미선나무의 저온 추출 공정에 의한 항주름 활성 증진

1. 시료 제조

실험에 사용한 미선나무 잎, 줄기는 국내 자생지인 충청북 도 괴산군에서 구입하였다. 미선나무는 3일 간 충분히 말려 건 조 된 상태의 미선나무 지상부 (잎과 줄기)를 길이 약 3㎝로 잘라 추출 하였다. 열수 추출은 미선나무 잎, 줄기를 증류수에 서 100°C 조건으로 24시간 추출하였으며, 70% 에탄올 추출은 80°C에서 24시간 추출하였다. 초음파 70% 에탄올 추출은 140 khz의 초음파 (AUG-R3-900, ASIA ULTRASONIC, Korea) 조건에서 1시간 전 처리 후 60°C에서 12시간 추출하 였다. 모든 추출물은 전부 환류 추출로 실시하였다. 추출한 액 상은 감압여과기 필터를 이용하여 여과하고, 여과액을 회전감 압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 충분히 농축하였다. 농축 후 동결건조기 (PVTFA 10AT, ILSHINBioBase, Dongducheon, Korea)에 3일 간 건 조하여 파우더 된 샘플을 실험에 사용하였다.

2. 세포 및 시약

인간피부섬유아세포 CCD-986sk는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 구입한 세포를 유동적으로 첨가량을 조절한 fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)이 포함 된 DMEM 배지에 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 그 외 사용된 모든 시약들은 Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)을 통하여 구입, 사용하였다.

3. Elastase 저해 활성 실험

Elastase 효소 저해활성 실험은 Kim 등(2011)의 선행연구를 참고하여, 실험을 진행하였다. pH 8.0의 0.13 M Tris-Cl buffer 를 용매로 하여, N-succinyl-(Ala)₃-p-nitroanilide를 1.0 mM의 농도로 한 용액 950μl와 미선나무 추출물 및 양성대조군 ursolic acid를 각 농도별로 50μl를 첨가하여 상온에서 20분 동안 방치하였다. 20분 후 elastase 효소 용액 50μl를 추가 주입한 뒤 상온에서 다시 20분 동안 방치하였다. 20분 뒤 반 응을 종료하고 410nm 파장에서 흡광도를 측정하여 저해 활성 도를 평가하였다.

4. 세포 독성 평가

미선나무 추출물의 세포생존율을 확인하고자 MTT assay를 사용하였다. 피부섬유아세포 CCD-986sk를 사용하였고, 1.5 × 10⁵ cells/ml 농도로 96-well plate에 주입한 뒤 부착할 때 까지 incubator에서 배양하였다. 부착 후 배지를 제거하고 미선나무 추출물을 농도별로 200μl씩 주입하여, 24시간 동안 배양하 였다. 24시간 배양한 뒤 추출물을 제거하고, 200μg/ml 농도의 MTT 용액을 150μl만큼 주입하여 37°C에서 빛을 차단한 채 다시 3시간 동안 배양 한 후, MTT 용액을 제거하였다. PBS 로 세척 후 DMSO를 200μl 주입하고 30분 간 반응하여 microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 570nm에서 흡광도를 측정한 후 무처리군을 100%로 하여 미선나무 추출물의 세포 생존율을 확인하였다.

5. MMP-1 생성량 측정

피부섬유아세포 CCD-986sk 세포를 96-well plate에 2.0 × 10⁵ cell/ml 만큼 각 well에 분주하여, 세포가 충분히 부 착되도록 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 다음 배지를 제거하고, 농도 별 미선나무 추출물을 처리한 뒤 에 다시 48시간 동안 배양하였다. 배양액을 준비된 MMP-1 키트 Human MMP-1 ELISA Kit (RayBiotech, Norcross, GA, USA)에 있는 plate에 옮겨 처리한 샘플을 100μl 만큼 주입하여 상온에서 2시간 배양하였다. 2시간 후 처리한 샘플 을 제거하고 kit에 준비 된 wash buffer를 이용하여 4회 세척 한 뒤 detection antibody MMP-1을 100μl 주입하여 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 1시간 뒤 다시 wash buffer로 4회 세척하고, streptavidin solution을 처리하여 45분 간 상온에서 shaking해준다. 용액 제거 후 한 번 더 wash buffer로 세척하 고 substrate reagent를 넣어 30분 동안 빛을 차단하여 실온에 방치하였다. 30분 뒤 50μl stop solution 넣어 반응을 종결시 키고 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였고 양성대조군은 retinoic acid를 사용하였으며, 표준품을 이용한 정량곡선을 통 해 각 샘플별 MMP-1의 생성량을 확인하였다.

6. Collagen 생성량 측정

Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA Kit (Takara, Otsu, Japan)을 이용 하여 collagen 생성량을 측정하였다. 피부 섬유아세포 CCD-986sk를 1.5 × 10⁵으로 96-well plate에 분주 하여 24시간 배양하였다. 24시간 뒤 각 미선나무 추출물 샘플 처리를 한 뒤에 다시 2일 동안 배양하였다. 배양액을 kit에 준 비 된 plate에 양성대조군 retinoic acid 및 미선나무 추출물 배양액을 총 20μl가 되게 농도를 달리하여 첨가하고 빛을 차 단한 채 37°C에서 3시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 wash buffer로 4회 반복 세척하고 난 후 substrate solution 을 각 well에 넣어 15분 동안 방치하였다. 15분 뒤에 stop solution으로 사용하는 1 N H₂SO₄을 각 well에 100μl을 넣 고, 1분 동안 흔들어 준다. 반응을 종결하여, microplate reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준품을 통해 정량하였다.

7. DPPH 자유 라디칼 활성 시험

미선나무의 항산화능 측정을 위하여, DPPH (α,α-diphenyl- β-picrylhydrazyl) 자유 라디칼 활성평가를 실시하였다. 각 추 출물을 농도별로 150μl을 첨가 후 에탄올로 제조한 0.1 mM DPPH용액 150μl을 혼합하여, 30분 동안 빛을 차단하여 실 온에서 반응하였다. 30분 후 517nm의 파장에서 흡광도 측정 하였다. 항산화 효능의 확인은 흡광도가 50% 감소할 때 나타 나는 자유 라디칼 소거활성 IC₅₀으로 확인하였다.

8. HPLC 측정

미선나무 추출물의 지표 성분의 농도를 비교하기 위해 측정 시료의 농도를 각각 1000 ppm로 설정하여 측정하였으며, 분석 장비로는 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC, Aglient 1260 series, Aglient Technologies, Santa clara, USA)를 이용하였고,칼럼은 Jupiter 5u C₁₈ 3000A (250 × 4.6mm, Phenomenex, Seoul, Korea)을 사용하였다. 지표 물질로는 coumaric acid (Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 ppm으로 사용 하였다. 이동상 용매의 조건은 기존의 연구를 참고 및 일부 변형하여, (A) H₂O (1% acetic acid), (B) acetonitrile : methanol : 2% acetic acid (2 : 2.5 : 1)하였을 때, 0분에서 11분 까지 (A) 100%로 하고, 11분에서 40분까지 (A) 85%, (B) 15%, 40분에서 60분까지 (A) 65%, (B) 35% 로 하였다 (Coruh and and zdogan, 2015). 기기에 투입되는 시료의 양은 20μl로 하고 유속은 1ml/min으로 하였으며, 280nm 파장에서 측정하여 실험을 진행하였으며 지표 물질의 peak 면적을 기준으로 각 추출물 내 존재하는 지표 성분의 농도를 계산했다.

9. 통계처리

모든 실험의 데이터 통계처리는 3회 반복하였으며, 실험값 의 통계는 SAS (Statistical Analysis System 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)프로그램을 통하여 two-way ANOVA법으로 처리하였다. 처리구간의 최소 유의 수준의 차 는 p < 0.05로 처리 하였다.

1. 세포 생존율 확인

피부섬유아세포를 이용하여 미선나무추출물의 세포 생존율 을 확인하였다 (Table 1

Table 1.

Comparison of cell viability by extraction processes in Abeliophyllum distichum Nakai.

2. Elastase 저해 활성 평가

미선나무 추출물의 주름개선에 대한 효과를 확인하기 위하 여 elastase 효소 저해 활성 평가를 진행하였으며, 결과는 Fig. 1에 표시하였다. 열수 추출물은 0.3mg/ml의 농도에서 12.80% 로 낮은 활성 값을 보였으며, 농도 의존적이지 못했다. 70% 에탄올 추출물은 최고 농도에서 22.01%로 열수 추출물에 비 해 높은 활성을 나타내었으며, 농도의존적으로 활성 값이 증 가하였다. 마찬가지로 초음파 전처리 샘플 또한 농도에 따라 활성 값이 증가하였으며, 0.3mg/ml에서 25.32%로 70% 에탄 올 추출물에 비해 값이 증가하였음을 확인할 수 있다. 양성대 조군으로 쓰인 ursolic acid는 51.16%의 elastase 저해율로 미 선나무 추출물에 비해 높은 수치를 보였으나, 주름개선효과에 대해 연구 보고한 오가피 열매의 elastase 저해 활성의 경우 비슷한 60% 에탄올 추출물에서 22.4%의 활성을 보여 (Jo and Cho, 2012), 비슷한 값을 보이는 미선나무 추출물 역시 주름개선효능이 있음을 알 수 있었다.

Fig. 1.

The inhibitory effect on elasatse activities by extraction processes in Abeliophyllum distichum Nakai.Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Means with the difference letter (A-C) within same sample are significantly different at p < 0.05 and means with the difference letter (a-c) within same concentration are significantly different at p < 0.05. WE; Water Extract, EE; 70% Ethanol Extract, UE; 70% Ethanol Extract with ultrasonic extraction.

3. MMP-1 생성량 확인

Collagen을 분해하는 효소 MMP-1의 생성량을 미선나무 추 출물을 처리하여 확인함으로서 미선나무 추출물의 주름개선 활성 정도를 확인하였다. Fig. 2을 보면, 모든 추출용매별 미 선나무 샘플에서 농도가 증가함에 따라 생성량이 감소하는 양 상을 보여 MMP-1 저해에 대한 활성을 확인하였다. 양성대조 군으로 쓰인 retinoic acid의 경우 113.6 pg/ml의 MMP-1생성량 을 보였으며, 미선나무 추출물은 앞의 실험결과와 마찬가지로 열수 추출물은 최대농도에서 MMP-1 생성량이 6640.8 pg/ml로 측정되었고, 70% 에탄올 추출물은 3240.6 pg/ml의 MMP-1 생 성량을 보여 70% 에탄올 추출물의 주름개선효능이 높게 측정 되었다. 초음파 전처리 샘플의 경우 70% 에탄올 추출물보다 MMP-1에 대한 저해활성이 높았으나, 차이는 오차 범위 내로 큰 차이는 없었다. 미선나무 추출물의 MMP-1 생성량은 주름 개선 효능에 대해 연구한 초음파 처리 아로니아 추출물과 비 교하였을 때, 아로니아 추출물은 미선나무 추출물과 동일 농 도 구간에서 6000~10000 pg/ml로 미선나무 추출물의 MMP-1 생성량이 낮아, 주름개선에 대한 효능을 확인 할 수 있었다 (Kim et al., 2014).

Fig. 2.

The inhibitory effect on MMP-1 production by extraction processes in Abeliophyllum distichum Nakai.ean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Means with the difference letter (A-C) within same sample are significantly different at p < 0.05 and means with the difference letter (a-b) within same concentration are significantly different at p < 0.05. WE; Water Extract, EE; 70% Ethanol Extract, UE; 70% Ethanol Extract with ultrasonic extraction

4. Collagen 생성량 확인

Collagenase인 MMP-1 생성량에 이어 추가적으로 collagen 생성량을 정량하여 Fig. 3에 확인하였다. 양성대조군인 retinoic acid의 collagen 생성량은 423.1 ng/ml로 확인되었다. 미선나무 의 경우 열수 추출물은 가장 높은 농도에서 최대 31.2 ng/ml의 생성량이 측정 되었고, 70% 에탄올 추출물이 150 ng/ml로 열 수 추출에 비해 월등히 높은 collagen 생성량을 나타내었다. 초음파 추출물은 70% 에탄올 보다 높은 collagen 생성량이 확인 되었으나, 이 역시 오차범위 내로 차이가 없었다. 양성대 조군에 비해 다소 낮은 수치가 확인 되었으나, 측정 된 미선 나무 추출물의 collagen 생성량은 기존에 항주름 효과에 대해 연구 보고 된 아로니아 추출물 및 포도와 오이즙액을 이용한 동충하초 균사체의 collagen 생성량과 비교하였을 때, 비슷한 농도에서 아로니아 및 동충하초 균사체의 생성량은 100 180 ng/ml로 비슷한 collagen 생성량이 확인되었다 (Kim et al., 2014; Lee et al., 2006). 이와 같은 결과는 미선나무 추 출물 역시 주름개선에 대해 다른 천연물 이상으로 효과가 있 음을 확인할 수 있다.

Fig. 3.

Comparison of collagen productions by extraction processes in Abeliophyllum distichum Nakai.Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Means with the difference letter (A-C) within same sample are significantly different at p < 0.05 and means with the difference letter (a-b) within same concentration are significantly different at p < 0.05. WE; Water Extract, EE; 70% Ethanol Extract, UE; 70% Ethanol Extract with ultrasonic extraction.

5. DPPH free radical scavenging activity

상기와 같은 미선나무의 주름개선 효능에 대한 결과를 기존 에 보고 된 항산화와 항주름의 관계를 검증하기 위하여, DPPH 자유 라디칼 소거활성에 대한 IC₅₀ 확인하였다. 열수 추출물의 IC₅₀값은 138.3μg/ml로 확인 되었고, 70% 에탄올 추출물의 경우 76.7μg/ml의 IC₅₀값이 확인 되었다. 열수 추출 물보다는 70% 에탄올 추출물에서 더 좋은 항산화 활성을 보 였으며, 초음파 전처리한 70% 에탄올 추출물의 경우 70.5μg/ml의 IC₅₀값이 측정 되어, 항산화 효능의 증진을 확인 할 수 있었다. 이전의 주름개선 관련 실험들과 비교해보면 라 디칼 소거능에 대한 효과가 높을수록 주름개선에 대한 활성정 도가 높은 것을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과는 주름개선 효과에 항산화가 연관이 있음을 시사하며, 서론에서 언급한 항 산화와 주름개선 관련 이전의 연구들의 주장을 뒷받침 할 수 있는 자료가 될 수 있다 (Pentland et al., 1995).Table 2

Table 2.

Comparison of DPPH free radical scavenging activities by extraction processes in Abeliophyllum distichum Nakai.

6. HPLC 측정

앞의 모든 결과들에서 초음파 추출물 (UE)이 다른 추출 공 정으로 얻어진 추출물들에 비해 높은 활성을 보이는 이유를 확인하기 위해, 각 추출물들을 HPLC로 측정한 결과를 Fig. 4 에 나타내었다. 미선나무에 존재하는 coumaric acid의 정량 결 과 열수 추출물의 경우 0.9mg/100 g로 측정되었으며, 70% 에 탄올 추출물에서는 12.6mg/100 g이 계산되어 물보다는 에탄올 용매에서 더 높은 용출량을 나타냈다. 이에 비해 초음파 공정 을 통해 얻어진 추출물의 경우, 지표 성분인 courmaric acid 의 농도가 16.3mg/100 g로 계산되어 통상적인 추출 공정인 70% 에탄올로 추출한 경우보다 60°C의 저온임에도 불구하고 30%에 가깝게 용출량이 증진되는 것이 확인되었다. 또한 기 존에 보고된 미선나무의 coumaric acid 함량인 8.1mg/100 g 보다도 (Yoo and Kim, 2001) 많은 양이 추출될 수 있다는 것이 입증되었다. 이로써 초음파 저온 추출 공정을 이용함으 로 목적하는 물질들의 용출량에 대한 획기적 증진과 함께, 고 온 추출 시 야기 될 수 있는 유용 성분들의 파괴 및 변성의 가능성이 줄어 초음파 추출물의 생리 활성이 높아진 결과의 설명이 가능하다. 또한 초음파로부터 발생되는 파장 진동에 의 한 높은 에너지에 따른 공동현상으로 천연물에 상대적으로 높 은 압력이 가해져 목적하는 유용 성분외에 기타 미량의 성분 들의 용출량도 같이 증가해 이들 성분들의 시너지 효과에 의 해 미선나무 초음파 추출물의 향장 활성 증진에도 기여했다고 유추할 수 있다 (Park et al., 2000).

기존에 항산화 효과에 대해 보고된 바 있는 coumaric acid 의 용출량이 초음파 추출 공정을 통해 획기적으로 증진된 결 과를 활성산소와 피부 주름 억제기능과의 연관성에 관한 보고 들과 비교하면, 본 실험에서 초음파 추출물의 주름 개선 활성 이 일관성 있게 증진된 결과들을 뒷받침하고 있다 (Pentland et al., 1995; Wee et al., 1989; Yoo and Kim, 2001; Lee, 2011). 이로써 본 미선나무의 향장 활성 실험 결과는 근래 대 량생산에 성공하여 다양한 분야에 활용 될 수 있는 미선나무 에 대해, 상대적으로 연구가 미흡한 주름 개선 활성을 확인하 였을 뿐만 아니라 (Kwon et al., 2014), 상기와 같은 연구의 결과는 천연 화장품 소재로서 미선나무의 상업화 가능성을 입 증하였고, 국내에서만 자생하는 미선나무의 특성을 살려 생산 기술의 발달로 점차 생산성이 증가하게 되면, 천연추출물의 생 리활성분야에서 경쟁력을 갖출 수 있을 것으로 사료 된다. 또 한, 미선나무를 이용한 화장품 소재 개발 뿐만 아니라 미선나 무를 이용하여 다른 생리 활성도 확인하여 미선나무자체의 가 치를 증대 시킬 수 있을 것으로 보인다.

Fig. 4.

HPLC chromatograms of the extracts of Abeliophyllum distichum Nakai obtained from different extraction processes.WE; Water Extract, EE; 70% Ethanol Extract, UE: 70% Ethanol Extract with ultrasonic extraction.