추출조건에 따른 배암차즈기 추출물의 지방세포 분화 및 지방축적 억제 효과
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Abstract
This study was carried out to investigate the effects of Salvia plebeia R. Br. ethanolic extract with different aspects (stem/leaf and whole plant) on differentiation and lipid accumulation in 3T3-L1 preadipocytes. The morphological changes and the degrees of lipid accumulation in 3T3-L1 cells were measured by Oil Red O staining and intra-cellular triglyceride (TG) assay. The mRNA expressions of special peroxisome proliferation activated receptor- genes (PPAR), CCAAT/ enhancer-binding protein (C/EBPα), fatty acid synthase (FAS) and lipoprotein lipase (LPL) were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). The 50% ethanolic extracts (100 µg/mL) of stem and leaf (SALE) and 30% ethanolic extracts (100 g/mL) of whole plant (SAE) from Salvia plebeia R. Br. were significantly attenuated lipid accumulation during adipogenesis in 3T3-L1 cells. Ethyl acetate-soluble fractions (50 µg/mL) significantly inhibited lipid droplet accumulation in 3T3-L1 cells. In addition, SALE induced down-regulation of specific adipogenic transcriptional factors (C/ EBPα and PPARγ) and target genes (FAS and LPL) during adipogenesis. Salvia plebeia R. Br. may be used as a safe and efficient natural substance to manage obesity.
Keywords:
Salvia plebeia, 3T3-L1, Adipogenesis, C/EBPα, PPARγ, FAS, LPL서 언
비만 (Obesity)은 에너지 섭취와 소비의 밸런스 조절기능의 이상으로 지방조직이 과다하게 축적되어 각종 질병의 이환율 과 사망률을 높이는 대사성 만성질환으로 지방 대사와 당 대 사에 불균형을 초래하여 고지혈증, 고혈압, 동맥경화, 당뇨병, 지방간, 관절 이상 등 각종 대사성 질환, 심혈관계 질환 및 암을 유발하는 직접적인 상관관계를 보이는 것으로 밝혀져 그 심각성이 세계적으로 대두되고 있다 (Leung et al., 2003). 세 계보건기구 (WHO)의 보고에 따르면, 2008년 20세 이상 성인 중 5억 명이 비만으로, 세계 성인 인구의 11%에 달하는 숫자 이며, 2015년에는 15억 명으로 증가할 것이라 예측된 바 있다 (World Health Organization, 2013).
비만은 지방전구세포의 분화 및 지방생성 (adipogenesis) 과 정에 의하여 섭취한 영양소를 중성지방 (trigelyceride)의 형태 로 지방세포에 축적되어 발생한다. 미분화 지방전구세포 (preadipocyte)가 성숙한 지방세포 (matured adipocyte)로 분화되 는 과정은 세포의 형태, 호르몬 민감성 변화, 유전자 및 단백 질의 발현 등을 수반하며, CCAAT/enhancer binding proteins (C/EBPs)과 peroxisome proliferator activated receptor-γ (PPARγ)를 중심으로 adipogenesis를 조절하면서 분화가 진행되 는 것으로 알려져 있다 (Morrison and Farmer, 2000). 또한 지방세포 내의 지방구 (lipid droplet) 내에 주로 존재하고 있는 triglyceride의 분해와 이로 인한 glycerol의 유출은 세포 내 지 방의 축적을 조절하는 중요한 기작으로 보고되고 있다 (Frayn et al., 2003). 따라서 이러한 기작 조절을 기반으로 비만 예방 및 치료를 위한 세포 내 지방의 축적을 예방하거나 축적된 지 방을 분해하도록 자극하는 방안에 관한 연구가 최근 주목을 받고 있다 (Kim et al., 2012; Lee et al., 2012).
비만조절 요법 중 약물 치료제인 sibutramine과 orlistat 제 제의 부작용이 보고되면서 안전성과 유효성이 입증된 치료제 개발의 필요성이 절실한 실정이며 최근 안전성이 확보된 천연 물로부터 항비만 효능을 보유한 소재 발굴과 그에 대한 연구 가 다수 진행되고 있다. 항비만 활성의 생물학적 연구를 위해 mouse embryo로부터 유래된 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone, insulin 등의 MDI 분화유도인자를 사용하는 연구가 주를 이루고 있 고 (Jessen and Stevens, 2002), 이에 대한 각종 천연물 추출 물의 항비만 연구가 최근까지 보고되고 있다 (Kim et al., 2011; Park et al., 2014; Jeong et al., 2014).
배암차즈기 (Salvia plebeia R. Br.)는 꿀풀과 (Labiatae)에 속하는 일년생 또는 이년생 직립초목으로 우리나라 전 지역에 서 자생한다. 설견초, 나인초, 수양이(水羊耳), 과송청(過冬靑) 이라고도 하며 경엽 (어린잎)은 식용으로 이용되고 있으며, 한 방에서는 향기로운 가지가 달린 풀이라 하여 여지초 (枝草)라 불리며 약용으로 사용된다. 예로부터 기침, 천식, 간염, 설사, 염증 등에 대한 효과가 알려져 있다 (Lim et al., 2007). 주 요 성분으로 flavonoid, polyphenol, saponin, 강심배당체, 불 포화 스테롤, 정유 등이 있으며 종자의 지방유 등이 보고되어 있다 (Shin et al., 2001). 현재 배암차즈기 추출물에 대한 항 산화, 항균, 항알레르기, 항염증, 콜레스테롤 유출 촉진 효과 등이 보고되어 있다 (Jo et al., 2010; Jeong et al., 2012; Park, 2003). 또한 배암차즈기의 flavonoid 성분인 hispidulin은 AMPK 활성화를 유도하여 난소암에서 apoptosis를 일으키며 (Yang et al., 2010), glioblastoma multiforme 뇌종양 세포에 서 mTOR 억제 및 p21을 유도기전으로 암세포 증식을 억제 하는 것으로 보고되어 있다 (Lin et al., 2010).
이에 본 연구에서는 배암차즈기 경엽 (지상부)과 전초의 주 정 및 용매분획물에 대한 지방세포분화 및 지방축적 억제 효 능을 비교 측정하였고 비만관련 기능성 소재 또는 식품첨가물 로써의 가능성을 확인하였기에 이를 보고하고자 한다.
재료 및 방법
1. 시약 및 재료
본 실험에 사용한 mouse embryonic fibroblast 3T3-L1 지 방전구 세포주는 American type culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양에 필 요한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 및 fetal bovine serum (FBS), calf serum, penicillin-streptomycin, trypsin-EDTA는 Gibco® (Waltham, MA, USA)사에서, insulin, dexamethasone, 3-isobuthyl-1-methylxanthin, Oil red O, formalin, dimetyl sulfoxide (DMSO)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 세포 생존율 측정은 Promega (Madison, WI, USA)사의 MTS 시약 (CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)을 이 용하였으며, 중성지방 측정은 아산제약 (Seoul, Korea)의 Cleantech TG-S 제품을 구입하여 사용하였다. RNA 분리 및 RT-PCR을 위한 Trizol reagent는 Invitrogen Life Technologies (Waltham, MA, USA), Maxime RT PreMix Oligo dT 및 Maxime PCR PreMix i-StarTaq는 IntronBio (Seongnam, Korea)에서 구입하였고, Oligo-nucleotide (primer)는 Bioneer (Deajeon, Korea)에서 제작하여 사용하였다. 또한 시료 추출 및 분획물 제조 등에 사용한 시약 및 용매는 일급 또는 특급으로 ㈜SCI international (Seoul, Korea)로부터 구입하여 사용하였다.
2. 배암차즈기 주정추출물 및 분획물 제조
본 실험에 사용된 배암차즈기 (Salvia plebeia R. Br.)는 경 기도 여주 농가에서 재배된 것으로 경엽 지상부와 전초를 각 각 4월 초와 6월 중순에 수확하여 음지에서 건조한 것을 시료 로서 사용하였다. 실험에 사용된 배암차즈기 경엽 표본 (GCY- 201404)과 전초 표본 (GC-O-201406)은 ㈜와이디생명과학 기업부설 연구소에 보관되어 있다. 경엽지상부와 전초는 이물 질 제거 및 수세 후 열풍건조하였다. 배암차즈기의 생육시기 에 따른 최적 추출용매를 확보하기 위해 건조된 경엽 지상부 와 전초를 각각 100 g씩 추말 세절한 다음 각각 10배의 30, 50, 70, 95% (v/v) 주정용매에 침적하여 상온에서 24시간동안 침지추출 하였다. 추출물은 여과하여 여액과 잔사를 얻었고, 잔사를 동일한 방법으로 2회 반복하여 추출 및 여과하여 최종 배암차즈기의 경엽 지상부 주정추출물 (SALE) 및 전초 주정추 출물 (SAE)을 얻었다. 전초 시료의 극성에 따른 용매 분획물을 확보하기 위해 95% 주정조추출물 100 g을 증류수에 완전히 현탁시킨 후 용매극성에 따라 n-hexane (Hex), methylene chloride (MC), ethyl acetate (EA), n-butanol (BuOH)으로 순 차분획을 실시하여 전초 용매분획물을 확보하였다. 각각 얻어 진 추출물 및 분획물은 감압 농축 및 동결 건조하여 수율을 확 인하였고 –20°C 냉동보관하면서 실험에 사용하였다.
3. 3T3-L1 지방전구세포 배양 및 세포 독성 시험
3T3-L1 지방전구세포를 DMEM 배지 (10% calf serum, 100 units/mL penicillin, 0.1mg/mL streptomycin)에 첨가하여 37°C, 5% CO2 조건에서 75% confluence가 되도록 배양한 후, 0.25% (w/v) trypsin-0.53 mM EDTA 용액으로 처리하여 2 ~ 3일 간격으로 계대배양하여 실험에 사용하였다. 3T3-L1 세 포에 대한 세포생존율은 MTS 검정법으로 측정하였다. 96 well plate에 2 × 106 cells/mL로 분주하여 배양한 3T3-L1 세포 에 각각의 주정추출물 및 용매분획물을 10 ~ 100μg/mL으로 처리하고 37°C, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 시료를 처리한 각각의 well에 MTS 시약을 첨가하여 2시간 반응 후 분광기를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존 율을 확인하였다.
4. 3T3-L1 지방전구세포의 분화 유도 및 Oil Red O 염색
미분화된 3T3-L1 지방전구세포의 분화유도를 위해 6-well plate에 세포가 confluent 상태가 되도록 동일한 조건에서 배양 하고 48시간 후에 분화유도배지 (MDI; 10% FBS, 0.5 mM IBMX, 0.25 μM dexamethasone, 10μg/mL insulin가 포함된 DMEM)로 교환하여 지방전구세포의 분화를 유도 (D0)하였다. 분화유도 2일째 (D2)와 5일째 (D5)에 각각 10μg/mL insulin 이 포함된 분화유도 배지로 교환하여 지방전구세포의 분화를 촉진하였고 8일째까지 분화시켰다. 배암차즈기 추출물의 지방 전구세포의 지방세포로의 분화 억제 효능을 확인하기 위해 지 방전구세포 분화 시에 형성된 지방과립의 함량을 Oil Red O 염색법 (Jeong et al., 2014)을 이용하여 측정하였다. 각각의 배암차즈기 주정 추출물 및 분획물은 배지에 각각 100μg/mL 의 농도로 녹여 처리하였고, 배지만 처리한 것을 대조군 (MDI)으로 하였다. 세포분화 후 배지는 제거하고 PBS로 3회 세척한 후 10% formalin 용액으로 상온에서 1시간 동안 지방 세포를 고정시켰다. 60% isopropyl alcohol로 세척한 후 Oil Red O 용액으로 실온에서 30분간 염색하고 PBS로 세척한 후 현미경으로 지방세포의 염색정도를 관찰하였다. Isopropyl alcohol을 사용하여 염색된 지방을 용해하고 540nm의 흡광도 를 측정한 후 생성된 지방과립의 함량을 분석하였다.
5. 3T3-L1 지방세포 내 중성지질 함량 측정
3T3-L1 세포를 분화유도시킨 후 세포에 축적된 중성지방 (triglyceride, TG) 함량을 TG assay kit을 이용하여 정량법에 따라 측정하였다. 3T3-L1 세포분화 후 배지를 제거한 후 PBS로 세척하고 1 mM EDTA가 포함된 25 mM Tris buffer (pH 7.5)를 이용하여 lysis 시킨 후 13,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액만 취하여 Cleantech TG-S 시약을 첨가 하여 10분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 중성지질의 함량은 중성지질 표준용액곡선을 이용하여 환산하 였으며, 이때 단백질 양을 Bradford (1976) 방법으로 정량하여 세포수를 보정하였다.
6. RT-PCR (Reverse-transcription polymerase chain reaction) 분석
3T3-L1 세포를 분화유도 시킨 후 8일째에 세포를 회수하였 고 세포 내 총 RNA는 Trizol reagent를 이용하여 분리하였다. cDNA 합성 및 RT-PCR은 Maxime RT PreMix Oligo dT와 Maxime PCR PreMix i-StarTaq을 이용하여 수행하였다. RT-PCR에 사용된 oligo-nucleotide의 염기서열과 annealing temperature (Tm)은 Table 1에 나타내었다. PCR 반응은 predenaturation; 95°C, 10분, denaturation; 95°C, 30초, annealing; 55 ~ 50°C, 30초, elongation; 72°C, 1분, final-elongation; 72°C, 5분으로 35 cycles 실시하였고, 반응물은 2% agarose gel에 전기영동한 후, EtBr 염색하여 UV transilluminator (UVP ChemiDoc-It, Upland, CA, USA)로 band를 관찰하였고, 정량 적 분석은 VisionWorksLS (version 7.1) 프로그램을 이용하여 측정하였다.
Oligo-nucleotide sequences and conditions for RT-PCR
7. 통계분석
본 실험 결과는 Graphpad Prism® Version 4.0 (Graphpad Software, USA) 프로그램을 이용하여 평균 (mean) ±표준편차 (standard deviation, SD)로 표시하였다. 통계적 유의성은 Oneway ANOVA로 분석한 후, Tukey’s multiple comparison test 로 p < 0.05 수준에서 검정하였다.
결과 및 고찰
1. 배암차즈기 조추출물 및 용매분획물의 추출 수율
배암차즈기의 경엽과 전초의 건재 추말 시료를 각각 30%, 50%, 70%, 95% 주정용매로 추출한 조추출물과 전초 95% 주정조추출물을 용매극성에 따라 분획하여 얻은 분획물에 대 하여 추출수율을 측정하였다 (Table 2). 경엽조추출물 (SALE) 의 수율은 건조시료 중량 대비 약 17%였으며, 전초조추출물 (SAE)은 약 22%로 경엽의 추출수율보다 5% 정도 높았으며 모두 주정 함유량에 따른 수율 차이는 보이지 않았다. 전초의 용매분획물은 n-hexane 분획물이 74.5%로 가장 높은 수율을 나타내었고, MC, EA, BuOH 분획물은 약 3.5% 정도로 상대 적으로 매우 낮았다. 물분획물은 약 13%의 수율을 나타냈다.
Cytotoxicity of ethanolic extract and solvent fraction from Salvia plebeia R. Br. on 3T3-L1 preadipocytes.
2. 지방전구세포 3T3-L1에 대한 세포 독성
배암차즈기 경엽추출물 (SALE)과 전초추출물 (SAE) 및 전 초 용매분획물의 처리에 따른 3T3-L1 지방전구세포의 생존율 을 측정하기 위하여 MTS solution을 이용한 검정법을 실시하 였다. 그 결과 (Table 2), 경엽의 95% 주정추출물에서 세포 독성을 나타내었고, IC50 농도는 149.1μg/mL (p < 0.05)였다. 전초의 경우 모든 추출물 200μg/mL 처리 농도에서 세포독성 은 나타내지 않았다. 또한 전초 용매분획물의 경우 비극성인 n-hexane 및 MC 분획물에서 세포독성을 보였고, IC50 농도는 각각 92.4μg/mL, 77.2μg/mL (p < 0.05)였다.
3. 3T3-L1 지방세포 분화 및 지방생성 억제 효과
지방전구세포인 3T3-L1는 in vitro에서 분화유도물질인 MDI 를 첨가하였을 때 지방세포로 전환되며 세포내 지방을 축적 (adipogenesis)한다. 세포분화가 유도되는 동안 C/EBP family 와 PPARγ 등의 전사인자들의 전사 발현이 증가되고 이들 전 사인자들 사이의 상호 전사를 유도함으로써 지방세포 분화를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Morrison and Farmer, 2000).
배암차즈기 추출물 및 용매분획물의 처리에 따른 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 억제 효과는 Oil Red O 염색법을 이용하여 측정하였다. SALE 30%, 50%, 70%, 95% 주정추출물 각각 100μg/mL씩을 세포에 처리한 경우 (Fig. 1A), 각각 33%, 51%, 49%, 38% (p < 0.001)의 지방세 포 분화 억제활성을 나타내었으며, 50%와 70% 추출물에서 IC50 농도는 약 100μg/mL로 저해효과가 가장 높았다. 반면, SAE 주정추출물 각각 100μg/mL씩을 세포에 처리한 경우 (Fig. 1B), 70%, 95% 주정추출물에서는 저해효과를 보이지 않았으나, 30%, 50% 주정추출물에서 각각 32% 및 16% (p < 0.001)의 분화 저해활성을 나타내었다. 동일 처리 농도에서 SALE 추출물의 경우 지방분해 억제 효과가 더 우수하였다.
Inhibitory effect of Salvia plebeia R. Br. on the lipid accumulation in MDI-induced 3T3-L1 adipocytes.3T3-L1 cells were cultured in differentiation medium (MDI) with (A) SALE (100μg/ mL), (B) SAE (100 μg/mL), and (C) Solvent fractions from SAE (50μg/mL) during adipogenesis. The intercellular lipid accumulation contents of adipocytes were determined by Oil red O staining. Results are expressed as the mean ± SD. Values with different letter (a-d) within sample concentration are significantly different at p < 0.05. SALE; ethanolic extract of stem and leaf, SAE; ethanolic extract of whole plant, Solvent fractions; n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, and n-butanol from 95% SAE.
전초 조추출물로부터 얻어진 용매분획물의 지방세포분화 억 제 활성을 측정하였다. 세포 독성을 나타내지 않은 농도로서 각각 50μg/mL로 처리한 결과 (Fig. 1C), 비극성 n-hexane과 MC 분획물은 지방세포분화 억제 활성을 나타내지 않은 반면, BuOH 분획물이 15% (p < 0.001)의 약간의 활성을 나타내었으 며, EA의 분획물이 35%로 가장 우수한 저해활성 (p < 0.001) 을 나타내었다. Cho 등 (2007)은 배암차즈기 경엽을 메탄올 로 추출하여 추출액의 EA 분획물로부터 rosmarinic acid, luteolin-7-O-β-glucopyranoside, hispidulin-7-O-glucopyranoside 등을 구조 동정하였으며, 이 중 rosmarinic acid의 항산화활성 이 가장 높은 것으로 보고하였다. 최근 지방 세포 내 과도하 게 생성된 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)는 지방전 구세포의 분화를 촉진시키거나 지방세포 주변에 위치한 macrophage를 자극하여 다른 활성산소종을 생성함으로서 비 만의 주요 원인으로 작용한다고 보고된 바 있다 (Lee et al., 2009).
4. 3T3-L1 지방세포에서의 중성지방 축적 억제 효과
지방세포 내 지방구의 형성이 증가하면서 중성지방 생성량 이 증가하고 지방축적에 관여하는 효소가 활성화되면서 점차 적으로 지방세포 내 지방 축적이 일어나게 된다 (Frayn et al., 2003).
본 연구에서 배암차즈기 추출물 및 용매분획물의 처리에 따 른 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화과정 시 지방세 포 내 중성지방의 축적에 미치는 영향을 확인하였다. 결과, 배 암차즈기 경엽 (SALE) 30%, 50%, 70%, 95% 주정추출물 각각 100μg/mL씩을 세포에 처리한 경우 (Fig. 2A), 28%, 41%, 35%, 28%의 중성지방 축적 저해활성을 나타내었고, 50% 주정추출물에서 가장 효과가 우수하였다. 반면, 배암차즈 기 전초 (SAE)의 주정 함량별 추출물에 대한 중성지방 축적 저해활성을 확인한 결과 (Fig. 2B), 각각 100μg/mL로 각각 처리했을 경우, 30% 주정추출물에서 38%의 분화 저해활성 (p < 0.001)으로 가장 우수하였으며, 50% 및 70% 주정추출물 에서 각각 24% (p < 0.001), 10% (p < 0.01)의 저해활성을 보 였고, 95% 주정추출물에서는 효과를 나타내지 않았다. 또한 전 초 조추출물로부터 얻어진 극성에 따른 용매분획물의 중성지 질 축적 저해활성을 측정한 결과 (Fig. 2C), 각각 50μg/mL로 처리했을 경우, BuOH 분획물이 14% (p < 0.01)의 약간의 활 성을 나타내었으며, EA의 분획물이 46%로 가장 우수한 저해 활성 (p < 0.001)을 나타내었다. 반면, 비극성 n-hexane과 MC 분획물은 지방세포 내 중성지방의 축적 억제 활성을 보이지 않았다. 배암차즈기 경엽 50%과 전초의 30% 조추출물에 대 한 성분분석패턴이 유사하여 전초의 EA 분획물의 활성 결과 가 경엽에서도 동일할 것으로 사료된다.
Inhibitory effect of Salvia plebeia R. Br. on the triglyceride contents in MDI-induced 3T3- L1 adipocytes.3T3-L1 cells were cultured in differentiation medium (MDI) with (A) SALE (100μg/mL), (B) SAE (100μg/mL), and (C) Solvent fractions from SAE (50μg/mL) during adipogenesis. The intercellular triglyceride contents of adipocytes were determined by TG-S staining. Results are expressed as the mean ± SD. Values with different letter (a-e) within sample concentration are significantly different at p < 0.05. SALE; ethanolic extract of stem and leaf, SAE; ethanolic extract of whole plant, Solvent fractions; n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, and n-butanol from 95% SAE.
지방세포 내 축적된 중성지방이 분해되면 glycerol과 지방산 으로 나누어지는데 glycerol의 유출은 세포 내 지방의 축적을 조절하는 중요한 기전으로 3T3-L1 지방세포계에서는 free glycerol의 함량이 지방구 내 중성지방의 분해 정도를 간접적 으로 나타내는 척도가 된다고 알려져 있다 (Slavin et al., 1994). 분화된 3T3-L1 지방세포에 경엽추출물 (SALE)과 전초 추출물 (SAE)을 처리한 후 배지내로 분비된 free glycerol의 함량을 측정한 결과 대조군 (MDI)과 비교하여 분비량에서 통 계유의적인 차이는 없었다 (결과 미제시). 따라서 배암차즈기 추출물은 지방세포의 중성지방 합성에는 관여하나 기 축적된 세포내 중성지방의 분해에는 관여하지 않음을 확인하였으며, 이때 경엽 50% 주정추출물, 전초 30% 주정추출물 및 EA 용 매분획물에서 저해 효과가 가장 높았다.
5. 지방세포 분화 전사인자 C/EBPα 및 PPARγ mRNA 발현 측정
지방세포 분화유도 후 세포는 형태의 변화가 유발되고 일정 세포분열이 동반되며 5 ~ 7일간에 지방세포의 표현형을 나타 내게 된다. 지방세포의 지방세포 내 지방 합성과 저장에 관여 하는 효소들의 발현을 조절하는 전사인자는 분화초기에 발현 이 유도되고 분화 후기가 되면 다양한 adipogenic 유전자들의 발현을 유도하며, 그 발현양이 현저히 증가된다. C/EBPβετα 와 C/EBPδ는 각각 IBMX와 dexamethasone에 의해 분화과정 의 초기에 발현이 유도되며, 분화 후기에 C/EBPα와 PPARγ가 발현되면서 다수 종류의 지방세포 특이성 mRNA 등의 전사 활성화가 유도되는 것으로 알려져 있다 (Brun et al., 1996).
배암차즈기 경엽 주정추출물 (SALE)은 지방세포 분화 및 지방축적 저해 효과가 가장 높게 나타났으며 현재 식용으로 이용되고 있어 기능성 소재로서 개발 가능이 용이하다. 본 연 구에서는 배암차즈기 경엽 주정추출물 (SALE)에 대하여 지방 세포 분화 전사인자인 C/EBPα 및 PPARγ와 이들의 표지 유 전자인 lipoprotein lipase (LPL) 및 fatty acid synthase (FAS) 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 (Fig. 3), 분화 배지만 처리한 군 (MDI)에서 이들 전사인자 및 유전자 의 발현은 현저하게 증가되는 양상을 나타내었다. 30% SALE 10μg/mL 처리한 경우, C/EBPα와 PPARγ에 대한 mRNA 발 현 억제율은 각각 94.2%, 77.7% (p < 0.001)로 매우 높았으나, FAS 및 LPL 유전자에 대한 발현 억제율은 각각 33.2%, 23.5%로 상대적으로 낮았다. C/EBPα는 지방전구세포에서 인 슐린 민감성을 유도하고, 지방생성 및 PPARγ와 더불어 지방 세포로의 분화 후기과정에서 중요한 역할을 하며 분화와 관련 된 유전자들의 발현을 조절한다 (Freytag et al., 1994). 또한 PPARγ는 지방조직에 주로 존재하고 지방형성을 총괄적으로 조절하며 지방세포를 분화시키는 능력이 다른 전사인자들보다 월등히 높고 지방세포로 분화시키는 분화된 상태를 유지하는 데 필수적이다. PPARγ는 C/EBPs에 의해 그 발현량이 조절되 며 그 중에서도 C/EBPβ에 의해 지방세포분화의 초기단계에 PPARγ의 발현이 유도된다고 알려져 있다 (Schroeder-Gloeckler et al., 2007).
Effect of SALE on the mRNA expression of transcriptional factors and adipocytes-specific genes.3T3-L1 cells were cultured in differentiation medium (MDI) with SALE (100μg/mL) for 8 days. The mRNA levels of C/EBPα, PPARγ, LPL and FAS were analyzed by RT-PCR. Relative mRNA expression was normalized with GAPDH expression. The values were calculated as fold of gene expression of the MDI-treated group. Results are expressed as the mean ± SD of triplicate experiments. Values with different letter (a-e) within sample concentration are significantly different at p < 0.05. SALE; ethanolic extract of stem and leaf.
반면, 50% 주정추출물은 상기 C/EBPα와 PPARγ에 대한 mRNA 발현 억제율은 각각 46.6%, 44.0% (p < 0.001)였으나, 상대적으로 FAS 및 LPL 유전자 mRNA 발현 억제율은 각각 52.8% 및 63.6% (p < 0.001)로 더 높았다. 70% 주정추출물의 경우 PPARγ 및 LPL에 대해서만 각각 53.2%, 61.2% (p < 0.001)의 발현 억제효과를 보였다. 전사인자인 PPARγ가 발현되면 이의 표지 유전자인 FAS, LPL, aP2 등 adipogenic 유전자들의 발현이 유도 및 발현 양이 크게 증가하며, triglyceride의 축적과 같은 형태적 특징을 나타낸다 (Flier and Maratos Flier, 1998). 특히, 지방대사에 관여하는 지방합성 효 소인 FAS는 지방조직에서 가장 많이 발현되며 지방세포분화 의 최종인자로써 항비만 효과의 지표중 하나로 알려져 있다. LPL은 혈중 지방산을 세포 내로 전달하는 효소로서 지방조직 내 LPL로 인해 세포내로 유입된 fatty acid가 triglyceride로 전 환되어 저장되므로 LPL의 발현 및 활성이 억제되면 lipoprotein 내의 분해되지 않은 triglyceride가 체내로의 흡수가 저해되어 체중감소의 효과를 나타낼 수 있다고 알려져 있다 (Lafontan and Langin, 2009). Lee 등 (2009)은 미나리 (Oenanthe javanica) 및 율무 (Coicis lachryma-jobi L. var.) 추출물이 지질대사 관련 효소인 LPL의 활성을 억제시켜 중성지방의 지 방세포 유입 억제 활성을 나타내는 것으로 보고하였고, Seo 등 (2011)은 회향종자 (Foeniculi fructus) 추출물이 고지방식 이 유도 비만 마우스에서 LPL의 활성을 억제시켜 세포내로 지방산의 유입을 억제하는 항비만 효능이 있음이 보고하였다. 상기 결과로부터 배암차즈기 경엽추출물 (SALE)의 C/EBPα 와 PPARγ에 대한 발현 저해 효과는 30% 주정추출물에서 현 저히 우수하였고, 50% 주정추출물은 C/EBPα, PPARγ, FAS 와 LPS에 대하여 모두 50% 이상의 높은 발현 억제율을 나타 내었다. 또한 70% 주정추출물은 PPARγ 및 LPL 발현을 억제 하였다.
본 연구결과로서 배암차즈기 경엽 및 전초추출물은 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 및 지방세포 내 중성지방 축적을 현저히 억제시켰으며, 전초보다 경엽에서, 극성용매추 출물 및 에틸아세테테이트 분획물에서 더 우수한 효과를 나타 내었다. 또한 주요 지방세포분화 전사인자인 C/EBPα와 PPARγ의 발현을 억제시킴으로써 FAS 및 LPL의 지방세포 표 지 유전자 발현량을 감소시키고 최종 세포 내 중성지방의 생 성 및 축적을 감소시키는 것으로 확인하였으며, 이는 배암차 즈기 추출물이 비만을 예방할 수 있는 우수한 기능성 식품 소 재로서의 가능성을 보여주었다.
감사의 글
본 논문은 농림축산식품부 고부가가치식품기술개발사업 연 구비 지원에 의해 이루어진 연구결과의 일부로 이에 감사드립 니다.
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