발광플라즈마 처리에 의한 들깨 부위별 항산화 및 Tyrosinase 저해 활성 효과

1. 식물재료

본 연구에 사용된 식물재료는 새엽실들깨 (Perilla frutescens L.)로 멸균한 상토에 파종한 후 광조건을 달리하여 2개월 동안 재배한 뒤에 부위별 수확하였다. 이후 샘플을 건 조하여 분말상태로 만든 후 추출 재료로 사용하였다. 재배조 건은 온도 25.0 ± 3.0℃, 습도 65.0 ± 2.0%를 유지하는 식물배 양실에서 광주기는 16시간 광/8시간 암 조건에서 재배하였다. 재배 시 사용한 광조건은 형광등 (1,700 lux, 23.8 μ㏖/㎡·s, PPF), LED 적색광 (650 ㎚, 28.7 μ㏖/㎡·s, PPF), LED 청 색광 (450㎚, 7.3 μ㏖/㎡·s, PPF), LED 백색광 (470㎚, 49.8 μ㏖/㎡·s, PPF), LED 녹색광 (510㎚, 24.9 μ㏖/㎡·s, PPF), LEP (33.7 μ㏖/㎡·s, PPF, Sunshine 400, Stray Light Optical Technologies, Inc., Scottsburg, IN, USA)로 6개 조 건으로 실험을 수행하였다.

2. 추출 및 농축

인공광원 처리한 들깨를 부위별로 나누어 60℃의 건조기 (VS-1202D4N, VISION SCIENTIFIC Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 샘플의 수분 함량이 5% 이내로 되도록 3일 이상 건조하였다. 건조된 샘플을 막자사발을 이용해 곱게 분쇄하여 70% EtOH (Ethanol, Daejung Chemicals and Metals Co., Ltd., Siheung, Korea) 용매로 3일간 상온에서 추출하였다. 이후 필터페이퍼 (MN020250, HYUNDAI Micro Co., Ltd., Seoul, Korea)에 여과하여 감압농축 (SB1200, EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 실시하였다. 완 전하게 농축된 플라스크에 70% EtOH 용매를 다시 넣고 시 료와 용매가 모두 녹을 때까지 30분 이상 초음파 추출한 후 0.2㎛ 필터 (Minisart SRP15 Syringe Filters, Sartorius Stedim Biotech Co., Goettingen, Germany)에 여과하여, 농도 를 정량하였다.

3. 총 폴리페놀 함량

인공광원 처리한 들깨의 부위별 총 폴리페놀화합물 함량은 Folin-Ciocalteu reagent가 알칼리 조건에서 추출물의 polyphenol성 화합물에 의해 환원된 결과 노란색에서 몰리브 덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 Folin-Ciocalteu assay (Singleton and Rossi, 1965)를 이용하여 수행하였다. 인공광원 처리한 들깨 추출물 1.0㎎/㎖에 50㎕의 Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 넣고 섞 어 준 후, 5분 후에 20% sodium carbonate (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 300㎕를 넣고 섞어주었다. 15분 후 에 증류수 1㎖을 넣은 후 725㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid를 사용하였으며, 검량선을 작성하여 총 폴리페놀화합물 함량을 분석하였다.

4. 총 플라보노이드 함량

인공광원 처리한 들깨의 부위별 총 플라보노이드 함량은 Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 100㎕ (10㎎/㎖)에 80% EtOH (Daejung Chemicals and Metals Co., Ltd., Siheung, Korea) 900㎕을 혼합하여 희석한 시료 500㎕에 10% aluminium nitrate (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 100㎕, 1M potassium acetate (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 100㎕, 80% EtOH 4.3㎖를 차례로 가하고 40분간 상온에서 반응시킨 후 415㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin을 사용하였 으며, 검량선을 작성하여 총 플라보노이드 함량을 분석하였다.

5. DPPH radical 소거 활성

인공광원 처리한 들깨의 부위별 DPPH radical 소거 활성은 Blois (1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 농도별 시료 100㎕에 0.15 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 100㎕를 혼합 하여 상온, 암조건에서 30분간 반응시킨 후, UV-VIS spectrophotometer (Multiskan FC Microplate Photometer, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이용 하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 DPPH radical 소거 활성은 대조군에 대한 DPPH radical을 50% 소거시키는 추출물의 최소 농도를 RC₅₀ (㎍/㎖)로 나타 내었고, 양성대조군으로는 ascorbic acid (Amresco LLC, Solon, OH, USA)를 사용하였다.

6. ABTS radical 소거 활성

인공광원 처리한 들깨의 부위별 ABTS radical 소거 활성은 Re 등 (1999)에 의해 실시된 ABTS+ radical cation assay 방 법을 변형하여 측정하였다. 7.4 mM ABTS (2,2'-azino-bis-3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 2.6 mM potassium persulfate (Daejung Chemicals and Metals Co., Ltd., Siheung, Korea)를 1 : 1 비 율로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 방치 후 radical을 형 성시키고, UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 732㎚에서 흡광도 값이 0.70 (± 0.03)이 되게 phosphate saline (PBS, pH 7.4)로 희석한 후, 희석용액 990㎕에 시료 10㎕를 가하 여 10분간 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물 의 ABTS radical 소거 활성은 대조군에 대한 ABTS radical 을 50% 소거시키는 추출물의 최소 농도를 RC₅₀ (㎍/㎖)로 나타내었고, 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였다.

7. 환원력

인공광원 처리한 들깨의 부위별 환원력 (reducing power)은 Oyaizu (1986)의 방법을 변형하여 측정하였다. 100% methanol 추출물 (1㎎/㎖) 30, 60, 90㎕에 0.2M sodium phosphate buffer (pH 6.6) 500㎕, 1% potassium ferricyanide 500㎕ 를 각각 혼합하여 50℃에서 20분 동안 반응시킨 후, 2.5㎖의 10% trichloroacetic acid를 가하였다. 위 반응액을 1,000 rpm 에서 10분간 원심분리하고, 상층액 500㎕에 증류수 500㎕, 1% ferric chloride 100㎕를 첨가하여 혼합한 반응액의 흡광 도 값을 740㎚에서 측정하였다. 반응액은 Fe³⁺과 Fe²⁺ 간의 변형에 의하여 청록색을 나타내며 흡광도 값이 클수록 높은 환원력을 나타낸다.

8. Tyrosinase 저해활성

인공광원 처리한 들깨의 부위별 tyrosinase 저해 활성은 Bernard와 Berthon (2000)의 방법을 변형하여 측정하였다. 기 질 L-dopa (3,4 dihydroxy-L-phehylalanine, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 8.3 mM와 tyrosinase (Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 125 U/㎖로 각각 준비하 였다. 96-well plate에 L-dopa와 시료액을 첨가하여 혼합한 후 tyrosinase를 첨가하고 37℃, 암조건 하에서 30분간 반응시켜 micro-plate reader 490㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대 조군으로는 kojic acid를 사용하였다.

저해율 (%) = (A- B)/A× 100

• A: 시료를 첨가하지 않았을 때의 흡광도
• B: 시료를 첨가하였을 때의 흡광도

9. 통계처리

모든 데이터는 최소 3반복 수행하여 평균 ±표준편차로 나 타냈으며, 통계처리는 종합 소프트웨어 CROPSTAT v7.2 (International Rice Research Institute, Los Banos, Philippines) 와 분석도구인 Agricultural research (Integrative Solutions LLC., Grosse Pointe Woods, MJ, USA)를 사용하였다. 변이 분석은 completely randomized design (CRD)인 Tukey’s honest significant difference (HSD)로 유의성을 검증하였고, 통계적 유의성을 5% 수준에서 분석하였다.

1. 총 폴리페놀 함량 비교 분석

식물의 폴리페놀 화합물이 많을수록 식물을 섭취 시 체내의 활성산소로부터 조직을 보호하고 항암, 항균, 항산화 활성이 높다고 보고되어져있다 (Duval and Shetty, 2001;Lee et al., 2005). 다양한 인공광원을 처리한 들깨 (Perilla frutescens L.) 부위별 총 폴리페놀 함량을 분석한 결과, 잎, 줄기, 뿌리 전체 부위에서 LEP를 처리하였을 때 총 폴리페놀 함량이 높 았으며, 특히 들깨의 줄기 부위에서 53.1 ± 0.5㎎·GAE/g으로 가장 높은 함량을 보였다 (Fig. 2). 청색광과 UV-A 파장 영 역을 포함하고 있는 LEP를 이용하여 재배한 연구에서도 황기 의 총 폴리페놀 함량이 36.0㎎·GAE/g으로 가장 높은 결과를 나타냈고 (Choi, 2015), 청색광을 처리한 시간이 지날수록 메 밀 새싹의 총 폴리페놀 함량이 점차적으로 증가하는 결과를 나타냈다 (Lee, 2013). LED 청색광의 파장 영역을 포함하고 있는 LEP 파장의 기능은 식물의 생리활성을 증진시키는 LED 청색광의 기능과 유사함을 보인 것으로 사료된다.

Fig. 2

Total phenolic contents of different parts of perilla treated with different light condition.1)GAE; Gallic acid equivalents. Each value is means ± standard deviation of three replicate tests. The data were statistically analyzed using Tukey’s honest significant difference (HSD), and differences were assessed to be significant at 5% level of probability (p < 0.05).

들깨 부위별 추출물의 총 폴리페놀 함량은 인공광원별로 다 르게 나타났다. 들깨 잎에서는 적색광을 처리하였을 때 1.2 ± 0.1㎎·GAE/g으로 가장 낮은 결과를 나타냈고 청색광 (1.5 ± 0.1㎎·GAE/g), 녹색광 (1.7 ± 0.2㎎·GAE/g), 형광등 (17.7 ± 0.2㎎·GAE/g), 백색광 (40.5 ± 1.1㎎·GAE/g), LEP (47.2 ± 0.6㎎·GAE/g) 순으로 높은 함량을 보였다. 줄기에서는 녹색 광을 처리했을 때 0.39 ± 0.1㎎·GAE/g으로 가장 낮은 결과를 나타냈고, 적색광 (1.27 ± 0.1㎎·GAE/g), 청색광 (3.37 ± 0.1㎎· GAE/g), 형광등 (5.85 ± 0.01㎎·GAE/g), 백색광 (19.71 ± 0.5㎎ ·GAE/g), LEP (52.13 ± 0.5㎎·GAE/g) 순으로 높은 함량을 보 였다. 뿌리에서는 녹색광을 처리했을 때 0.95 ± 0.1㎎·GAE/g 으로 가장 낮은 결과를 나타냈고, 적색광 (3.19 ± 0.1㎎·GAE/ g), 청색광 (4.5 ± 0.1 ㎎·GAE/g), 형광등 (6.00 ± 1.3㎎·GAE/ g), 백색광 (16.14 ± 0.4㎎·GAE/g), LEP (20.61 ± 0.3㎎·GAE /g) 순으로 높은 함량을 보였다 (Fig. 2).

2. 총 플라보노이드 함량 비교 분석

다양한 인공광원을 처리한 들깨 부위별 총 플라보노이드 함 량을 분석한 결과, 잎, 줄기, 뿌리 전체 부위에서 LEP를 처리 하였을 때 총 플라보노이드 함량이 높았다. 특히 총 플라보노 이드 함량은 LEP 처리한 들깨의 뿌리 추출물에서 2.3 ± 0.0㎎·QE/g으로 가장 높은 함량을 보였으며, LED 적색광과 청색광 처리 시 들깨의 뿌리에 총 플라보노이드 함량이 높은 것으로 나타났다 (Fig. 3). 이는 들깨 수확 시 영양분이 뿌리 로 저장된 것으로 사료되며 LED 청색광 처리 시 뿌리의 생 리활성이 증진되는 Seong 등 (2015a)의 연구와 비슷한 결과 를 나타냈다. 또한 LEP 광처리를 한 황기의 뿌리에서도 지표 성분 isoflavone 유도체인 formononetin은 형광등보다 1.7배 증가되었으며, calycosin은 47.2배 증가한 결과와 일치하였다 (Choi, 2015).

Fig. 3

Total flavonoid contents of different parts of perilla treated with different light condition.1)QE; Quercetin equivalents. Each value is means ± standard deviation of three replicate tests. The data were statistically analyzed using Tukey’s honest significant difference (HSD), and differences were assessed to be significant at 5% level of probability (p < 0.05).

들깨 부위별 추출물의 총 플라보노이드 함량은 인공광원별로 다르게 나타났다. 들깨 잎에서는 청색광을 처리했을 때 0.1 ± 0.0㎎·QE/g으로 가장 낮은 결과를 나타냈고, 형광등 (0.1 ± 0.1㎎·QE/g), 적색광 (0.2 ± 0.0㎎·QE/g), 녹색광 (0.2 ± 0.0㎎ ·QE/g), 백색광 (0.9 ± 0.1㎎·QE/g), LEP (1.8 ± 0.0㎎·QE/g) 순 으로 높은 함량을 보였다. 줄기에서는 녹색광을 처리했을 때 0.1 ± 0.0㎎·QE/g으로 가장 낮은 결과를 나타냈고, 형광등 (0.2 ± 0.0㎎·QE/g), 청색광 (0.3 ± 0.1㎎·QE/g), 백색광 (0.4 ± 0.1㎎ ·QE/g), 적색광 (0.6 ± 0.1㎎·QE/g), LEP (0.8 ± 0.0㎎·QE/g) 순으로 높은 함량을 보였다. 뿌리에서는 녹색광을 처리했을 때 0.0 ± 0.1㎎·QE/g으로 가장 낮은 결과를 나타냈고, 백색광 (0.1 ± 0.1㎎·QE/g), 형광등 (0.1 ± 0.0㎎·QE/g), 적색광 (1.1 ± 0.0㎎ ·QE/g), 청색광 (2.0 ± 0.1㎎·QE/g), LEP (2.3 ± 0.0㎎·QE/g) 순 으로 높은 함량을 보였다 (Fig. 3).

3. DPPH 및 ABTS radical 소거 활성 비교 분석

Radical은 활성산소로 체내에 쌓이면 주름, 색소침착 등 노 화 현상이 생긴다. 이런 활성산소 생산을 억제하기 위해 항산 기능을 평가하는 연구가 가장 많이 이루어져 있고, 대표적인 실험방법인 DPPH와 ABTS로 각 시약으로 만들어내는 활성산 소를 소거하는 정도를 확인하여 항산화 활성을 검정할 수 있 다 (Blois, 1958;Re et al., 1999).

다양한 인공광원을 처리한 들깨 부위별 DPPH radical 소거 활성과 ABTS radical 소거 활성은 RC₅₀ 값으로 나타내어 비 교하였으며, 그 결과는 비슷한 경향을 나타냈다. DPPH와 ABTS radical 소거능은 들깨 부위별로만 봤을 때는 비슷한 수준으로 뿌리, 잎, 줄기 순으로 높았으며, 인공광원별로는 LEP, 형광등, 백색광, 청색광, 적색광, 녹색광 순으로 활성이 높은 것으로 나타냈다. 특히 LEP를 처리한 들깨의 뿌리 추출 물이 DPPH radical 소거 활성은 9.1 ± 0.4㎍/㎖이고, ABTS radical 소거활성은 30.6 ± 6.2㎍/㎖로 가장 높았다. 다른 인공 광원 LED를 처리한 들깨 부위별 항산화력을 평가한 결과 인 공광원을 처리하지 않은 대조구보다 오히려 항산화력이 떨어 지는 것을 확인할 수 있었다 (Table 1). 이는 Choi (2015)가 연구한 황기의 DPPH radical 소거 활성과 비슷한 결과를 보 였으며, LEP 처리 시 가장 높은 활성을 나타냈고 LED 녹색 광 처리 시 가장 낮은 활성을 나타냈다.

Table 1

DPPH and ABTS radical scavenging activity in parts of perilla treated with different light conditions.

4. 환원력 비교 분석

다양한 인공광원을 처리한 들깨 부위별 환원력을 검정한 결 과, 들깨의 잎, 줄기, 뿌리에서 대조군인 형광등을 처리한 들 깨보다 LEP를 처리한 들깨에서 가장 높은 환원력을 나타났다. 다른 LED 광원을 처리한 들깨는 형광등 처리와 비교 했을 때 환원력이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 4).

Fig. 4

Reducing power from different parts of perilla treated with different light condition.Each value is means ± standard deviation of three replicate tests. The data were statistically analyzed using Tukey’s honest significant difference (HSD), and differences were assessed to be significant at 5% level of probability (p < 0.05).

들깨 부위별 환원력 비교 분석 결과, 잎에서는 LEP 광 처리 시 1.1 ± 0.0 abs로 가장 높은 환원력을 보였으며, 형광등 (0.5 ± 0.1 abs), 백색광 (0.3 ± 0.0 abs), 청색광 (0.1 ± 0.0 abs), 녹색광 (0.1 ± 0.0 abs), 적색광 (0.1 ± 0.0 abs) 순으로 낮은 함 량을 보였다. 줄기에서는 LEP 광 처리 시 2.2 ± 0.0로 가장 높은 흡광도 (absorbance, abs)값을 보였고, 형광등 (0.3 ± 0.1 abs), 백색광 (0.2 ± 0.1 abs), 청색광 (0.2 ± 0.1 abs), 녹색광 (0.2 ± 0.1 abs), 적색광 (0.1 ± 0.1 abs) 순으로 낮은 값을 보였 다. 뿌리에서는 다른 부위에 비해 환원력이 높았으며 형광등 (1.3 ± 0.0 abs)와 비교했을 때 LEP (2.6 ± 0.1 abs)와 백색광 (1.59 ± 0.1 abs) 처리 시 환원력이 높아졌으며 적색광 (0.2 ± 0.0 abs), 청색광 (0.2 ± 0.0 abs), 녹색광 (0.1 ± 0.0) 처 리 시 환원력이 낮아졌다 (Fig. 4).

5. Tyrosinase 저해활성 비교 분석

다양한 인공광원을 처리한 들깨 부위별 tyrosinase 저해활성 결과 농도가 증가함에 따라 tyrosinase 저해활성이 증가되었으 며, LEP 광 처리 시 가장 높은 저해활성을 나타났다 (Fig. 5). 개암풀 (Kim et al., 2010), 골쇄보 (Tan and Lim, 2015), 아 스포델루스 (Petrillo et al., 2016), 흰목이버섯 (Lee et al., 2016) 등 다양한 식물과 균류에서 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 높을수록 항산화 성분이 증대하여 색소 침착을 완화시 킨다는 연구결과가 많이 보고되어져있다. 또한 LEP 광처리를 한 황기의 뿌리는 플라보노이드 성분이 증가되었고, 이에 따 라 tyrosinase 저해활성도 LED를 처리한 것보다 2배 이상 높 았다 (Choi, 2015). 반면에 LED와 LEP 환경조건을 조성하여 수중산호 Acropora formosa와 Stylophora pistillata를 증식한 결과 PSII최대 양자 수율의 평균값은 LEP 처리구에서 수중산 호 두 종 모두 높은 함량을 나타냈지만, 생장률과 단백질 함 량은 LED 처리구에서 두 종 모두 높은 결과를 나타냈다. 또 한 표준식생지수 (NDVI)는 종별로 상이한 결과를 나타냈다. 이는 본 연구진이 사용한 LED와 LEP 파장이 다르고, 수중산 호 종별 광 이용력이 달라 생육결과가 상이하게 나타난 것으 로 사료된다 (Rocha et al., 2013).

Fig. 5

The inhibition rate of tyrosinase activity from different parts of perilla treated with different light condition.Each value is means ± standard deviation of three replicate tests. The data were statistically analyzed using Tukey’s honest significant difference (HSD), and differences were assessed to be significant at 5% level of probability (p < 0.05).

들깨 부위별 tyrosinase 저해 활성 비교 분석 결과 잎에서는 추출물의 농도가 1㎎/㎖ 일 때 대조구인 형광등 (56.2 ± 1.3%) 보다 LEP (75.8 ± 0.6%), 적색광 (42.0 ± 0.5%)로 높게 나타났으며 백색광 (42.2 ± 0.2%), 청색광 (42 ± 0.5%), 녹색광 (23.5 ± 0.8%) 순으로 대조구보다 낮은 tyrosinase 저해활성 을 보였다. 줄기의 추출물의 농도가 1㎎/㎖ 일 때 형광등 (41.2 ± 0.8%)와 비교하였을 때 LEP (65.2 ± 0.4%), 청색광 (53.5 ± 0.7%), 적색광 (42.1 ± 1.7%) 처리 시 tyrosinase 저해 활성이 높게 나타났으며 백색광 (22.6 ± 1.0%), 녹색광 (15.2 ± 0.9%) 처리 시 tyrosinase 저해활성이 낮게 나타났다. 뿌리의 추출물의 농도가 1㎎/㎖ 일 때 형광등 (42.8 ± 0.9%)과 비교 하였을 때 LEP (73.2 ± 1.9%), 청색광 (69.8 ± 1.2%), 적색광 (47.8 ± 2.0%) 처리 시 tyrosinase 저해활성이 높게 나타났으며 백색광 (34.7 ± 1.5%), 녹색광 (24.6 ± 1.2%) 처리 시 tyrosinase 저해활성이 낮게 나타났다 (Fig. 5).

본 연구 결과, LEP를 처리한 들깨에서 총 폴리페놀과 플라 보노이드 함량, DPPH와 ABTS 라디컬 소거능, 환원력, tyrosinase 저해 활성 결과가 다른 인공광원 (형광등, LED 적 색광, 청색광, 백색광, 녹색광)을 처리하였을 때보다 높은 항 산화 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

식물은 생육특성이나 유효성분 함량 증진에 적합한 광질, 광 파장이 있다. LEP는 태양광과 가장 유사한 인공광원으로 UVA, UV-B 뿐만 아니라 극소량의 적외선 또한 포함되어 있어 식물생육에 필요한 새로운 인공광원으로 괄목할만한 가치가 있다. 결론적으로 LEP 인공광원을 이용하여 멸종위기 식물, 노지재배가 어려운 식물, 식물공장 산업 등 다양한 방면으로 폭넓게 활용할 수 있을 것으로 사료된다.