추출 방법에 따른 강황 잎 추출물의 향장 활성 비교

1. 실험재료 및 시약

본 실험에 사용한 강황 (Curcuma longa L.)은 전북지역에 자생하고 있는 것을 2011년 9월 중 잎 부분만 채취하였으며, 실험실로 옮겨 각각 열풍건조, 동결건조, 감압건조시켰다. 열 풍건조 강황 잎의 경우 열풍건조기 (CF-21WF, JEIOTECH, Daejeon, Korea)로 5 m/h의 유속으로 공기순환하여, 70 ~ 80°C 의 온도를 유지시키며 8시간동안 건조시켰으며, 동결건조 강황 잎의 경우 동결건조기 (PVTFD 100R, ILSHINLAB, Yangju, Korea)를 이용하여 진공도 10mm Torr, −70°C 조건에 서 72시간 동안 동결건조하였고, 감압건조 강황 잎의 경우 감 압건조기 (VS-1202V5, Vision Scientific, Bucheon, Korea)로 800 hPa로 60°C에서 감압 건조하여 사용하였다. 건조수율은 건 조 전 시료에 대한 건조 후 무게백분율로 계산하였다.

본 연구의 세포배양 시 필요한 배지로 RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였고, 그 밖에 배양에 필요한 시 약으로 hepes buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA), gentamycin sulfate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.

2. 시료 추출 조건

Ethyl alcohol과 물을 추출 용매로 사용하였으며, ethyl alcohol의 경우 70°C, 물에 경우 100°C에서 24시간 추출하였다. 얻어진 각각의 추출물들을 감압농축장치 (Rotary Vacuum Evaporator N-N series, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축을 하 였고, 동결건조를 한 후 분말로 제조하여 실험에 사용하였다.

3. 세포주 및 세포 생육 배지

실험에 이용된 세포주로 Clone M-3 (Cloudman S91 melanoma, mouse, KCLB 10053.1, Seoul, Korea)를 사용하 였으며, 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였고 그 밖의 세포 배양에 필요 한 시약으로 hepes buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA), gentamycin sulfate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용 하였다. 실험에 사용된 세포는 RPMI 1640배지 90%에 FBS 를 10%로 적용시켜 배양하여 실험에 이용하였다.

4. 세포 독성 측정

3-(4,5-dimethythiazo-2-yl)-2,5-dipheny-tetrazoliumbromide (MTT)를 이용한 Mosmann방법 (Mosmann, 1983)을 달리하여 세포의 독성을 측정하였다. 먼저 CCD-986sk 세포를 96 well plate에 각 well당 1.5 × 10⁴cells/well 농도로 접종한 후, 세 포가 well에 약 80% 정도 배양되었을 때 시료를 주입하고 CO₂incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간을 배양한 뒤 5µg/ml 농도의 MTT 용액을 각 well에 첨가하고 4시간 동안 반응시킨 뒤 상층액을 제거하고, acid-isopropanol (0.04 N HCl in isopropanol)을 각 well에 10 µl 씩 첨가한 후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 565nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

5. Tyrosinase 억제활성 측정

Tyrosinase 억제활성 실험은 기초 향장 활성 실험 중 하 나로 피부내의 미백 효과를 측정하는 실험으로서 실험은 dopachrome방법 (Pomerantz, 1963)을 이용하여 측정하였다. mushroom tyrosinase (150 unit) 150 µl , 2.5 mM 농도의 Ltyrosine 225 µl , 0.4 M hepes buffer (6.8) 225 µl , 그리고 300 µl 의 ethanol 용액 혹은 시료 (1mg/ml)용액을 섞은 후 배 양 전과 15분간 배양을 한 후 475nm에서 흡광도를 각각 측 정하였다.

Tyrosinase 억제율은 아래와 같이 계산하였다.

Tyrosinase inhibition (%) = C-D-A-BC-D×100

A는 시료를 가지는 용액의 배양 후의 흡광도이며, B는 시료 를 가지는 용액의 배양 전의 흡광도, C는 시료를 가지지 않는 용액의 배양 전의 흡광도, D는 시료를 가지지 않는 용약의 배 양 후의 흡광도이다.

6. Clone M-3 세포로부터 Melanin 생성 저해율 측정

쥐에서 유래한 Clone M-3 세포는 melanin을 생성하는 melanocyte다. Melanin은 표피 기저층의 melanocyte의 소기관 인 melanosome에서 생합성되며 가시광선 영역대 파장의 흡광 도를 측정함으로써 생성량을 비교한다 (Lim et al., 2006). Clone M-3 세포를 96 well plate에 접종을 한 후 3일동안 시료를 처리하고 배지를 제거한다. 그 후 각 well을 PBS로 세척하고, 1 N NaOH 1ml을 첨가한 뒤 교반하여 Clone M- 3 세포의 세포막을 융해함으로써 melanin을 용출되게 하여, 400nm에서 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교하였다.

7. Hyaluronidase 활성 저해 효과 측정

Hyaluronidase 활성 저해 효과는 0.1 M acetate buffer (pH 3.5)를 용매로 한 hyaluronidase (7900 unit/ml) 50 µl 에 시료를 농도 0.2, 0.6, 1.0 mg/ml가 되도록 20µl 씩 첨가하 였다. 효소의 활성을 위해 12.5 mM 농도의 CaCl₂ 200 µl 를 혼합한 후 37°C water-bath에 20분간 배양시켰다. 대조군은 DMSO 용액을 넣고 water-bath에 20분간 배양하였다. 활성화 된 hyaluronidase 용액에 0.1 M acetate buffer (pH 3.5)에 녹 인 hyaluronic acid from rooster comb (12mg/5ml) 250 µl 를 첨가하여 다시 water-bath에 40분간 배양하였다. 배양 후 0.4 N NaOH용액 100 µl 와 0.4 M potassium tetraborate 100 µl를 반응 혼합물에 첨가하여 끓는 수조에서 3분간 배양시킨 후 냉각시켰다. 반응물에 dimethyl aminobenzaldehyde 용액 (p-dimethyl amino-benzaldehyde 4 g, 100% acetic acid 350ml, 및 10 HCl 50ml 혼합액) 3.28ml를 반응 혼합물에 첨가하고 37°C water-bath에서 20분간 배양한 후 585nm에서 흡광도를 측정하였다. 저해율은 다음과 같이 계산하였다.

Hyaluronidase Inhibition (%) = ODC-ODSODC×100

(ODc: Optical density of control, ODs: Optical density of samples)

8. Scanning Electron Microscope (SEM)을 통한 강황 잎 조직 관찰

각 건조과정을 거친 강황 잎의 조직 관찰을 위하여 저진공 주사현미경 (Low Vacuum-Scanning Electron × 400)으로 관찰 하였다. Scanning Electron Microscope (SEM)은 금, 백금 등 을 이용하여 입자를 3 ~ 4mm 정도 얇게 증착하는 전처리 과정 을 거친 후, 강황 잎의 조직형태를 관찰하였다.

9. 통계처리

데이터의 통계처리는 각 시료를 3회 반복으로 행해졌으며, 실험값의 통계는 SAS (Statistical Analysis System) 프로그램 을 사용하여 two-way ANOVA방법으로 처리하였으며, 실험 값은 평균 ±표준오차 (Mean ± Standard Error)로 표시한 뒤, 처리구간의 최소 유의 수준의 차 (p < 0.05)로 통계처리 하 였다.

1. 수율

강황 (Curcuma longa L.)의 건조 및 추출 수율은 Table 1 에 나타내었다. 강황 생잎에 대한 각 건조방법 별 건조수율을 측정한 결과 감압 건조시킨 강황 잎의 건조수율이 약 19.4% 로 가장 높았으며, 동결 건조시킨 강황 잎의 건조수율이 18.8%, 열풍건조 된 강황 잎의 수율이 17.8%로서 가장 낮은 것으로 관찰되었으나 건조방법 간에 유의적인 차이는 보이지 않았다. 그러나 건조 후 추출과정을 거쳐 얻은 강황 잎 추출 물의 추출 수율에 대하여 비교한 결과, 건조 방법 중 감압 건 조시킨 강황 잎의 추출 수율이 열수 추출의 경우 26.5%, 에 탄올 추출의 경우 29.4%로 가장 높았으며, 동결 건조시킨 강 황 잎의 경우 열수 추출의 수율이 25%, 에탄올 추출의 수율 이 29.2%로 감압건조 강황 잎 보다 근소하게 수율이 낮았고, 열풍 건조시킨 강황 잎의 경우 열수 추출이 22%, 에탄올 추 출이 25.3%로 가장 낮았다. 추출 용매를 기준으로 비교했을 때에는 물을 용매로 하여 추출한 추출물보다 에탄올을 용매로 하여 추출한 추출물의 수율이 높은 것으로 측정되었다. 건조 방법과 추출용매를 종합적으로 비교 관찰하였을 때 감압 건조 하여 에탄올 추출과정을 거친 강황 추출물의 수율이 가장 높 았다. 이 결과로 보아, 건조수율의 경우에는 수분함량의 차이 에 의하여 측정된 수율이기 때문에 추출수율에 비하여 눈에 띄는 차이를 보이지 않는 것이라 사료되며, 건조된 강황 잎을 추출했을 때 건조 방법별로 큰 차이를 보이는 것은 건조과정 중 온도에 따른 유효물질의 손실에 의한 것으로 보여진다 (Nam, 2005). 이에 보다 정확한 활성차이를 확인하고, 기능성 소재로서의 이용 가능성을 확인하고자 세포 독성 및 향장실험 을 진행하였다.

2. 세포 독성 측정

건조과정을 거친 강황 잎 추출물을 human fibroblast CCD-986sk에 투여해, 세포생존율을 측정하여 향장 및 기능성 소재 로서의 사용이 적합한지에 대해 검토하였다. 실험결과, 각 시 료의 농도별 세포 독성은 농도 의존적으로 증가하였으며, 최 대 25%를 넘지 않았다 (Fig. 1). 각각의 시료 세포독성을 살 펴보면 생잎의 경우 모든 농도에서 세포독성이 가장 높게 나 타내었으며, 그 중 감압 건조과정을 거친 강황 잎 추출물에 대한 세포독성이 모든 농도에서 20%를 넘지 않았다.

각 건조방법을 거친 강황 잎 추출물 모두 일반 강황 생잎 추출물의 세포독성보다 낮은 세포독성을 나타내었으며, 그 중 감압 건조를 거친 강황 잎 추출물이 가장 낮은 세포독성을 가 지는 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과로, 강황 잎은 건조과 정을 거치게 되어도 독성물질이 생성되지 않는 것으로 확인되 었고, 이것으로 건조된 강황 잎의 향장소재로서의 사용이 가 능할 것으로 사료된다.

3. Tyrosinase 억제활성 측정

Tyrosinase는 피부의 멜라닌 색소를 생성하는 효소로 tyrosinase의 저해활성을 측정함으로써 추출물의 미백효과를 알 아 볼 수 있다. 건조방법별 강황 잎 추출물의 농도를 각각 달 리하여 tyrosinase의 저해 활성을 Fig. 2에 나타내었다. 실험 결과를 보면 모든 추출물에서 추출물의 농도가 증가함에 따라 tyrosinase의 저해 활성도 증가하는 경향을 보였으며, 그 중 동 결 건조 및 감압 건조과정을 거친 에탄올 추출물이 모든 조건 의 농도에서 가장 높은 저해 활성을 나타냈다.

멜라닌 색소를 생성하는 효소인 tyrosinase의 활성이 적을수 록 좋은 미백효과를 가진다고 볼 수 있으므로 저온에서 건조 시킨 강황 잎 추출물이 상대적으로 미백효능이 우수한 것으로 추측 할 수 있다.

4. Clone M-3 세포로부터 Melanin 생성 저해율 측정

건조방법 및 추출 용매 별 강황 잎 추출물이 Clone M-3 세포주로부터 melanin 생성량에 미치는 영향을 알아보기 위해 서 추출물들의 농도를 각각 0.2, 0.6, 1.0mg/ml의 농도로 처리 하여 멜라닌 생성 저해율을 측정하였다.

Fig. 3에서 볼 수 있듯이 강황 잎 추출물은 1.0mg/ml의 농 도에서 모든 실험군이 가장 높은 멜라닌 생성 저해율을 보였 으며, 건조방법과는 상관없이 에탄올 추출물이 열수 추출물보 다 높은 활성을 보였다. 증숙 및 초고압 증숙 공정을 통한 더 덕의 향장활성 증진에 관한 논문에서 살펴보면 (Kim et al., 2013) 초고압 증숙 더덕 추출물의 멜라닌 생성 저해율은 1.0mg/ml의 농도에서 약 25 ~ 30%로 같은 농도의 에탄올 감 압건조 강황 잎 추출물과 거의 비슷한 활성을 보여, 강황의 뿌리가 아닌 잎도 충분히 미백소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

이것으로 보아 추출 공정 시 강황 잎에 함유되어 있는 항산 화 및 미백효과에 우수한 curcumin (Jayaprakasha et al., 2005)이 멜라닌 생성 억제 물질로 사료되는 바이며, 또한 강 황 지상부의 항산화 성분 (Ahn et al., 2012)에 대한 연구에 서 살펴보면 기타 항산화 물질들에 의해 멜라닌 생성 억제에 도움될 것을 보이며, 이들의 손상을 줄일 수 있는 구체적인 감압건조 조건이 확립된다면 멜라닌 생합성 억제제로서 기능 성 화장품의 미백제로도 쓰일 수 있는 가능성을 가질 수 있다 고 사료된다.

5. Hyaluronidase 활성 저해 효과 측정

피부 미백 효과와 함께 향장활성의 중요한 요소 중 하나인 피부보호 효과를 알아보기 위하여 hyaluronidase 억제활성을 확인하였다. Hyaluronidase는 피부 보습 및 탄력 유지에 기여 하는 hyaluronic acid의 분해효소로 피부면역에 관련된 것으로 알려져 있다. 따라서 hyaluronidase 억제 활성을 측정하여 Table 2에 나타내었다. 결과를 통해 모든 시료 조건에서 hyaluronidase 억제활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 최소 18%에서 최대 43%까지 저해 효과는 나타내는 것을 알 수 있었다. 건조 방법 별로는 열풍 건조 강황 잎 추출물이 동 결건조 추출물과 감압 건조 추출물에 비하여 비교적 낮은 활 성을 나타내었으며, 감압 건조 추출물에 경우 동결 건조 추출 물에 비해 미미하게나마 높은 것을 확인할 수 있었다. 이것 으로 보아 가공 공정 시 강황 잎에 함유되어 있는 항염증 및 항균작용이 뛰어난 curcumin 성분 (Jayaprakasha et al., 2005) 및 항산화물질 (Ahn et al., 2012)에 대한 강황 잎의 피부면역 활성이 있는 것으로 보이며, 이는 향장소재로서 적 합함으로 사료된다.

6. Scanning Electron Microscope (SEM)을 통한 강황 잎 조직 관찰

여러 건조방법에 의한 강황 잎 조직의 형태적 변화를 관 찰하기 위하여 저진공 주사전자현미경 (SEM, Scanning Electron Microscope)을 이용하여 강황 잎 시료의 표면을 확대 하여 관찰하였다 (Fig. 4). (a)는 아무런 건조과정을 거치지 않 은 강황 잎의 표면으로 손상이 없는 것을 확인할 수 있으며, 다른 건조과정을 거친 강황 잎의 조직과 비교하기 위하여 촬 영하였다. 열풍건조 과정을 거친 (b)는 강황 잎 조직이 손상 및 변형 되어 (a)와 비교하여 확연한 차이를 확인할 수 있 었다. 그러나 저온에서 진행된 감압 건조와 동결건조를 거친 (c)와 (d)의 경우 (a)와 비교하여 약간의 변화가 있으나, (b)와 같은 손상이나 변형의 흔적은 현저히 적게 나타난 것을 알 수 있었다. 이와 같이 열풍건조를 시킨 강황 잎의 경우 유용물질 의 수득을 위한 추출과정도 거치기 전에 높은 온도에 의하여 유용물질의 파괴가 이루어질 것으로 보이며, 동결건조 및 감 압건조와 같은 저온건조를 이용하여 열풍건조 과정에서 고온 에 의해 일어난 유용물질의 손실을 저감시킬 수 있을 것이라 사료된다 (Nam, 2005).