이후 표준 검량선 측 정을 위해 caffeic acid를 0100 ㎍/ml의 농도로 제조한 뒤 상온에서 1시간 동안 방치되었던 각 샘플들을 UV-vis spectrophotometer (852A Diode Array Spectrophotometer, Hewlett Packard, USA)를 이용하여 700㎚에서 흡광도를 측 정하였다. 측정된 표준 검량선으로부터 공정별 추출물의 총 페 놀 함량을 측정하였다 (Singleton and Rossi, 1966).

4. 세포주 및 세포 생육 배지

면역세포의 생육 증진 효과를 검증하기 위해 인간 면역 세포인 T cell (H₉, ATTC, USA)과 B cell (Raji, ATTC, USA)를 RPMI 1640 배지에 10%의 FBS (Heating-Inactivated)를 첨가하여 배양시켜 사용하였으며, NO 생성량 측 정을 위한 마우스 J774.1 macrophage (ATTC, USA)도 같은 방식으로 배양하여 실험하였다.

세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640 (31800022, Gibco, USA)과 α-MEM (12000-022, Gibco, USA)을 사용하였고, 추가로 필요한 HEPES buffer (90909C, Sigma, USA), Fetal Bovine Serum (10437028, Gibco, USA), Gentamycin sulfate (G1914, Sigma, USA), Trypsin-EDTA (T6689, Sigma, USA)를 구입하여 사용하였다. 또한 cytokine 측정을 위해 IL-6와 TNF-α Kit는 Chemicon (USA)사의 것을 구입 하여 실험에 사용하였다.

5. 정상세포에 대한 세포독성 측정

인간 정상 신장 세포인 HEK293을 이용하여 세포독성을 측 정하였다. 실험 은 HEK293 세포의 농도를 4.0 × 10⁴ cells/ml 로 맞춘 후 96 well plate의 각 well에 100µl씩 첨가하여 24시간 동안 CO₂ incubator (CB150, Binder, Germany) 배양 (37°C, 5% CO₂)하였다. 이후 각각 공정별 시료를 농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0mg/ml로 조절하여 100µl씩 첨가하였 고, 48시간 동안 배양 (37°C, 5% CO₂)하였다. 배양이 완료된 후에 상등액을 제거하고 차갑게 보관하였던 10% (w/v) TCA (Trichloroacetic Acid) 100µl를 가하여 4°C에서 1시간 동안 보관한 후 증류수로 5회 세척하여 TCA를 제거하고 실 온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1% (v/v) acetic acid에 녹인 0.4% (w/v) SRB용액을 100µl씩 첨가하여 상온에서 30 분 동안 염색시켰다. 결합되지 않은 SRB 염색액은 1%의 농 도로 조절한 acetic acid로 4 ~ 5회 정도 세척, 건조 시킨 후 에 10 mM Tris buffer 100µl를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 microplate reader (Molecular Devices, Thermo max, USA)를 이용하여 540㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다 (Kim et al., 2007).

6. 면역세포 생육 증진 효과 분석

면역기능의 증강 효과는 인간 유래 면역 세포인 T cell (H₉, ATTC, USA)과 B cell (Raji, ATTC, USA)을 이용하여 검증하였다. 세포의 생육은 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 5% CO₂, 37°C에서 배양하였으며, MTT assay 를 이용하여 면역세포의 증식율을 측정하였다. 생육 증진 효 과 실험은 6-well plate에 세포를 1.0 × 10⁴ cells/ml의 농도로 조절한 후 각 공정별 시료를 주입하여 7일 동안 배양하면서 각 well의 cell을 Hematocytometer로 세포 수를 측정하여 생 육도를 측정하는 방법을 사용하였다 (Park et al., 2004).

7. Cytokine 분비량 측정

Cytokine은 IL-6와 TNF-α의 정량을 Chemicon (USA)사의 IL-6와 TNF-α 정량 kit를 사용하여 측정하였다. 세포의 농도 를 1.0 × 10⁴ cells/ml의 농도로 조절한 후 24-well plate에 900µl씩 첨가하여 24시간 동안 배양 (37°C, 5% CO₂) 시킨 후 각 공정별 시료의 최종농도를 0.5mg/ml로 100µl씩 첨가 하여 다시 5일 동안 배양 (37°C, 5% CO₂) 하였다. 원심분리 기(Combi-514R, Hanil, Korea)를 이용하여 배양배지의 상층액 을 취한 다음 450㎚에서 microplate reader (Molecular Devices, Thermo max, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하여 얻어진 O.D. 값을 작성한 표준곡선과 비교하여 cytokine의 양 을 측정하였다 (Cho et al., 1998).

8. 대식세포에서의 Nitric Oxide (NO) 생성능 측정

각 공정별 시료에 대식세포에 의한 Nitric Oxide (NO) 생 성능을 확인하기 위해 사용된 세포주는 J774.1 macrophage (ATTC, USA)이며, 세포는 10% heat-inactivated bovin serum과 RPMI 1640 medium을 이용하여 24-well plate 에 4.0 × 10⁴ cell/ml의 농도로 넣은 다음 시료를 첨가하거나 첨가하지 않고 48시간 동안 배양 (37°C 5% CO₂)하여 실험에 사용하였다. 먼저 각 공정별로 얻은 샘플을 처리하고 48시간 동안 세포를 배양한 뒤 상등액 50µl를 취하여 동일 부피의 Griess시약 (1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethlenediamine dihydrochloride, 2.5% H₃PO₄) 50µl을 첨가하여 실온에서 10 분간 배양시킨 후 ELISA reader (Molecular Devices, USA) 를 이용하여 540㎚의 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 표준물 질로는 sodium nitrite를 사용하였으며 농도는 32 µM에서부터 0.25 µM까지 RPMI 1640 medium으로 2배씩 희석하여 얻는 표준곡선과 비교하여 계산하였다. NO 생성능의 양성 대조군 물질로는 E. coli 유래 lipopolysaccharide (LPS, Sigma, USA)를 사용하였다. macrophage에서 발생되는 nitric oxide의 양은 활성화된 대식세포 배양액에 축적되어 있는 nitric의 양 을 microplate assay를 이용하여 정량함으로서 측정하였다 (Choi et al., 2013).

9. 통계처리

모든 데이터의 통계처리는 3회 반복 실험으로 이루어졌으 며, 실험값의 통계는 SAS (Statistical Analysis System) 프로 그램의 student t-test를 통해 평균 값을 구한 뒤, 처리구간의 최소유의수준의 차 (p < 0.05)로 통계처리 하였다.

1. 총 페놀 함량 측정

각 공정별 더덕 추출물의 총 페놀 함량을 측정한 결과를 Table 1에 나타내었다. 각 공정별 더덕 추출물들 중 총 페놀 함량은 증숙 더덕 추출물에서 8.736µg/mg로 가장 높은 함량 을 나타내었고, 뒤이어 초고압 처리 증숙 더덕 추출물에서 8.597µg/mg의 함량을 나타내었다. 이는 더덕의 페놀성 물질이 증숙 공정을 통해 용출이 증진된 것으로 보이며, 이러한 페놀 성 화합물은 가용성 식물류에 널리 분포하는 것으로 항산화능 을 포함한 다양한 생물학적 효능을 나타내고, 이들의 효능은 주로 산화 환원력에 의한 것이라고 밝혀짐을 알 수 있다 (Osawa, 1994; Ling et al., 2011). 위의 결과가 이전 연구를 바탕으로 페놀성 화합물을 함유하고 있는 더덕 추출물은 항산 화 효능을 가진다고 사료되며, 더 나아가 증숙 가공 공정을 거친 더덕은 높은 폴리페놀의 함량을 가짐으로써 활성 증진에 큰 영향을 미친다고 사료된다.

2. 정상세포에 대한 세포독성 측정

정상세포 HEK293 세포에 각 공정 처리한 더덕 추출물을 0.2 ~ 1.0mg/ml까지 다섯 가지 농도로 처리하고 48시간 동안 배양한 후, MTT assay로 측정한 세포 독성을 Fig. 1에 나타 내었다. 그림과 같이 각 추출 조건에 따른 추출물 모두 농도 의존적으로 세포 독성이 증가하는 모습을 확인 할 수 있으며, 특히 일반 더덕 추출물의 경우 최대 농도인 1.0mg/ml에서 18.12%의 가장 높은 세포 독성을 나타냈으며, 초고압 및 증숙 가공 처리 더덕 추출물의 경우 최대 농도인 1.0mg/ml에서 각 각 16.89%, 16.04%로써 낮은 세포독성을 보였다. 이와 같이 공정별 더덕 시료 모두 최고 농도에서 19% 이하로, 세포수준 에서 유의할만한 세포독성을 나타내지 않아, 기능성 식품 및 향장 원료로써 이용 가능성을 확인하였다.

3. 면역세포 생육 증진 효과 분석

이전의 선행 연구에서 더덕의 항산화활성 탐색 연구결과 더 덕 추출물에 다량의 항산화물질이 함유되어 있는 것으로 밝혀 졌으며, 이것으로 본 연구에서는 더덕 내의 항산화 물질과 면 역 활성간의 관계를 검증하기 위해 본 실험을 진행하였다.

각 공정별 더덕 추출물의 면역증진 효과의 확인을 위해 인 간 면역체계에 중요한 역할을 하는 T cell과 B cell을 이용하 였다. 생육증진 효과를 측정하기 위해 SRB assay를 이용하 여 각 공정별 추출물 시료의 농도를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0mg/ml로 조절하여 첨가한 후 생육 증진 효과를 측정하여 각각 Fig. 2에 나타내었다. 모든 추출물에서 생육이 농도 의존 적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중 증숙 공정 추출을 통한 추출물이 최고 농도인 1.0mg/ml에서 T cell과 B cell 각각 151.12%와 134.35%로 가장 높은 생육 증진 효과를 보여주었다.

Fig. 3은 위의 농도별 시료 첨가에 의한 면역세포 생육 실 험의 유의성을 감안하여 0.5mg/ml의 농도의 시료를 첨가 후 T cell과 B cell의 생육을 7일 동안 배양 날짜별로 측정한 결 과이다. 시간경과에 따른 T cell과 B cell의 생육곡선을 보면 시료첨가 시점을 기준으로 5일 내지 6일째 최고 생육도를 나 타내었다. 증숙 가공 추출물은 최고 생육도를 나타낸 6일째에 180 × 10⁴ cells/ml, 일반 더덕 추출을 시행한 추출물에 비교하 였을 때 각각 1.89배, 1.21배의 생육증진을 보인 것을 확인하 였다. 이는 배양시간에 따른 T세포의 cytokine (IL-6, TNF-α) 분비 경향과 유사한 결과로 증숙 공정을 통한 더덕의 추출물 첨가를 통해 인간 면역세포의 생육이 증진되고 이를 통해 면 역세포로부터 분비되는 cytokine의 분비량도 증가된 것으로 사 료된다.

4. Cytokine 분비량 측정

Fig. 3는 인간면역 세포의 생육 증강도를 뒷받침할 수 있는 자료로서 면역 세포들이 분비하는 cytokine (IL-6와 TNF-α)의 분비량을 T cell에서 측정한 결과를 나타낸 것이다. 각 시료 첨가에 따른 cytokine 분비량은 면역세포 생육도와 유의적인 값을 나타내었다. 각 시료에 대한 T cell에서 IL-6와 TNF-α 의 분비량을 살펴보면, 일반 더덕 추출물과 초고압 더덕 추출 물이 5일째 각각 6.3 × 10⁻⁴ pg/cell과 6.8 × 10⁻⁴ pg/cell을 나타 내었고, 증숙 더덕과 초고압 증숙 더덕은 5일 혹은 6일째 각 각 8.6 × 10⁻⁴ pg/cell과 8.9 × 10⁻⁴ pg/cell을 나타내며 일반 더 덕 추출물과 비교하여 많은 cytokine 분비량을 나타내었다. 생 육도와 cytokine 분비량 측정을 통한 대부분의 조건에서 증숙 더덕 추출물 첨가를 통해 높은 활성을 나타내었으며, 증숙 공 정을 통한 추출물의 높은 활성을 확인 할 수 있었다. 이것은 더덕의 일반적 추출 공정으로는 용출이 힘들었던 성분들이 증 숙 가공 공정을 통해 용출이 가능해지거나 또는 용출이 증가 됨으로써 면역 활성에 영향을 준 것이라 사료되며, 이를 통해 더덕이 면역 활성과 관련하여 기능성 식품으로써 활용에 가능 성이 있다고 사료된다.

5. 대식세포에서의 Nitric Oxide (NO) 생성능 측정

대식세포를 이용하여 NO 생성능을 측정한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 대식세포의 NOS (Nitric Oxide Synthase)는 항상 존재하는 것이 아니라 TNF-γ, TNF-α와 같은 여러 가지 cytokine과 LPS (E. coli derived lipopoly-saccharide)와 같은 세균 내 독소의 영향을 받아 NOS 유전자의 발현이 유도되기 때문에 시료를 LPS와 같이 투여하여 NO의 생성능을 확인하 였다. 결과를 통해 대식세포의 NO 생성은 LPS 첨가를 통해 촉진됨을 알 수 있다.

더덕 시료와 LPS를 동시에 처리한 결과를 통해 더덕 추출 물 첨가를 통해 LPS 투여시 NO의 생성량이 증가한 것은 더 덕 추출물이 NO 생성을 통한 면역체계에 활성 증진 효과를 나타냄을 확인할 수 있는 결과이다. (Kim et al., 2012)이는 세포독성이 거의 없는 적정량의 더덕 추출물의 투여가 대식세 포를 활성화하는데 기여하며, 그 활성 정도가 LPS의 병적인 염증자극에 의해 적으므로, 더덕이 면역력과 염증반응을 항상 성을 유지하는 범위에서 NO를 상승적으로 조절할 수 있는 것 으로 사료된다. 결과를 통해 더덕의 모든 추출물이 이러한 면 역 활성 증진 효과를 나타내었음을 확인할 수 있었으며, 그 중 증숙 초고압 더덕 추출물의 NO 생성량이 13.8 M로 가장 높은 값을 보였다. 실험에서 보여준 NO 증가량를 보면, 이는 더덕에 의한 면역 및 염증반응 조절에서 보여준 더덕추출물의 투여에 의해 10.6%에서 11.4%까지 증가된 NO 생성량에 비 교하였을 때 높은 증가량을 보여 주는 것으로 증숙 더덕이 높 은 면역증강 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.