율무 종자의 Fusarium 속 진균 저감화를 위한 약제선발 및 방제시기 연구
; Tae Jin An3
; Yun Ji Lee4
; Eun Song Lee5
; Heung Bin Lim6, ‡
; Jeong Hoon Lee7, †
This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Adlay [Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen (Rom.Caill.) Stapf] is a nutritionally superior resource, but food hygiene problems are emerging due to mycotoxin contamination. It is difficult to predict the source and timing of mycotoxin contamination. Prevention and reduction methods for mycotoxins are important. Experiments were conducted to determine the optimal time for spraying pesticides and to select pesticides effective in the reduction of mycotoxins.
Metconazole and fludioxonil were sprayed onto the test field during the three growth stages, i.e., before the flowering stage, after the flowering stage, and at the maturing stage. Experiments were conducted on fungal density, seed yield, and mycotoxin evaluation of fumonisin (FUM), deoxynivalenol (DON), and zearalenone (ZEN). The harvested adlay seeds were analyzed for residual pesticides. Seed yield, fungal density and mycotoxins were better than in other treatments when metconazole was administered after flowering. The residual pesticides increased over time; after flowering, metconazole (1.25 ㎎·㎏−1) was up to 1.3 times higher than fludioxonil (0.96 ㎎·㎏−1). Spraying in the after-flowering stage was superior to other growth stages, and metconazole was more effective than fludioxonil in reducing mycotoxins.
It is considered most effective to treat adlay with metconazole after the flowering phase to reduce fungal toxins in Fusarium spp.
Keywords:
Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen (Rom.Caill.) Stapf, Fusarium, Deoxynivalenol, Fludioxonil, Fumonisin, Metconazole, Seeds, Zearalenone서 언
율무 [Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen (Rom.Caill.) Stapf]는 화본과에 속하는 1년생 초본식물로서 주로 열대, 아열대, 온대남부에서 재배 된다 (Lee et al., 2002). 우리나라에서는 전국에서 411 ㏊가 재배되고 있으며, 그 대부분이 경기도 연천군에서 재배되고 있다 (MAFRA, 2018).
율무는 다른 곡류에 비해 단백질 함량 및 지질 함량이 높을뿐만 아니라 칼슘, 철분, 비타민 B1, 비타민 B2 등을 다량 함유하고 있어 영양적으로 우수하고 건강보조식품이나 대체 식량자원으로 적합하다 (Lim, 2008). 또한 율무에는 coixol, coixenolide, lactams 등의 생리활성물질이 함유되어 있어 항산화, 항염증 및 항고혈압 등에 효과가 있는 것으로 보고되고 있으며, 그 중 coixol과 coixenolide는 항암 및 진통효과가 있어 최근 항암제로 개발되고 있다 (Lee et al., 2019).
하지만 수확 후 일부 율무 종자에서 deoxynivalenol (DON), zearalenone (ZEN)과 같은 곰팡이 독소가 검출된 사례가 보고되고 있고, fumonisin (FUM)은 옥수수, 조, 벼 등의 곡류에서 흔히 발생하며 이들의 가공식품에서도 검출사례가 보고되고 있다 (Sydenham et al., 1991; Choi et al., 2014). 이 같은 곰팡이 독소는 Fusarium 속 진균에 의해 생성되며 식품위생상 문제로 대두되고 있다 (Yoshizawa and Morooka, 1973; Leslie et al., 1992).
곰팡이독소는 곰팡이가 생산하는 2차 대사산물로 매우 적은 양으로도 사람과 가축에 심각한 해를 끼칠 뿐 아니라 곡물의 알곡에 발생하여 수량 및 품질을 저하시킨다 (Ham et al., 2017; Choi et al., 2019). 특히 곡류에 발생하는 붉은곰팡이병은 대표적인 Fusarium 독소를 생성하는 종으로서 DON, ZEN 등이 원인이 된다 (Lee et al., 2014; Jang et al., 2018). 이러한 곰팡이 독소는 사람에게 만성적 질병을 유발할 수 있기 때문에 국제식량농업기구 (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO), 세계보건기구 (World Hrade Organization, WHO) 등은 곰팡이 독소를 식품안전성 면에서 식품첨가물이나 잔류농약보다 더 큰 위험물질로 논의하였다 (Kang et al., 2010). FUM은 식도암 유발 원인물질로 추정되고 있으며, 식도 세포의 변형을 유발하는 것으로 알려져 있다 (NIFDS, 2016). DON은 인체에 급성으로 노출되었을 때 오심, 구토, 설사, 복통, 두통, 현기증 및 발열 증상이 있는 것으로 알려져 있고, ZEN은 인간에게 성 조숙증, 이상 증식을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다 (Luo, 1988; Boevre et al., 2013).
곰팡이 독소는 구조적으로 안정적이기 때문에 보관, 제분, 가공, 조리 시 쉽게 파괴되지 않으므로 농작물의 재배 단계에서 원천적으로 곰팡이 발생을 저감함으로써 곰팡이 독소 오염을 최소화하는 것이 중요하다. 따라서 본 연구에서는 율무의 곰팡이 독소 저감을 위한 약제 선발 및 방제 시기를 규명하여 재배 단계에서의 효과적인 독소 저감화 방법을 연구하였다.
재료 및 방법
1. 실험재료
본 실험은 국립원예특작과학원 인삼특작부 시험포장 및 환경조절 온실에서 수행되었다. 파종 직전 두둑 형성기를 이용하여 고랑 사이를 160 ㎝ 폭으로 두둑을 형성한 후 검은색 비닐 멀칭을 하고 한 처리구 당 50 ㎝ × 30 ㎝ 재식간격으로 2 열로 율무 [Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen (Rom.Caill.) Stapf] 품종 ‘조현’을 3 립씩 점파하였다. 출아 후 1 개체를 남기고 솎음 작업을 실시하였다. 그 후, 개화 전, 개화 후, 결실기 등 시기별로 약제를 처리하였으며, 사용 약제는 metconazole suspension concentrate (MSC), fludioxonil suspension concentrate (FSC) 2 품목을 사용하였다.
2. 수확 후 율무 종자의 진균 밀도
수확 후 처리구별 율무 종자를 500 g씩 채취 하였다. 그 후 멸균 증류수에 세척하고 건조기에서 40℃로 건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 곱게 간 것을 시료로 사용하였다.
대한민국약전의 미생물한도시험법 (MFDS, 2019)에 의거하여 멸균 증류수에 희석하고 Streptomycin을 포함한 1/10 potato dextrose agar (PDA, BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) 항생제 배지를 페트리디시 (100 ㎜ × 15 ㎜, SPL Co., Ltd., Pocheon, Korea)에 제조 후 시료를 도말하고 25℃ 항온기에 넣어 2 일간 배양하였다. PDA 배지상에 나타나는 균의 수를 조사하여 plate 당 총 진균수를 측정하였다.
3. 생육시기별 약제처리 효과
시험에 사용한 농약은 선행 연구를 통해 Fusarium 속 균생장억제 효과가 인정되는 품목이다 (An et al., 2016). Metconazole은 율무에서 분리되는 모든 Fusarium 균에 균사생장을 억제하는 효과가 있으며 fludioxonil은 deoxynivalenol과 zearalenone의 생성균인 Fusarium graminearum에게 항균 효과가 있다고 보고되어 있다 (An et al., 2016). 약제는 농약사용지침서 (KCPA, 2019)에 등록된 기준 농도에 따라 희석하여 개화 전 (7월 17일), 개화 후 (8월 7일), 결실기 (9월 11일)에 일주일 간격 3 회 살포하였다 (Table 1).
Comparisons of representative date, days after sowing and periods of pesticides treatment according to growth stage of Adlay.
생육단계는 수잉기, 출수기가 관찰되는 시기를 개화 전 (파종 후 84 일)으로 설정하였고, 꽃이 피는 시기부터 수정·수분이 이루어지는 시기를 개화 후 (파종 후 103 일)단계로, 열매가 생성되는 시기를 결실기 (파종 후 134 일)로 설정하였다 (Fig. 1).
Growth stage of Adlay. (A) emergency stage, (B) heading stage, (C) flowering stage, (D) maturing stage.
4. 수확 후 처리구별 독소검정
Fusarium 속 곰팡이가 생성하는 균의 독소를 정량하기 위해 Enzyme-Linked Immunospecific Assay (ELISA)를 사용하였다. 키트는 ELISA Kit (AgraQuant®, Romer Labs Inc., Newark, DE, USA)를 사용하였으며 deoxynivalenol (DON, COKAQ4000), zearelanone (ZEN, COKAQ5000) 및 fumonisin (FUM, COKAQ3000)을 제품 안내서에 설명된 지침에 따라 분석하였다.
모든 시료는 분쇄기로 곱게 갈아서 0.5 ㎜ 체를 통과해 얻은 미세 분말을 이용하였다. 처리구 당 샘플을 FUM, ZEN의 분석을 위해 70% 메탄올 50 ㎖에 혼합하였고 DON 분석을 위해서 증류수 50 ㎖에 혼합하여 3 분간 블렌더에서 고속으로 균질화 하였다. 여과지 (Whatman, Maidstone, England)로 추출물을 여과한 후 모든 샘플을 pH 7로 조정하였다.
DON 분석의 경우 여과액 1 ㎖를 증류수 3 ㎖에, ZEN의 경우 여과액 1 ㎖를 70% 메탄올 4 ㎖에, FUM의 경우 여과액 0.1 ㎖를 증류수 1.9 ㎖에 각각 혼합 희석하였다. 200 ㎕의 conjugate를 희석웰에 분주하고 100 ㎕의 시료와 표준물질을 conjugate가 포함된 희석웰에 분주하여 잘 혼합하였다. 이후 항체가 코팅되어 있는 웰에 100 ㎕를 다시 분주 한 뒤 DON의 경우는 15 분, FUM, ZEN의 경우는 10 분간 상온에서 배양하였다. 이후 DON은 버퍼 용액으로 5 회 세척, FUM, ZEN은 증류수로 5 회 웰을 세척하고 100 ㎕ 기질액 분주 후 5 분간 상온 배양하고 100 ㎕ 정지액 분주 후 ELISA 96 플레이트 리더기 (VERSAmax Tunable Microplate Reader, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 450 ㎚에서 결과 값을 측정하여 균 독소 농도를 정량하였다.
5. 처리구별 농약잔류 분석
본 시험에 사용된 기기분석 조건은 Table 2과 같다. 농약 처리구에서 수확한 율무종자를 마쇄하여 균질화 하였다. 시료 5 g을 취하여 acetonitrile 10 ㎖, 4 g magnesium sulfate, sodium chloride 1 g, sodium citrate tribasic dihydrate 1 g, sodium citrate dibasic sesquihydrate 0.5 g를 가한 뒤 혼화하고 하고 30 분간 추출하였다. 그 후 5℃에서 4,200 rpm으로 원심분리 한 뒤, 상등액에 1 ㎖를 취하여 PSA 25 ㎎, magnesium sulfate 150 ㎎, C18e 25 ㎎를 넣어둔 tube에 옮겨 담은 뒤 교반기에서 1 분간 혼화하고 3 분간 원심분리 시킨 후 필터 (0.2 ㎛)하여 LC-MS/MS에 5 ㎕ 주입하여 나타난 크로마토그램상의 피크면적을 측정하여 표준 검량선에 의해 함유농도를 산출하였다.
Operating conditions for the HPLC-MSMS analysis of Metconazole and Fludioxonil.
Fludioxonil, metconazole standard 1,003 ㎎/ℓ, 991 ㎎/ℓ acetonitrile의 stock solution을 acetonitrile으로 각각 희석하여 0.005, 0.010, 0.050, 0.100, 0.500, 1.000 ㎎/ℓ의 working solution을 만든 후 1 ㎖를 취하여 질소농축기로 완전 농축, 건고시켰다. 시료분석 과정을 거친 무처리 시료 1 ㎖로 재용해하여 matrix matched standard solution을 만든 후 5 ㎕ 씩 LC-MS/MS에 주입하여 나타난 크로마토그램상의 피크면 적을 기준으로 검량선을 작성하였다.
표준 검량선의 결정계수 (R2)는 metconazole, fludioxonil 모두 0.99 이상으로 높은 직선성을 보였으며, 잔류농약 정량 분석의 적합함을 확인하였다 (Table 3).
Calibration curve equations of Metconazole and Fludioxonil.
6. 통계처리
통계분석은 SAS 프로그램 (ver. 9.1; SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 사용하였으며, 5% 수준에서 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의성 검정을 실시하였다 (p < 0.05).
결과 및 고찰
1. 율무 종자 수량 및 균 밀도
Metconazole, fludioxonil의 2 품목 약제를 생육시기별로 살포하였을 때의 Fusarium 균 오염정도와 처리구별 종자의 수확량을 확인하였다. 생육시기에 따른 결과는 개화 후 처리구에서 Fusarium 균 오염 밀도가 다른 처리구에 비해 상대적으로 낮게 나타났다. 또한 약제 처리에 따른 Fusarium 균 오염 밀도는 metconazole 처리구가 fludioxonil 처리구에 비해 최대 6 배 낮게 나타났다 (Table 4).
Density of Fusarium spp. in growth stage of Adlay.
본 결과는 생육시기별 농약 살포에 따른 Fusarium 생성 독소 (DON, FUM, ZEN) 검출 결과와도 경향성이 일치한다. 처리구별 율무 [Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen (Rom.Caill.) Stapf] 종자 수확량은 무처리구에 비해 개화 후 metconazole 처리에서 약 61.5% 증수되어, 처리구에 따른 metconazole의 농약살포가 유의적인 차이를 보였다 (Table 5). 이는 생육기 농약 살포로 인한 율무의 수분, 수정 등 결실에 대한 약해가 미비한 것으로 보여진다. 율무를 재배할 경우 metconazole, fludioxonil 중 metconazole 처리를 했을 때 효과가 우수하며, 시기별로는 개화 후 농약살포가 효과가 있음을 보여준다.
Adlay seed yield by Pesticide treatment.
Tateishi 등 (2014)은 metconazole 약제를 개화기 중기 (mid-flowering stage)에 처리하였을 때 Fusarium 균에 의한 이삭마름병 방제 및 곰팡이 독소 저감에 효과적으로 보고하였고, Park 등 (2012)은 metconazole이 밀에서 주로 발생하는 붉은곰팡이병에서 높은 방제효과를 규명하였다. 또한 Pirgozliev 등 (2003)은 metconazole이 Fusarium 속 균의 번식 억제 효과와 DON의 농도 감소에 효과가 있는 것으로 보고하고 있는데 이러한 결과는 metconazole 약제와 같은 triazole계 살균제가 식물친화성과 침투이행성이 높은 에르고스테롤 생합성 저해제이기 때문으로 판단된다 (Seo et al., 2009).
따라서 본 연구의 결과는 이전의 유사연구와 비슷한 연구경향을 보였으며 metconazole 약제가 Fusarium 균 활성을 억제시킴으로서 곰팡이 독소 저감 및 종자 수확량을 증가시킨 것으로 판단된다.
2. 농약 처리시 수확한 율무 (종자)에 잔류하는 Fusarium 독소
율무의 곰팡이독소 허용기준은 식품공전 (MFDS, 2020)에서 DON은 1 ppm 이하, FUM은 2 ppm 이하, ZEN은 100 ppb 이하로 규정하고 있다. 곡류 내 Fusarium 균 오염으로 인한 곰팡이 독소의 발생은 세계적으로 꾸준히 보고되고 있으며, 전 세계 곡물 생산의 25%가 곰팡이 독소에 오염되고 있는 것으로 추정하고 있다 (Ryu et al., 2011). 처리구에 따른 종자의 독소를 검정한 결과, DON은 모든 처리구에서 허용 기준치 미만으로 나타났고, FUM은 1 개, ZEN은 4 개의 처리구에서 허용 기준치를 초과하는 값이 나타났다 (Table 6).
Detection of Mycotoxins by growth period and pesticides.
이는 Kim 등 (2013)이 보고한 백미, 보리, 옥수수와 같은 곡물에서 FUM, ZEN이 DON보다 상대적으로 높은 오염율을 보였던 선행결과와 유사한 결과 값을 보였다. 또한 DON, FUM, ZEN은 fludioxonil 처리구보다 metconazole 처리구가 독소 검출량이 낮았으며, 특히 개화 후 metconazole 약제를 처리했을 때 다른 시기 처리구보다 곰팡이독소 검출량이 낮게 나타나는 경향을 보였다.
본 결과는 생육시기별 농약 살포에 따른 율무 종자 수확량 및 균 밀도 검출 결과와도 경향성이 일치하였다. 따라서 곰팡이 독소 저감 및 건전한 종자를 생산하기 위해서는 개화 후 metconazole 약제를 살포하는 것이 효과적이라고 판단된다.
3. 수확 된 율무의 농약 잔류분석
처리구에 따른 율무 종자에 대하여 LC-MS/MS를 이용하여 metconazole 및 fludioxonil의 잔류량을 확인하였다. 시기별로 약제를 살포하였을 때 개화 전 metconazole과 fludioxonil 모두 평균 잔류량이 0.01 ㎎/㎏ 미만으로 나타났으며 시기가 지날수록 약제의 잔류량이 증가하는 것을 확인하였다 (Table 7). 특히 metconazole을 처리하였을 때 개화 후 (0.08 ㎎·㎏−1)에서 결실기 (1.25 ㎎·㎏−1)사이에 약 15.6 배의 급격한 증가를 보였다.
Amount of pesticide residue by treatment (Metconazole and Fludioxonil).
또한 Metconazole과 fludioxonil 두 약제 간의 농약 잔류량은 개화 전, 개화 후에는 비슷하였으나 결실기에는 metconazole이 fludioxonil보다 약 1.3 배 더 높은 농약잔류량이 검출되었다. 이러한 결과는 metconazole이 cis와 trans 이성질체로 구성된 침투성의 triazole계 살균제로서 phenylpyrrol계통의 비침투성인 fludioxonil보다 작물 잔류성이 더 높다고 보고된 바와 같다 (Kang et al., 2016).
Choung 등 (2016)은 농산물 재배기간 중 살포한 농약의 잔류량이 작물의 생육으로 인한 생체중 증가, 약제의 물리화학적 특성, 약제처리 방법, 기상조건 및 약제 살포 후 경과일수 등 다양한 요인에 의해 영향을 받는다고 하였는데, 이는 초기에 약제 살포 후 시간이 경과함에 따라 약제의 분해 및 휘발이 이루어지고 날씨, 관수처리 등에 의해 세척되어 농약의 잔류량이 감소할 것으로 본 연구의 농약살포에서도 비슷한 경향이 예상된다.
하지만 살포시기가 늦을수록 농약 잔류량이 증가하며 특히 결실기에 급격히 증가하기 때문에 재배 시 이를 고려하여 방제하는 것이 식품안전성에 유리할 것으로 판단된다. 또한 Lee 등 (2012)은 곡류가 탈곡과정을 거치기 때문에 엽채류나 과채류와 다르게 농약 검출률이 매우 낮다는 보고처럼 율무 역시 탈곡과정을 거친 후 종피가 제거한 후 한약재 및 식품에 이용되므로 농약 잔류량이 더 낮게 검출될 것으로 판단된다.
Acknowledgments
본 연구는 농촌진흥청 연구사업(과제번호: PJ0142512021)의 지원에 의해 이루어진 결과로 이에 감사드립니다.
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