유통 한약재에 대한 병원성미생물 분포

1. 시험 재료

2015년 11월부터 2016년 8월까지 유통 규격품 한약재 106건 을 수집하여 식중독균 분포조사를 위한 시험재료로 사용하였다.

2. 시약 및 기기

세균 배양에 사용된 standard plate count agar, 대장균 배 양에 사용된 desoxycholate agar, lactose broth, EMB agar, 바실러스 균 배양에 사용된 tryptic soy broth, 포도알균 배양 에 사용된 baird parker agar는 Oxoid (Hampshire, England) 에서 구입하여 사용하였고, 바실러스 균 배양에 사용된 MYP agar, 리스테리아 분리 동정에 사용된 fraser broth, oxford listeria selective agar는 Oxoid (Hampshire, England)에서 구 입하여 사용하였으며, API 20E kit, API CHB kit, API strep kit, API staph kit, API listeria kit는 Biomerieux (Marcy l'Etole, France), 장구균 배양에 사용된 enterococcus agar는 Becton, Dickionson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다.

3. 시험에 사용할 시료 원액 조제

시료 10 g을 채취하여 잘게 부수거나 썰어서 자른 후 멸균 백에 넣고 90㎖ 0.85% saline을 첨가한 다음 bag mixer 400 (Interscience, St. Nom la Bretèche, France)를 사용하여 시료를 균질화한 다음 원액시료로 사용하였다 (Lee and Yoon, 2010).

4. 총세균수의 측정

시료원액을 6부 튜브에서 계대희석한 후 petridishes에 희석 배수별로 1㎖씩 넣고 미리 준비한 멸균된 standard plate count agar를 20㎖씩 부어 pouring method에 의한 총세균수 정량시험을 수행하였다 (Lee and Yoon, 2010).

5. 대장균군수 (coliforms)의 측정

시료원액을 6부 튜브에서 계대희석한 후 petridishes에 희석 배수별로 1㎖씩 넣고 미리 준비한 멸균된 desoxycholate agar를 20㎖씩 부어 pouring method에 의한 대장균군수 정량 시험을 수행하였다 (Shim et al., 2013).

6. 대장균군 (coliforms) 분리 동정

시료원액 1㎖를 9㎖ lactose broth에 넣어 37 ± 0.5℃에서 24 시간 배양하여 증균하고 durham tube에 가스발생을 확인 한 후 1 백금 이를 취하여 EMB agar에 도말 접종하여 37 ± 0.5℃에서 18 - 24 시간 배양하였으며, 대장균군으로 의심되는 모든 형태의 집락을 골라 tryptic soy agar에서 순수 분리하고 gram staining을 실시하여 그람음성 무아포성 간균을 확인한 후 API 20E kit를 이용하여 균을 동정하였다 (Shim et al., 2013).

7. 바실러스균 (Bacillus spp.) 분리 동정

시료원액 1㎖를 9㎖ tryptic soy broth에 넣어 37 ± 0.5℃ 에서 24 시간 배양하여 증균하였고, 증균된 배지에서 1 백금 이를 취하여 egg yolk 5 - 10%와 Bacillus cereus selective supplement를 첨가한 MYP agar에 도말하여 37 ± 0.5℃에서 18 - 24 시간 배양하였으며, 바실러스균으로 의심되는 집락을 선별하여 tryptic soy agar에서 순수 분리하고 그램 염색을 실 시하여 그람양성 간균을 확인한 후 API CHB kit와 API 20E kit를 함께 이용하여 균을 동정하였다 (Shim et al., 2013; Song et al., 2014).

8. 장구균 (Enterococcus spp.) 분리 동정

시료원액 1㎖를 9㎖ tryptic soy broth에 넣어 37 ± 0.5℃ 에서 48 시간 배양하여 증균하였고, 증균된 배지에서 1 백금 이를 취하여 enterococcus agar에 도말하여 37 ± 0.5℃에서 18 - 24 시간 배양하였으며, 의심되는 집락을 선별하여 tryptic soy agar에서 순수 분리하고 그람 염색을 실시, 확인하여 API strep kit를 이용하여 균을 동정하였다 (Han et al., 2011).

9. 포도알균 (Staphylococcus spp.) 분리 동정

시료원액 1㎖를 9㎖ tryptic soy broth에 넣어 37 ± 0.5℃ 에서 24 시간 배양하여 증균하였고, 증균된 배지에서 1 백금 이를 취하여 egg yolk 5 - 10%를 첨가한 baird parker agar에 도말하여 37 ± 0.5℃에서 18 - 24 시간 배양하였으며, 의심되는 집락을 선별하여 tryptic soy agar에서 순수 분리하고 그람 염 색을 실시, 확인하여 API staph kit를 이용하여 균을 동정하였 다 (Kim et al., 2016).

10. 리스테리아 균 (Listeria spp.) 분리 동정

시료원액 1㎖를 9㎖ fraser broth에 넣어 37 ± 0.5℃에서 48 시간 배양하여 증균하였고, 증균된 배지에서 1 백금 이를 취하여 oxford listeria selective agar에 도말하여 37 ± 0.5℃에 서 18 - 24 시간 배양하였으며, 의심되는 집락을 선별하여 tryptic soy agar에서 순수 분리하고 그람 염색을 실시, 확인하 여 API listeria kit를 이용하여 균을 동정하였다 (Shim et al., 2013).

11. 항생제 디스크 diffusion 법에 의한 항생제 감수성 시험

항생제 디스크 diffusion법 (antibiotics disc diffusion method)에 의해 BD (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) 제품으로 실시하였고 감수성은 clinical and laboratory standards institute에 방법에 의하여 판 명하였다 (CLSI, 2007). 항생제 감수성 시험은 분리한 Bacillus cereus 균주 9 주에 대해 각각 실시하였고 사용한 antimicrobial drugs discs는 amikacin (AK30), amoxicillin/ clavulanic acid (AMC), ampicillin (AMP10), ampicillin/ sulbactam (SAM20), bacitracin(B10), carbenicillin (CAR100), cefamandole (MA30), cefoxcitin (FOX30), ceftriazone (CRO30), cephaloxin (KF30), chloramphenicol (C30), ciprofloxacin (CIP5), clindamycin (DA2), colistin sulphate (CT10), compound sulphonamide (S3-300), doxycycline (DO30), erythromycin (E15), gentamicin (CN10), kanamycin (K30), levofloxacin (LEV5), nalidixic acid (NA30), neomycin (N10), nitrofurantoin (F300), novobiocin (NV30), oleandomycin (OL15), oxolinic acid (OA2), penicillin G (P10), polymyxin B (PB300), rifampicin (RD5), streptomycin (S10), sulphomethoxazole/trimethoprim (SXT25), tetracycline (TE30), ticarcillin (TIC75), tobramycin (TOB10), trimethoprim (W5), 그리고 vancomycin (VA30) 등 36종류를 사용하였다 (Song et al., 2014; Han et al., 2011, Choi et al., 2013; Ryu et al., 2011).

1. 총세균수와 대장균군

유통 한약재 총 106건에 대해 총세균수와 대장균군수를 조 사한 결과 홍화, 두충 그리고 산조인에서는 일반 세균과 대장 균군이 오염되어 있지 않았고, 택사, 당귀, 국화, 진피, 산사, 치자, 맥문동, 연자육, 작약, 길경, 정향 그리고 건강에서는 일 반 세균은 오염되었으나 대장균군은 오염되지 않았으며, 오가 피, 우슬, 석창포, 행인, 황기, 마인, 결명자, 육계, 천궁, 토사 자, 박하 그리고 갈근 등에서는 일반세균과 대장균군이 모두 오염되어 있는 것으로 나타났다 (Table 1).

Table 1

Bacterial count distribution of medicinal herb products on the market.

이는 한약재 등의 항균활성에 대한 연구 즉, 맥문동, 산수 유, 국화 등의 추출물들에 대한 항균 특성 (Han et al., 2011; Seo et al., 1999), 오미자 추출물의 항균활성 (Park and Cho, 2010), 작약 추출물의 항균 활성 (Park and Cho, 2010), 치자에 대한 항균활성 (Ryu et al., 2011)에 관한 연구 결과 각각 항균활성을 나타내었다는 결과들과 일치하였다. 또 한, 일반세균과 대장균군의 오염이 없었던 홍화, 두충 그리고 산조인에 대한 항균활성 연구가 필요할 것으로 사료된다.

또한, 총 106건에 대해 총세균수와 대장균군수의 검출 범위 를 조사한 결과 우슬은 4.1 × 10 - 8.1 × 10와 0 - 8.0 × 10³로, 석 창포는 3.9 × 10³- 3.2 × 10⁶와 3.0 × 10 - 9.1 × 10³로, 맥문동은 0 - 9.6 × 10³와 0 - 0으로 각각 나타났고, 황기는 0 - 8.4 × 10⁴와 0 - 7.8 × 10⁴로, 두충은 0 - 0과 0 - 0으로, 산조인도 0 - 0과 0 - 0으로 각각 나타나 2010년 한약재에서 조사한 결과 (Lee and Yoon, 2010)인 황기, 두충, 산조인에서는 총세균수가 적게 나 온 반면, 상대적으로 총세균수가 많은 한약재는 석창포, 우슬, 맥문동 등이었다는 보고와 대체로 일치하였으나 황기의 경우 에는 본 연구 결과와 다소 차이를 보였다. 한편, 총세균수와 대장균군수의 검출빈도를 보았을 때 품목별 세균이 검출되지 않은 시료가 많은 것으로 나타나 한약재의 미생물 오염은 한약 재가 오염될 수 있는 여러 환경, 즉 제조공정 중 CCP (critical control point, 중점관리지점) 에서의 관리문제가 가장 크므로, 한약재가 어떤 것인지 보다는 개별 한약재를 더욱 집중 관리 하여할 필요가 있을 것으로 사료된다.

2. 속균별 세균 분리 결과

균 분리 시험 결과, 리스테리아속균 2 주, 바실러스속균 45 주, 장알균속균 29 주, 그리고 대장균군 속균 98 주 등 총 174 주의 균을 분리하였다 (Table 2). 174 주의 세균 분리 결과를 살펴보면, 대장균군 56.3% (98/174), 바실러스균 25.9% (45/ 174), 장구균속균 16.7% (29/174), 포도알균 속균 0.0% (0/ 174), 그리고 리스테리아속균 1.1% (2/174) 순으로 분리율을 나타내었다 (Table 2).

Table 2

Coliforms strains, Bacillus spp., Enterococcus spp. and Listeria spp. strains from medicinal herb product on the market.

Escherichia coli는 대장균군 98건 가운데 1건으로 나타나 전체 대장균군의 1.0% (1/98)에 불과하였고, Enterococcus faecalis는 1건으로 장알균 29건 가운데 3.5% (1/29), Enterococcus faecium도 1건으로 장알균 29건 가운데 3.5% (1/29)로 각각 나타났으며, Bacillus cereus는 바실러스속균 45 건 가운데 9건으로 무려 20.0% (9/45)를 차지하여 한약재에 흔히 발견되는 식중독균임을 알 수 있었다 (Table 2). 이는 2010년 한약재에서 검출된 호기성 세균 가운데 Bacillus cereus가 전체 50.4% (59/117)라는 보고 (Lee and Yoon, 2010)보다는 적었으나 다른 호기성 세균들에 비해 많이 나타 났다. 이렇게 Bacillus cereus가 많이 나타나는 것은 일반적으 로 Bacillus 속균들이 토양에서 유래하여 그 대부분이 포자를 형성함으로 고열에서도 균이 사멸하지 않는 특성을 갖고 있기 때문으로 보이며 (Lee and Yoon, 2010), 특히 이들이 한약의 가공과정에서 혼입되게 되면 식중독 유발 가능성도 배제할 수 없다 (Lee and Yoon, 2010). 또한, 2014년 보고 (Kim et al., 2014)에 의하면 황기를 제조하는 농가의 손수레에서도 Bacillus cereus가 검출되었고, 황기를 생산하는 작업자의 손에 서도 Bacillus cereus가 검출되었다고 보고함으로 Bacillus cereus가 한약재 가공과정에서 세척을 통한 저감화 방안 등 가 공처리 과정에 대한 특별한 주의가 필요한 것으로 판단된다.

그 외 많이 분리된 균들로는 대장균군의 경우 Enterobacter cloacae, Pantoea spp., Serratia ficaria, Cronobacter spp. 등이었으며, 바실러스균의 경우 Bacillus mycoides, Bacillus circulans, Bacillus megatorium 등이었고, 장알균 가운데에는 Leuconostoc spp., Aerococcus viridans, Globicatella sanguinis 등이 많이 나타났다 (Table 2). 이는 2010년 한약재 에서 검출된 호기성 세균 가운데 Bacillus megaterium 이 10.2% (12/117)라고 보고 (Lee and Yoon, 2010)한 것과 비 교할 때 6.7% (3/45)를 나타낸 이번 결과와 유사하였고, Bacillus subtilis 는 9.4% (11/117)로 보고하여 이번 연구결과 검출되지 않은 결과와는 대조를 이루어 이에 대한 추가 연구 가 필요할 것으로 사료되는데 이는 고초균 (Bacillus subtilis) 의 경우 건조된 한약재에서 나올 가능성이 있기 때문인데 이 는 대부분의 유통한약재가 토양유래라는 점 때문이다. 속균별 세균 분리 결과를 통해, 실험을 수행한 여러 병원성 미생물 중에서 Bacillus cereus가 국내 유통 한약재의 위생지표에 대 한 지표세균으로 가장 적합함을 알 수 있다. 일반적으로 유통 한약재에 발생하는 유해세균은 생산, 가공, 저장 단계 등 다양 한 유입경로로 발생할 수 있다. 본 연구에 사용한 시료는 서 울특별시 동대문구 약령시에서 유통되는 규격품 한약재만을 검 사하였으며, 시료는 국내산 37건, 수입산 69건 (중국산 55건, 베트남산 6건, 인도네시아산 5건, 인도산 3건) 등 106건이었 고, 제조업체는 G명품제약, N제약 ㈜, D제약 ㈜, M생약 ㈜, S생약 ㈜, SK ㈜. Y약초도매시장 ㈜, ㈜ KS PHARM, ㈜ N생약, ㈜ D한방제약, ㈜ D허브, ㈜ Y풀잎제약, ㈜ JY세상, ㈜ JH제약, ㈜ GO허브, ㈜ P무약, ㈜ HS제약, ㈜ H팜, ㈜ H제약, C제약, W제약 ㈜ 등 21개의 업체들이었다.

3. 항생제 감수성 검사결과

분리한 9 주의 Bacillus cereus에 대해 항생제 감수성 검사 를 실시한 결과 amoxicillin/clavulanic acid (AMC), ampicillin (AMP10), ampicillin/sulbactam (SAM20), bacitracin (B10), carbenicillin (CAR100), cefamandole (MA30), cephalothin (KF30), colistine sulfates (CT10), novobiocin (NV30), penicillin G (P10), rifampicin (RD5), ticarcillin (TIC75), trimethoprim (W5) 등 13류에 대하여는 내성 (resistance)을 나타 내었고, cefoxcitin (FOX30), ceftriazone (CRO30), nitrofrantoir (F300), polymyxin B (PB300), sulphomethoxazole/trimethoprim (SXT25), tetracycline (TE30) 등 6류에 대하여는 중등도의 내 성 (semi-resistance)을 나타내었으며 (Table 3), amikacin (AK30), gentamicin (CN10), levofloxacin (LEV5), oxolinic acid (OA2), vancomycin (VA30) 등 5류에 대하여는 감수성 (susceptibility)을 나타내었고, ciprofloxacin (CIP5), clindamycin (DA2), compound sulfonamides (S3-300), doxycycline (DO30), erythromycin(E15), oleandomycin (OL15), streptomycin (S10), tobramycin (TOB10) 등 8류에 대하여는 중등도 감수성 (semi-susceptibility)을 나타내었다 (Table 3).

Table 3

Antimicrobial discs used for diffusion susceptibility test of 9 strains Bacillus cereus isolated from medicinal herb product on the market.

19종류의 항생제들에 대한 내성결과에 대해서는 한약재들에 서 분리된 바실러스 세레우스 균주들이 인체 혹은 분변 유래 일 가능성을 배제할 수 없음을 나타내고 있어 이들에 대한 추 가 연구가 필요할 것으로 생각된다.