도라지 수집종의 형태적 특성과 SSR마커에 의한 유연관계 분석

서 언

도라지 (Platycodon grandiflorum A. DC.)는 초롱꽃과 (Campanulaceae) 다년생 초본으로 생약명은 길경이라 한다. 도 라지는 1속 1종의 약용작물이며 우리나라에서는 재래종, 선 발육종에 의해 개발된 장백도라지, 배수체 육종에 의해 개발 된 으뜸도라지와 으뜸백도라지 등 총 3개 품종이 재배되고 있다. 도라지의 주요 약리성분은 triterpenoid계 saponin으로 platycodin A, C, D와 polygalacin D 등이 보고되었다. 특히 platycodin D에 대한 약리적인 효능은 진해거담작용, 중추신경 억제작용, 혈당강하 작용 및 콜레스테롤 대사개선작용, 항암활 성효과, 항염증효과, 항비만 효과 등이 보고되어 있다 (Zhao et al., 2006; Choi et al., 2001; Ahn et al., 2005; Wang et al., 2004; Lee et al., 2010). 이처럼 도라지는 식약 공용 으로 이용되는 약용작물이며 관상용으로도 가치가 있는 품목 으로 알려져 있다 (Mabberley, 1987). 2014년에 발표한 농림 축산식품부 국내 특용작물 생산실적에 따르면 생산량 5,442 톤, 생산액 1조 140억원으로 약용작물 중 생산량 5위에 해당 하는 주요품목으로 약용작물에서는 큰 가치가 있는 품목이다 (MAFRA, 2014). 그럼에도 불구하고 우리나라 도라지 유전자 원은 4개 품종에 의존하여 재배되고 있으며 품종육성을 위한 연구는 최근 수행된 배수체 육종 이외에는 보고된 바가 없다.

작물의 육종을 위해서는 다양한 유전자원 수집이 이루어져 야 하는데 다양한 유전자원을 수집했다 하더라도 식물학적 형 태적 특성으로는 잎의 모양, 꽃의 색깔 등으로 도라지의 지상 부 생육부위의 구별에 의존하여 육종을 시도하고 있다. 하지 만 이러한 형태적 특성만을 이용하여 품종을 구분하는 것은 환경에 영향을 많이 받으며 유전자간의 상위 작용이나 다면발 현에 의한 영향을 받을 수 있기 때문에 혼동하기 쉽다 (Jo et al., 2013).

최근 개발된 분자생물학적 판별법은 형태적 및 이화학적 판 별에서의 한계를 보완하고 종판별 결과의 신뢰도를 향상시켜 종 분류 및 계통분석에 관한 연구에 널리 활용되고 있다 (Williams et al., 1990; Moon et al., 2013; Kim et al., 2014). 특히 polymerase chain reaction (PCR) 기법을 이용한 random amplified polymorphic DNA (RAPD), single nucleotide polymorphism (SNP), simple sequence repeat (SSR) 등은 소량의 DNA를 이용하여 식물의 생장과 관계없이 모든 조직에서 안정적으로 탐색할 수 있으며 비교적 적은 비 용으로 빠른 시간 안에 분석할 수 있다는 장점을 가진다 (Jo et al., 2013). 이들 중에서도 SSR을 이용하여 품종별 유전적 다양성을 분석하는 방법은 분자마커들 중 재현성이 가장 높고 분석이 비교적 쉬우며 간편하기 때문에 선호도가 높다. 선행연 구자들은 SSR 마커를 활용하여 옥수수 (Zea mays), 자트로파 (Jatropha curcas), 사탕무 (Beta vulgaris), 양배추 (Brassica oleracea)에서 genetic diversity, phylogenetic relationship, population structure 등에 관한 결과를 보고하였다 (Vigouroux et al., 2005; Sirithunya and Ukoskit, 2010; Li et al., 2010; Saxena et al., 2011).

본 연구에서는 수집된 도라지 유전자원의 형태적 특성을 검 토하고 SSR 마커를 이용해 그들의 유전적 다양성을 분석하여 차후 도라지 육종에 활용할 기초정보를 제공하고자 하였다.

재료 및 방법

4. 유전적 다양성 분석

도라지 유전자원에 대한 SSR 마커 다양성 분석은 DNA fragment 분석기법을 활용하였다. 본 실험에 이용된 22쌍의 도 라지 SSR 프라이머는 선행연구자 (Lee et al., 2012; Song et al., 2012)에 의해 개발된 것을 활용하였으며 (Table 1), DNA fragment 분석을 위해 각각의 SSR 정방향 프라이머에 형광물질인 FAM을 라벨하였다. FAM 라벨된 프라이머를 이 용하여 PCR 증폭된 산물은 마크로젠 (Macrogen, Seoul, Korea)에 제공하였고 DNA fragment 분석을 수행하였다. DNA fragment 분석은 ABI3730xl DNA analyzer를 이용하였고 표지 자는 GeneScan-500LIZ size standard (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하였다. 분석결과는 GeneMaker software (SoftGenetics, State College, PA, USA)를 이용하여 정리하였다. 수집된 11종의 도라지 유전자원 간 유연관계 분석 은 NTSYS-pc 2.10 프로그램 (Exeter Software, Setauket, NY, USA)을 이용하여 수행하였다. 프로그램 내 옵션을 SIMQUAL 로 설정하여 수행하였고 UPGMA 알고리즘을 통 해 도출된 데이터를 바탕으로 SHAN 클러스터링을 거쳐 유전 적 유연관계를 분석하였다.

Table 1.

SSR markers used in Platycodon grandiflorum researchs from literature and this study.

결과 및 고찰

1. 도라지 형태적 특성 분석

수집된 도라지 유전자원의 지상지하부 형태적 특성을 비 교한 결과는 Table 2, Fig. 1, 2에 나타내었다. 도라지의 지상부 형태적 특성을 조사한 결과로 초장에서 장백은 26.74 ± 1.52㎝로 가장 큰 수치를 나타내었고, 분지수는 Fuji blue가 5.33 ± 0.73개로 가장 많은 분지수를 나타내었다. 경경은 Astra pink가 2.25 ± 0.06㎜로 가장 굵었으며 엽수는 Fuji white가 14.83 ± 0.73개로 가장 많은 엽수를 가지고 있었다. 엽 장에서도 Fuji white가 7.79 ± 0.34㎝, 엽폭은 Maries II가 4.57 ± 0.22㎝로 가장 큰 수치를 나타내었다. 지상부 생육특 성을 조사한 결과 분지수, 경경, 엽장, 엽폭에는 수집된 도라 지 유전자원간의 유의한 차이를 보이지 않았지만 초장과 엽수 에서는 유전자원간 큰 차이를 보이는 것으로 조사되어 도라지 의 형태적 특성조사 시 이들을 분류하는 기준이 될 수 있을 것으로 생각된다.

Table 2.

Morphological characteristics of Platycodon grandiflorum cultivars.

Fig. 1.

Morphological characteristics of root in Platycodon grandiflorum cultivars.1; Maries II, 2; Hakone double white, 3; Hakone double blue, 4; Fuji white, 5; Fuji pink, 6; Fuji blue, 7; Astra white, 8; Astra pink, 9; Astra blue, 10; Astra semi-double blue, 11; Jangbaek. Scale bars indicate as a 2㎝.

Fig. 2.

Floral leaf characteristics of Platycodon grandiflorum cultivars.1; Maries II, 2; Hakone double white, 3; Hakone double blue, 4; Fuji white, 5; Fuji pink, 6; Fuji blue, 7; Astra white, 8; Astra pink, 9; Astra blue, 10; Astra semi-double blue, 11; Jangbaek.

지하부 형태적 특성을 조사한 결과 근장은 장백 30.50 ± 0.78 ㎝, 근경 또한 장백이 12.31 ± 0.89 ㎜ 로 가장 큰 수치 를 나타내었다 (Table 2, Fig. 1). 주근을 포함한 지근의 총 합계는 Fuji pink가 13.90 ± 1.11 개로 가장 많은 지근수를 나 타내었으나 Fuji white 13.60 ± 2.11, 장백 13.10 ± 1.32와 근 사치를 보였다. 근생중량의 경우 근장과 근경에서 최고치를 나 타낸 장백이 142.70 ± 20.55 g으로 가장 큰 수치를 보였다. 지 하부 형태적 특성에서는 근장, 근경, 지근수, 근중량 모든 항 목에서 수집된 도라지 유전자원 각각 유의적 차이를 보이는 것으로 조사되었다. 특히 장백은 근장, 근경, 근중량에서 가장 큰 수치를 보였다.

화기의 형태적 특성을 조사한 결과 Maries II, Hakone double blue, Fuji blue, Astra blue, Astra semi-double blue 는 보라색을 띄었으며 Hakone double white, Fuji white, Astra white, 장백은 백색을 보였다. Fuji pink 와 Astra pink 는 옅은 분홍색을 확인할 수 있었다. Hakone double white, Hakone double blue 그리고 Astra semi-double blue 는 꽃잎 이 비켜 돌아간 형태의 겹꽃잎을 나타내었다 (Fig. 2). 화기형 태를 조사한 결과 수집된 도라지 유전자원은 색상으로 분류하 였을 때 보라색, 분홍색, 흰색으로 분류할 수 있었으며 화기 형태로 분류하였을 때는 홑꽃잎과 겹꽃잎으로 분류할 수 있 었다. 국내 도라지 재래종은 주로 보라색을 띄고 있으며 본 연구에서 실험재료로 사용한 장백은 재래종 중 흰색꽃을 가지 는 변종을 선발하여 집단순계로 유지된 품종이다 (Han et al., 2014). 따라서 본 연구를 위해 수집된 도라지 품종 중 분홍색 꽃을 가지는 Fuji pink와 Astra pink를 이용하여 차후 선발육 종을 시도할 수 있을 것이라고 생각된다.

2. SSR 마커를 이용한 유전적 다양성 분석

Lee 등 (2012)과 Song 등 (2012)은 7개 제한효소를 이용하 여 도라지의 genomic DNA에서 22개의 SSR을 개발하였다. 이들 22개 SSR 프라이머를 활용하여 본 연구에서 수집된 11 종의 도라지 유전자원에 대해 PCR 분석하였다. 그 결과 GBPG004, GB-PG029, GB-PG032, GB-PG038, GB-PG076, GB-PG119, GB-PG177 그리고 GB-PG182가 11종의 도라지 유전자원 genomic DNA에서 다양성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 증폭된 PCR 밴드 (allele)의 정밀한 분 석을 위하여 DNA fragment 분석을 수행하였다. DNA fragment 분석결과를 바탕으로 allele의 수를 조사하였더니 GB-PG004 3개, GB-PG029 4개, GB-PG032 3개, GBPG038 3개, GB-PG076 2개, GB-PG119 3개, GB-PG177 2 개 그리고 GB-PG182 2개의 allele로 총 22개의 allele를 확 인 할 수 있었고 SSR 마커 평균적으로 2.75개의 allele를 가 지는 것을 알 수 있었다. 또한 DNA fragment 분석으로 얻어 진 총 22개 allele의 정보를 이용하여 도라지 유전자원 간 유 연관계를 분석하였는데 Fig. 3에서 보는바와 같이 유연관계 계 수가 0.65인 위치에서 A, B, C, D인 4개 그룹으로 분류되는 것을 확인할 수 있었다. A그룹은 Maries II, Fuji white, Fuji pink, Fuji blue, 장백, Hakone double white, Hakone double blue 로 분류되었고 B그룹은 Astra pink, Astra blue, C와 D는 각각 Astra white와 Astra semi-double blue 로 분 류되었다.

Fig. 3.

Dendrogram illustrating genetic relationship among 11 Platycodon grandiflorum cultivars generated by UPGMA cluster calculated from 8 polymorphic SSR markers amplified.Scale at the bottom is genetic relatedness derived from coefficient of similarity. Cutivars in Maries II, Hakone double white, Hakone double blue, Fuji white, Fuji pink, Fuji blue, Astra white, Astra pink, Astra blue, Astra semi-double blue, Jangbaek.

분자마커를 이용한 도라지 판별에 대한 선행연구는 SCAR 를 이용한 청도라지와 백도라지의 판별 (Park et al., 2007), SSR을 이용한 지역수집종 도라지의 판별 (Song et al., 2012; Lee et al., 2012) 등이 보고되었지만 약 700 Mb 크기의 도 라지 유전체를 커버하기에 분자마커에 대한 연구는 매우 미흡 하다. 또한 형태적 특성과 연관된 마커에 대한 연구는 아직 보고되지 않았으며 차후 도라지의 육종을 위해서도 분자적인 연구는 지속되어야 한다.

본 연구에서 조사한 11종의 도라지 유전자원의 지상부 및 지하부 형태적 특성과 검증된 SSR은 도라지 품종 육성 시 조 기선발 마커 및 교배육종 시 잡종세대 검정에 활용될 수 있을 것으로 생각된다. 또한 본 연구의 자료는 향후 순계선발 및 계통육성을 통한 도라지 품종 등록 시 표지자로 활용하여 국 내 도라지 육성 품종에 대한 지적재산권 확보에 크게 기여 할 수 있을 것으로 사료된다.

감사의 글

본 연구는 농촌진흥청 연구사업(과제번호: PJ01035102)의 지원에 의해 이루어진 결과로 이에 감사드립니다.

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