지유 추출물 및 분획물의 항산화 활성과 식중독 원인균에 대한 항균활성
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Abstract
This study aimed to investigate the antioxidat and antimicrobial activities of the methanol extract and its fractions prepared from the roots of Sanguisorba officinalis L.
The antioxidant activities were compared by evaluating the DPPH radical and nitric oxide (NO) scavenging ability. Measurement of DPPH radical scavenging ability showed that the SC50 values of the ethyl acetate fraction was 3.85 μg/㎖. The ethyl acetate fraction exhibited the most effective DPPH radical scavenging ability compared with the other samples. As for the NO scavenging ability, at all tested concentrations, the ethyl acetate fraction showed a higher scavenging activity than that of the extract and other fractions. These results are related to the total phenolic compound and flavonoid contents of the ethyl acetate fraction. Antimicrobial activity against foodborne pathogens was investigated using the disc diffusion assay. The ethyl acetate fraction showed the highest antimicrobial activity against gram-positive Staphylococcus aureus and Bacillus cereus. However, the chloroform fraction had a higher antimicrobial activity against gram-negative Vibrio vulnificus than that of the extract and other fractions.
The results show that the ethyl acetate fraction had a higher antioxidant as well as antimicrobial activity, than did the other samples. Therefore, the ethyl acetate fraction has potential application in the food industry.
Keywords:
Sanguisorba officinalis L., Antimicrobial, Antioxidant, Foodborne Pathogen서 언
장미과 (Rosacease)에 속한 다년생 식물인 오이풀 (Sanguisorba officinalis L.)은 중국, 일본 및 우리나라 전 지 역에서 널리 분포하고 있다. 오이풀의 뿌리는 한방에서 지유 (地楡)라는 생약재로 사용되고 있다 (An et al., 2004a). 한방 에서는 주로 지혈과 상처부위의 치료에 사용되어왔으며, 피부 염, 점막염, 습진, 화상에 외용하는 것으로 알려져 있다 (Son et al., 2004). 오이풀의 뿌리에는 ziguglycoside I, II와 pomolic acid등이 함유되어 있고, 가지에는 quercetin과 kaempferol의 배당체와 ursolic acid 등 triterpenoid계 saponin 이 함유되어 있으며, 잎에는 vitamin C, 꽃에는 chrysanthemin, cyanin 등의 약리성분이 함유되어 있다 (Lee et al., 2005). 면역억제 활성, 항돌연변이효과, 신경세포 손상 억제효과, 항산화효과, 과민성 알레르기 예방, 항암, 항균효과 , 지혈작용 등의 연구가 진행되어 왔다 (An et al., 2004a, b; Ban et al., 2005; Goun et al., 2002; Hwang et al., 2014; Jang, 2010; Kim et al., 2002, 2011; Park et al., 2012a, b).
여성의 사회 참여에 의한 인스턴트 식품 (냉동 및 냉장식품) 소비의 증가와 국민 소득의 증가에 의한 식품의 고급화로 인 해 저장, 유통 시에 미생물에 대한 식품의 부패, 식중독 문제 가 우려되고 있다. 또한 건강한 삶에 대한 관심이 높아지면서 보존료를 비롯한 식품첨가물의 안정성에 대한 소비자의 인식이 증가됨에 따라 합성 첨가제에서 천연 식물을 이용하여 인체에 무해하며, 광범위한 항균작용을 나타내는 보존료의 개발에 대 한 연구가 많이 이루어지고 있다 (Ahn et al., 2000; Jo et al., 2009; Seo et al., 2010). 지유 에탄올 추출물의 경우 Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium 같은 식품 위해성 세균에 높은 항균활성을 나타내 었다 (Kim et al., 2011). 또한 식품 부패균 중 그람양성균인 Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus와 Listeria monocytogenes, 그람음성균인 Salmonella typhimurium 와 Pseudomonas aeruginosa에서 항균활성을 나타냄으로서 그 람양성균과 그람음성균에서 광범위한 항균활성을 보여주었다 (Choi and Rhim, 2013). 하지만 식품 위해성 세균이나 식품 부패균에 대한 분획물의 항균활성을 확인하는 실험은 미비하 였다. 따라서 본 연구에서는 지유의 추출물 및 분획물의 식중 독 원인균에 대한 항균활성 및 항산화 활성을 검증하여 천연 식품첨가제로서의 이용 가능성을 탐색하는 기초 자료를 제공 하고자 한다.
재료 및 방법
1. 재료
본 실험에서 사용한 지유 (Sanguisorba officinalis L.)는 2013년 화림제약에서 건조된 것을 구입하여 4℃ 이하로 냉장 보관하며 실험에 사용하였다. 표품은 동신대학교 생물자원산 업화지원센터에 확인하여 보관하며 사용하였다.
2. 추출 및 분획
건조된 지유를 마쇄한 후 추출 용매를 methanol (MeOH)로 하여 80℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 (BUCHI, Flawil, Switzerland) 및 동결 건조 (Sam Won Industry, Seoul, Korea)를 실시하여 분말화 하였고 추출물의 수율은 19.33%이었다. 추출물 중 일부를 증 류수에 분산시킨 후 순차적으로 chloroform, ethylacetate, n-butanol을 사용하여 용매분획을 실시하였으며, 획득된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험 에 사용하였다. 분획수율은 chloroform 분획물 (CF) 6.19%, ethylacetate 분획물 (EF) 34.10%, n-butanol 분획물 (BF) 26.44%, aqueous 분획물 (AF) 28.71%로 나타났다.
3. 총 polyphenol 및 flavonoid 함량 측정
Folin-Denis법을 이용하여 지유 추출물 및 분획물의 polyphenol 함량을 측정하였다 (Folin and Denis, 1912). 시료 액 (1㎎/㎖ in MeOH) 80㎕와 Folin-Denis reagent (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) 80㎕를 혼합한 후 3분간 방 치한 후 10% Na2CO3 80㎕를 혼합하여 암실에서 1시간 동 안 반응시켰다. 그 후 원심분리하여 상등액 120 ㎕를 취하 여 96 well plate에 옮겨 microplate reader (BIO-TEK, Winooski, VT, USA)를 사용하여 700㎚에서 흡광도를 측정 하였다. 표준물질로 chlorogenic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 표준 검량선을 작성하고 총 polyphenol 함량을 ㎎/g로 나타내었다.
Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 flavonoid 함량을 다 음과 같이 측정하였다. 시료액 (1㎎/㎖ in MeOH) 100㎕, 10% aluminium nitrate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 20㎕, 1M potassium acetate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 20㎕를 가하여 잘 혼합한 후 MeOH 860㎕를 첨가하여 40분간 반응시킨 후 415㎚에서 흡광도를 측정하였다. 자연적으로 존재하는 대부분의 flavonoid는 대부 분 배당체로 존재하기 때문에 (Peterson and Dwyer, 1998) 가장 흔하게 존재하는 flavonoid glycoside인 rutin (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 표준 검량선을 작 성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
4. DPPH radical 소거능 측정
지유 추출물과 분획물의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 radical 소거능을 측정하였다 (Blois, 1958). MeOH을 이용해 시료를 0.8 - 100㎍/㎖ 의 농도로 용 해시킨 시료액 20㎕와 MeOH에 200 μM로 용해시킨 DPPH 용액 180㎕를 혼합한 후 암실에서 15분간 반응시켜 517㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 바탕으로 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC50)를 계산하였으 며, positive control로 L-ascorbic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.
5. Nitric oxide 소거능 측정
Marcocci 등 (1994)의 방법을 변형하여 nitric oxide (NO) 소거능을 다음과 같이 측정하였다. 증류수에 용해시킨 시료액 30㎕와 10 mM sodium nitroferricyanide (III) dihydrate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 50㎕를 혼합하여 25 ℃에서 150분 동안 반응시켰다. 그 다음 1% sulfanilamide (in 30% acetic acid, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 60㎕를 넣고 5분 후에 0.1% N-(naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride (in 60% acetic acid, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 60㎕를 혼합하여 30분간 실온에서 반응시 킨 후 520㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 증류수 를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다. 대 조군으로 L-ascorbic acid를 사용하였다.
6. Disc diffusion assay에 의한 항균활성 측정
식중독 원인균을 대상으로 지유 추출물과 분획물을 disc diffusion assay를 이용하여 항균활성을 측정하였다. 항균활성 측정을 위해 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분 양받은 미생물 균주인 Staphylococcus aureus (KCTC3881), Bacillus cereus (KCTC1012), Vibrio vulnificus (KCTC 2959)를 사용하였으며, S. aureus와 B. cereus 균주는 Nutrient agar 및 broth (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하였고, V. vulnificus 균주는 Heart Infusion (HI) agar 및 broth (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하였다. 항균시험 용 평판배지는 107- 108CFU/㎖로 희석한 배양액을 100㎕씩 분주한 후 멸균 면봉으로 도말하였다. 직경 6㎜의 paper disc 에 시료를 disc당 0.5, 1.0, 0.5㎎이 되도록 천천히 흡수시켜 용매를 완전히 휘발시킨 후 평판배지에 밀착시킨 상태로 37℃ 에서 24시간 배양하였다. disc를 중심으로 생성된 저해환 (clear zone, ㎜)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
7. 통계분석
모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준 편차 (means ± SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS (Statistical pakage for social science, version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이 용하였다. 각 군 간의 측정치 비교는 One-way analysis of variance (ANOVA)를 시행한 후 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의성을 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.
결과 및 고찰
1. Total polyphenol 및 flavonoid 함량
페놀성 화합물은 항산화 활성이나 항암 활성 등 다양한 생 리활성에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Manach et al., 2005). 한편, 플라보노이드는 2개의 벤젠핵 (A 및 B환)과 3개 의 탄소로 이루어진 C6-C3-C6의 화합물로써 세포손상을 초래 하는 free radical을 없애주는 항산화 활성을 비롯하여 항암, 항균 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다 (Dewick, 2002). 지유 (Sanguisorba officinalis L.) 추출물과 분획물의 polyphenol과 flavonoid 함량을 측정한 결과를 Table 1에 제시하였다. 지유 추출물의 총 phenol성 화합물 함량은 337.91㎎/g으로 나타났다. 분획물의 경우 EF와 BF가 각각 538.93㎎/g, 433.30㎎/g으로 추출물보다 높은 함량을 보였다. Flavonoid 함량도 이와 유사한 양상으로 EF와 BF의 flavonoid 함량이 각각 23.16㎎/g, 14.87㎎/g으로 추출물과 다른 분획물보다 높게 나타났다.
Total phenolic compound and flavonoid contents in methanol extract and its fractions from the root of Sanguisorba officinalis L.
2. DPPH radical 소거능
추출물과 분획물의 DPPH radical 소거 활성을 SC50 값으로 환산하면, 추출물은 6.86㎍/㎖의 값을 가졌으며, EF가 3.85㎍/㎖로 가장 높은 활성을 보였다. 이러한 결과를 양성대 조군으로 사용된 L-ascorbic acid에 대한 상대적 활성으로 비 교하면 CF를 제외한 모든 분획물이 L-ascorbic acid에 비해 높은 활성을 나타내었으며, 특히 EF의 경우 양성 대조군보다 약 2.5배 높은 활성을 나타내었다 (Table 2). Kim 등 (2013) 이 보고한 소리쟁이 70% ethanol 추출물의 EtOAc 분획물이 L-ascorbic acid보다 2배정도 높은 활성을 보여준 것과 유사한 결과이다. 또한 DPPH radical 소거능과 같은 항산화 활성이 polyphenol 화합물의 함량과 연관관계가 있음을 확인할 수 있 었다 (An et al., 2014; Song and Lee, 2015).
DPPH radical scavenging ability of methanol extract and its fractions from the root of Sanguisorba officinalis L.
3. Nitric oxide 소거능
여러 조직과 세포들에서 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 합성되는 nitric oxide (NO)는 혈관확 장, 신경전달, 혈액응고, 면역기능 조절 등의 역할을 하는 것 으로 알려져 있다 (Bryan, 1982). 그러나 과량으로 생성된 NO는 치매 및 파킨슨 질환과 같은 퇴행성 신경질환, 조직 및 기관 손상, 동맥경화 등을 유발하는 등 양면성을 지닌 생체 분자로 여겨진다 (Cirino et al., 2006). 지유 추출물 및 분획 물을 6, 30, 150㎍/㎖의 농도로 조제하여 NO 소거능을 측정 한 결과, 150㎍/㎖의 농도에서 모든 분획물과 추출물이 양성 대조군인 L-ascorbic acid보다 높은 활성을 보였다. 특히 EF는 30㎍/㎖와 150㎍/㎖의 농도 차이에 의한 활성의 차이가 거 의 없어 경제적인 활용 지표를 산출할 수 있었다 (Fig. 1). 항 산화 효과가 뛰어나다고 알려진 흑마늘 분획물과 NO 소거능 을 비교한 결과 (Shin et al., 2010) 시료를 150㎍/㎖의 농 도로 처리하였을 때, 흑마늘과 지유의 EF가 각각 85.99%, 87.75%의 유사한 소거 활성을 나타냄으로써 천연 항산화 물 질로의 활용가능성을 확인할 수 있었다.
Nitric oxide scavenging abilities of methanol extract and its fractions from the root of Sanguisorba officinalis L.Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. *Means within a column followed by the same letter are not significant based on the DMRT (p < 0.05). MS; Methanol extract of Sanguisorba officinalis L., CF; Chloroform fraction, EF; Ethylacetate fraction, BF; n- Butanol fraction, AF; Aqueous fraction, AA; Lascorbic acid was used as a positive control.
4. 추출물 및 분획물의 식중독 원인균에 대한 항균활성
해마다 국내외적으로 발병률이 증가하는 추세에 있는 식중 독은 오염된 음식물을 섭취함으로써 발생되는 구토, 설사, 복 통 등의 증세를 동반한 임상 증후군이다 (Oldfield, 2001). 이 러한 식중독의 원인균으로는 Salmonella spp, Escherichia coli, Staphylococcus aures, Bacillus cereus, Shigella spp, Vibrio spp 등이 있다 (Song et al., 2009). 식중독 원인균으 로 알려진 그람 양성균인 S. aureus와 B. cereus, 그리고 그 람 음성균 V. vulnificus 세 가지 균주로 항균실험을 한 결과 를 Table 3에 나타내었다. S. aureus의 경우 추출물, BF, AF 는 실험을 실시한 모든 농도에서 생육 저해환을 형성하지 못 했으나 B. cereus의 경우 3㎎/disc로 시료를 처리하였을 때 모든 시료에서 9.17 - 16.85㎜의 생육 저해환을 형성하였다. 지유 ethanol 추출물을 3㎎/disc로 처리하였을 때 12.70㎜의 생육 저해환을 형성하였다는 보고가 있는데 (Kim et al., 2011), methanol 추출물은 11.32㎜의 생육 저해환을 형성함 으로서 ethanol 추출물보다 항균활성이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 반면 그람 음성균인 V. vulnificus에서는 저농도인 0.5㎎/disc로 시료를 처리하였을 때 모든 시료에서 생육 저해 환을 형성함으로써 지유의 추출물 및 분획물이 그람 양성균보 다 그람 음성균에서 높은 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 시료를 3 ㎎/disc로 처리하였을 때, 그람 양성균인 S. aureus와 B. cereus의 경우 EF가 각각 13.67㎜, 16.85㎜ 의 생육 저해환을 형성하면서 가장 높은 활성을 나타내었고, 그람 음성균인 V. vulnificus에서는 CF가 20.00㎜의 생육 저 해환을 형성함으로써 가장 높은 활성을 보여주었다.
Antimicrobial activities of methanol extract and its fractions from the root of Sanguisorba officinalis L. (Unit: mm)
이상의 결과에서, 지유 MeOH 추출물의 EF가 상대적으로 높은 polyphenol 함량을 바탕으로 높은 DPPH radical과 NO 소거 활성을 가지는 것으로 확인되었으며, 식중독 원인균에 대 한 항균활성을 측정한 결과 그람 양성군인 S. aureus와 B. cereus의 경우 EF가 가장 높은 활성을 나타낸 반면 그람 음성 균인 V. vulnificus에서는 CF가 가장 높은 활성을 보여줌으로 써 항균활성을 가지는 기능성 소재로서의 개발이 가능할 것으 로 판단되었다.
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