모란과 작약의 구별을 위한 엽록체 기반 InDel 마커의 개발
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Abstract
Paeonia suffruticosa Andrew and P. lactiflora Pallas are important medicinal plants that are difficult to differentiate due to their similar appearances. The development of molecular markers will aid in the discrimination of these two species.
We found several chloroplast genomic loci that were polymorphic between P. suffruticosa and P. lactiflora. Among them, the insertion/deletion (InDel) marker PsPl-InDel-12 clearly discriminated 25 P. suffruticosa and P. lactiflora samples collected in the Republic of Korea. We were able to discriminate the two species in material of mixed status.
The marker developed in this study can be used to ensure P. suffruticosa and P. lactiflora quality and increase consumer confidence when purchasing medicinal products made from these species.
Keywords:
Paeonia lactiflora, Paeonia suffruticosa, Chloroplast, Genotyping, Insertion/deletion Marker서 언
작약속 (Paeonia spp.)은 미나리아재비과 (Ranunculaceae)에 속하며 세계적으로 25 - 40 여 종이 존재하는 것으로 알려져 있다. 국내에는 모란 (P. suffruticosa), 백작약 (P. japonica), 산작약 (P. ovobata), 작약 (P. lactiflora) 등이 자생하며 주요 재배종은 모란과 작약이다 (Stern, 1943). 영어권에서는 모란과 작약을 각각 tree peony와 peony라고 부르는데 꽃이 크고 아름다우며 꽃잎이 풍성하고 색이 다양하다는 공통점이 있다. 모란은 낙엽 관목으로 키가 2 m까지 자라고 작약은 여러해살이풀로 50 ㎝에서 90 ㎝까지 성장한다 (Lee, 2006).
모란과 작약의 지하부는 예로부터 한국, 중국, 일본 등 동아시아에서 심혈관 질환 등에 많이 쓰여왔으며, 대한민국 약전 (Korean Pharmacopoeia, KP)에 따르면 모란은 목단피로 불리는 뿌리껍질을 약으로 사용하고 작약은 뿌리 부위를 사용한다. 목단피는 진정제, 항염증제 및 다양한 여성 장애 치료제에 쓰이고 작약은 진통제 및 해열제로 사용된다 (WHO, 1999).
모란의 꽃에는 지표성분인 paeoniflorin 함량이 모란의 뿌리보다 높게 함유되어 있고 많은 종류의 flavonoid, monoterpenoid, 항산화 성분이 함유되어 있다 (Chen et al., 2003; Li et al., 2009; Han and Bhat, 2014; Wang et al., 2017, Yun et al., 2018). Yun 등 (2018)은 모란의 뿌리, 잎, 꽃에서 추출 용매별 유효성분의 함량 변화를 비교하였으며, Jung 등 (2010)은 작약꽃을 대상으로하여 polyphenol의 종류와 함량을 동정하고 지표성분인 paeoniflorin이 뿌리, 잎, 줄기 뿐만 아니라 꽃에서도 검출되는 사실을 확인하였다.
같은 Paeonia 속에 속해 있는 모란과 작약은 건강기능식품 및 기능성화장품 등으로 활용 가치가 높지만 꽃의 생김새가 비슷하고 주로 가공되어 운반되기 때문에 원산지 표기 문제나 종 혼용의 문제가 있다 (Moon et al., 2013). 대부분의 식물 분류 및 종에 대한 판별은 형태학적 특성에 따른 차이에 의존하고 있어 유사한 형태의 식물 종 사이에서의 구분에는 제한적이다.
형태적 특성을 이용한 구별의 한계를 해결하기 위해 식물분류 및 종 판별 기술인 분자 마커가 제시되고 있는 바, Kim 등 (2014)은 백수오 (은조롱)와 하수오의 식물분류학적 위치와 유효성분이 다름에도 하수오라는 이름으로 혼용되는 상황을 극복하고, 백수오와 이엽우피소의 성숙기 열매와 종자가 박주가리의 것과 비슷하여 나타나는 혼동을 해결하기 위해서 국내에서 재배되는 백수오, 이엽우피소, 박주가리 및 하수오의 형태적 형질을 비교한 바 있다. 또한 Kim 등 (2015)은 백수오의 뿌리와 이엽우피소의 뿌리가 육안상 식별이 불가능한 점을 극복하기 위하여 하수오, 백수오 및 이엽우피소의 종 판별이 가능하도록 psbA-trnH 유전자를 대상으로 종 특이적 마커를 개발하기도 하였다.
분자 마커는 분자 수준에서 개체들을 구별할 수 있는 마커시스템이며 random amplified polymorphic DNA (RAPD), inter-simple sequence repeat (ISSR), amplified fragment length polymorphism (AFLP), simple sequence repeat (SSR) 등이 널리 사용된다 (Huh, 2015). 또한 DNA 염기 서열 한 부위의 변이를 이용한 single nucleotied polymorphism (SNP)과 insertion (삽입) 또는 deletion (결실)된 부위를 이용하는 InDel을 대상으로 primer에 형광을 붙여 염기 서열간 차이를 실시간 분석하는 kompetitive allele specific PCR (KASP)과 high reslution melting (HRM)이 사용되기도 한다.
Bang 등 (2004)은 RAPD-SCAR 마커로 백출의 기원식물인 Atractylodes japonica와 A. macrocephala을 구별할 수 있음을 제시하였고 Sim 등 (2019)은 SNP 기반 HRM 마커를 개발해 Sanguisorba officinalis (오이풀), S. longifolia (긴오이풀), S. tenuifolia (흰오이풀)을 종 판별에 사용하였다.
현재까지 모란과 작약의 구분을 위해 작약 품종 구분을 위한 AFLP 마커와 SSR 마커 개발, 기원 판별 및 유연관계 분석이 이루어졌으나 (Wan et al., 2018; Xu et al., 2018; Wu et al., 2021) InDel 마커는 개발된 바 없다.
친자 확인 및 범죄현장의 용의자 추적에 주로 사용되는 Short Tandem Repeat (STR)과 DNA 염기 서열 한 부위의 변이를 이용한 SNP는 분석 시 고가의 장비가 필요하기 때문에 DNA 샘플 분석에 어려움이 있다 (Jobling and Gill, 2004; Kim et al., 2012; Schneider, 2012; Li et al., 2014). 이에 반해 InDel은 PCR 기반의 공우성 마커로서 앰플리콘의 길이 차이를 이용하여 agarose gel을 이용하여 실험실 수준에서 샘플을 쉽게 구별할 수 있다 (Pǎcurar et al., 2012). InDel은 SNP와 동일하게 식물을 포함한 다양한 종에서 게놈 전체에 걸쳐 매우 풍부하게 분포되어 있다 (Rafalski, 2002; Riahi et al., 2013). 또한 돌연변이율이 낮고 스터터 피크가 없으며, 지리적으로 멀리 떨어져 있는 모집단 사이의 대립유전자 빈도에서도 유의미한 차이를 나타내므로 ancestry informative marker (조상 정보 표지자)로 사용된다 (Pereira et al., 2009; Santos et al., 2015; Cortellini et al., 2020).
본 연구에서는 선행연구에서 완성된 총 길이 152,811 bp의 모란의 엽록체 유전체 (Park et al., 2019)와 총 길이 152,811 bp의 작약 엽록체 유전체 (Lee et al., 2019) 정보를 비교하고 형태적 특성으로 구분이 어려운 두 종의 구분을 위하여 InDel 마커를 개발하였다. 또한 개발된 마커가 모란과 작약의 다양한 개체에 적용되는지, 저농도의 DNA에도 구별 가능한지, 혼합 여부도 판단 가능한지 확인하고자 하였다.
재료 및 방법
1. 실험 재료 및 DNA 추출
충북대학교 부설농장 (36°37′28.61″N, 127°27′18.36″E)에서 재배한 모란 17 개체와 작약 2 개체, 경기도 여주에서 수집한 모란 2 개체, 대전 광역시에서 수집한 작약 1 개체, 경북 영주에서 수집한 작약 3 개체를 대상으로 하였다 (Table 1). 총 25 개의 모란 (19 개체) 및 작약 (6 개체)을 수집하였고, 모란과 작약 각 수집 개체에 대해 어린 잎과 건조된 꽃의 상태로 샘플링하여 –70℃의 초저온 냉동고에 보관하였다.
List of genetic resources used in this study.
각 모란과 작약의 수집 개체로부터 어린 잎을 약 20 ㎎ 채취하여 동결 건조한 뒤 TissueLyser II (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용해 30 Hz로 30 초간 분쇄하였으며, 건조된 꽃은 막자사발을 이용해 분쇄하였다. 건조된 꽃의 genomic DNA (gDNA)는 건조 과정에서 파괴되었을 것으로 추정되나, 본 실험에 사용하기에 충분하다고 생각되어 어린 잎과 동일하게 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 방법으로 추출하였다 (Doyle and Doyle, 1987). 각 DNA는 DeNovix® DS-11+ Spectrophotometer (DeNovix Inc., Wilmington, DE, USA)를 사용하여 농도 측정 후 10 ngㆍ㎕-1로 희석하였으며, 모두 –20℃에 보관하였다.
2. 엽록체 전장유전체의 비교
InDel 구간의 탐색은 선행연구에서 완성한 모란 (NCBI 등록번호, MH793271)과 작약 (NCBI 등록번호, MK860971)의 엽록체 유전체 비교를 통해 수행되었고 CLC Genomics Workbench Program (ver. 8.0, Qiagen, Aarhus, Denmark)을 이용하였다.
실험에 사용된 총 길이 152,811 bp의 모란은 long single copy (LSC) 부분이 84,466 bp, small single copy (SSC) 부분이 28,051 bp, 한 쌍의 inverted repeat (IR) 부분이 25,647 bp로 이루어진 것을 확인하였으며 (Park et al., 2019), 작약은 총 길이 152,731 bp로 LSC 부분이 84,402 bp, SSC 부분이 16,969 bp, 한 쌍의 IR 부분이 25,680 bp로 이루어진 것을 확인하였다 (Lee et al., 2019).
3. 유전체 기반 InDel 마커 선발
탐색한 InDel 구간을 포함하는 primer set를 CLC Genomics Workbench Program (ver. 8.0, Qiagen, Aarhus, Denmark)를 이용하여 제작하였다. Primer set 제작 조건은 증폭 산물의 길이가 100 – 450 bp, annealing 온도 47℃ - 57℃, G + C 비율 0.4 이상으로 하였다.
4. Genotyping
PCR 반응액의 총 부피는 20 ㎕로서, 10 ngㆍ㎕-1 농도의 gDNA 2 ㎕, 10 μM의 forward primer와 reverse primer 각 1 ㎕, 10x Taq DNA Polymerase (Takara Bio Inc., Otsu, Japan) 10 ㎕, 증류수 6 ㎕로 구성하였다.
PCR 반응은 T100™ Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하였으며, 95℃에서 3 분간 pre-denaturation한 후, 95℃에서 1 분간 denaturation, 50℃에서 1 분간 annealing, 72℃에서 1 분 30 초간 extension하여 총 35 cycles로 수행하였고, final extention 과정은 72℃에서 10분간 실시하였다.
PCR 증폭 산물은 2% agarose gel에서 확인하였으며 EtBr (ethidium bromaide)를 사용해 DNA 염색하였다. 각 밴드의 크기 비교를 위해 PCR 증폭 산물과 1 kb Ladder Plus (Dong-shengbio Co., Guangdong, China)를 함께 분주하였다.
전기영동은 120 V로 30 분간 수행한 후, Gel Documentation System (Gel Doc™ XR + System, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)으로 Image Lab Program을 이용하여 UV light 하에서 PCR 증폭 산물을 확인하였다.
결 과
1. InDel 마커 개발
CLC Genomics Workbench Program (ver. 8.0, Qiagen, Aarhus, Denmark)를 이용해 모란 (MH793271)과 작약 (MK860971)의 엽록체 유전체 정보 비교하였고, in silico 상에서 다형성 구간 지역을 선발하였다. 선발한 다형성 구간에 대해서 41 개의 primer set를 제작 후 pretest한 결과, 모란과 작약 밴드의 사이즈 차이가 크고 선명해 뚜렷이 구별되었던 PsPl-InDel-12 마커를 종 판별 마커로 최종 선택하였다 (Table 2).
InDel markers made by the chloroplast genome statue to distinguish P. suffruticosa and P. lactiflora.
PsPl-InDel-12은 forward primer와 reverse primer 각각 18 bp로 모란 증폭 산물은 전체 388 bp의 길이를 가지며 작약 증폭 산물은 전체 280 bp의 길이를 갖는다 (Fig. 1). 또한, trnD_guc와 trnY_gua의 유전자간 영역 내에서 InDel 염기서열을 증폭하였다 (Table 2).
InDel locus sequence of the PsPl-InDel-12.Comparison of the chloroplast genomic information of P. suffruticosa (MH793271) and P. lactiflora (MK860971) with CLC Genomics Workbench Program.
2. Genotyping
PsPl-InDel-12가 지역에 관계없이 모란과 작약을 구분 가능한지 확인하기 위해 충북대학교 부설농장에서 재배한 모란 14 개체 (Ps-001, Ps-002, Ps-003, Ps-004, Ps-005, Ps-006, Ps-007, Ps-008, Ps-009, Ps-010, Ps-011, Ps-012, Ps-013, Ps-014)와 작약 1 개체 (Pl-001), 국내 지역 3 곳 (경기도 여주, 대전광역시, 경북 영주)에서 수집한 모란 2 개체 (Ps-018, Ps-019)와 작약 4 개체 (Pl-003, Pl-004, Pl-005, Pl-006) 등 총 21 개체의 수집한 어린 잎 시료 대하여 genotyping을 수행하였다.
국내에서 수집한 총 21 개체에 PsPl-InDel-12 마커를 적용하여 PCR과 전기영동을 실시한 결과, 모란 16 개체는 388 bp로 윗줄에 밴드가 나타났고, 작약 5 개체는 280 bp로 아랫줄에 밴드가 나타나 모란과 작약을 뚜렷하게 구분할 수 있었다 (Fig. 2).
The results of PCR analysis using the PsPl-InDel-12 marker on a total of 21 P. suffruticosa and P. lactiflora samples.M; 1 kb DNA ladder, Lane 1; Ps-001, Lane 2; Ps-002, Lane 3; Ps-003, Lane 4; Ps-004, Lane 5; Ps-005, Lane 6; Ps-006, Lane 7; Ps-007, Lane 8; Ps-008, Lane 9; Ps-009, Lane 10; Ps-010, Lane 11; Ps-011, Lane 12; Ps-012, Lane 13; Ps-013, Lane 14; Ps-014, Lane 15; Ps-018, Lane 16; Ps-019, Lane 17; Pl-001, Lane 18; Pl-003, Lane 19; Pl-004, Lane 20; Pl-005, Lane 21; Pl-006.
또한 모란과 작약이 각각 이용되었을 때, 저농도의 DNA에서도 PsPl-InDel-12 마커로 검출 가능한지 DNA 농도에 차이를 두어 모란과 작약에 대해 PCR 및 전기영동을 수행하였다. 그 결과 모란과 작약 모두 10 pgㆍ㎕-1의 농도까지 밴드가 뚜렷하게 나타나 육안으로 확인 가능하였다. 1 pgㆍ㎕-1의 농도까지도 밴드가 희미하게 관찰되었지만 0.1 pgㆍ㎕-1의 농도에서는 밴드가 전혀 확인되지 않았다 (Fig. 3).
PCR analysis results of the PsPl-InDel-12 marker used with various DNA concentrations.PCR amplification using PsPl-InDel-12 marker for P. suffruticosa Ps-001 sample (A) and P. lactiflora Pl-001 sample (B). Lane 1 - 7 differ in DNA concentration. Lane 1; 1 ng · ㎕-1, Lane 2; 0.5 ng · ㎕-1, Lane 3; 0.25 ng · ㎕-1, Lane 4; 0.1 ng · ㎕-1, Lane 5; 10 pg · ㎕-1, Lane 6; 1 pg · ㎕-1, Lane 7; 0.1 pg · ㎕-1, M; 1 kb DNA ladder.
혼합 여부 판단을 위한 정량분석은 건조된 모란 꽃 시료 (Ps-015, Ps-016, Ps-017의 동량 혼합물)와 작약 꽃 시료 (Pl-002)를 이용하였다. 모란과 작약의 시료를 일정 비율로 혼합해 얻은 DNA에 PsPl-InDel-12 마커를 적용하여 PCR 및 전기영동을 수행한 결과, 모란과 작약의 특이적 밴드가 잘 증폭되어 두 밴드를 모두 검출할 수 있었다.
모란의 경우 9 개의 혼합 DNA에서 밴드가 윗줄에 모두 나타났지만 작약은 9 : 1로 혼합해 얻은 DNA에서 아랫줄의 밴드가 나타나지 않았다. 손상된 DNA에서도 판별이 가능할 것이라 예측했던 PsPl-InDel-12 마커는 모란 : 작약의 비율이 7 : 3인 경우에도 뚜렷하게 검출되었으며, 혼합비가 8 : 2인 경우에도 작약의 밴드가 희미하게 관찰되어 본 마커는 모란에 20%의 작약이 혼합되어도 충분히 혼합 여부를 확인할 수 있었다 (Fig. 4).
PCR analysis using the PsPl-InDel-12 marker for the mixed samples of P. suffruticosa and P. lactiflora.Lane 1 - 9 differ in dry weight ratio (w/w) of mixed samples of P. suffruticosa Ps-015, Ps-016, and Ps-017 to P. lactiflora Pl-002 sample. Lane 1; 1:9, Lane 2; 2:8, Lane 3; 3:7, Lane 4; 4:6, Lane 5; 5:5, Lane 6; 6:4, Lane 7; 7:3, Lane 8; 8:2, Lane 9; 9:1, M; 1 kb DNA ladder.
고 찰
최근 합성 화합물의 독성과 부작용 사례가 증가함에 따라, 오랫동안 이용해오며 안전성이 확인된 천연자원에 대한 인기가 증가하고 있다 (Jo, 2012). 천연자원을 이용해 만든 건강기능식품 및 기능성화장품은 안전하면서도 복합적인 기능을 기대할 수 있는데 천연물 시장이 전 세계적으로 꾸준히 성장하고 있는 상황에서 원료로 사용될 천연물 소재 탐색 및 기능성 연구, 안전성 연구가 활발히 이루어지고 있다 (Cho et al., 2011; Lee et al., 2020).
모란과 작약에는 약효성분인 paeoniflorin이 함유되어있기 때문에 항염과 진통에 효과가 있어 통풍이나 관절염 치료 등에 이용되어왔다. 모란과 작약은 꽃의 형태가 비슷할 뿐 아니라 약재 시장과 화장품 원료시장 등에서 가공된 상태로 거래되기 때문에 형태학적 특성에 의존하여 구분하는 데는 한계가 있다 (Park and Kim, 2009). 본 연구를 통해 개발된 PsPl-InDel-12은 국내에서 재배중인 모란 19 개체에서는 388 bp, 작약 6 개체에서는 280 bp의 앰플리콘이 증폭되어 명확히 구분할 수 있었다. 국내외 재배 모란과 작약에 대해 분자 수준의 종 구분에 활용할 수 있을 것이라 기대된다. 또한 PsPl-InDel-12은 InDel 마커로써 SNP 마커에 비해 최소한의 실험장비로 크기에 따라 쉽게 구별할 수 있어 활용 가치가 높을 것으로 사료된다.
그러나 genotyping에 사용된 작약 개체 수가 적고, 수집 자원이 국내 재배종에 국한되어 있기 때문에 실제 유통 시장에서 적용되기 위해서는 산작약 등 국내 희귀종을 포함한 국내 외 Paeonia속 모란과 작약 종, 교배종 및 다양한 Paeonia속 원예용 재배 도입종 등에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
혼합 DNA의 분석은 법과학과 식품과학에서 주로 다뤄지고 있으며, 식물보다 동물에서의 연구가 활발하다 (Montiel-Sosa et al., 2000; Park et al., 2007; Lee et al., 2014; Eom et al., 2018). Lee 등 (2017)은 돼지고기 위주로 제조된 소시지에 저가 원료인 닭고기의 혼합 여부를 판별하기 위해, 종 특이적 DNA 염기서열 차이를 이용한 real-time PCR로 돼지와 닭 DNA의 검출 한계가 각각 0.05 ng 이상임을 확인하고, DNA 혼합비가 5 : 5, 7 : 3, 9 : 1인 경우에도 정량분석 가능함을 확인하였다.
또한, Ujihara 등 (2005)은 단일 품종으로 구성되지 않고 혼합되어 판매되는 시중의 녹차를 구매하여, 제품 라벨지에 표기된 대로 Yabukita와 Meiryoku 품종이 실제 혼합되어 있음을 cleaved amplfied polymorphic sequence (CAPS) 마커로 확인하고, DNA 혼합비가 5 : 1과 9 : 1인 경우에도 정량분석이 가능함을 확인하였다.
본 연구에서는 10 pgㆍ㎕-1의 농도까지도 모란과 작약의 밴드가 뚜렷하게 나타나고 혼합비가 7 : 3인 모란과 작약의 DNA에서도 두 밴드가 증폭되어 육안으로 확인 가능하였다. 특히 10 pgㆍ㎕-1의 농도에서 작약에 비해 모란의 밴드가 더욱 선명했으며, 모란과 작약의 혼합 여부 판단 시 모란은 9 개의 혼합 DNA에서 밴드가 모두 나타났다. 따라서 PsPl-InDel-12는 모란의 판별에 더욱 유용할 것이라 판단된다.
소비자들의 신뢰 확보를 위한 과학적 판별 기술, 검증법이 필요한 시점에서 PsPl-InDel-12는 국내 모란과 작약의 잎과 꽃을 이용한 분석에서 종의 판별이 가능하였다. 또한, 모란과 작약의 원료 품질을 보증하고 소비자들의 원료에 대한 신뢰도 향상을 위해서, 향후 모란과 작약의 가공 제품에 대해 PsPl-InDel-12이 적용되는지 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
Acknowledgments
본 연구는 교육부와 한국연구재단의 재원으로 지원을 받아 수행된 사회맞춤형산학협력선도대학(LINC+) 육성사업과 농촌진흥청 바이오그린 연계 농생명 혁신기술개발사업(과제번호: PJ01588301)의 지원에 의하여 이루어진 결과로 이에 감사드립니다.
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