새싹 율무의 유전 독성 평가

서 언

빠른 경제 성장, 국민 소득의 증가 및 의료 기술의 발달은 삶의 편리성을 가져왔지만 서구화된 식습관으로 인해 많은 변화가 일어나면서 각종 질환과 스트레스에 시달리게 되었다. 그로 인해 건강에 대한 인식과 관심이 높아지면서, 안전하고 건강한 먹거리를 추구하는 웰빙 (well-being) 문화 확산에 따라 친환경 농산물의 소비는 지속적으로 증가하고 있다.

한국농촌경제연구원 (KREI)에 따르면 국내 친환경 농산물 시장이 연평균 5.3% 성장세를 보이고 있으며, 그 규모는 ‘20 년 약 2조 2224억 원, ‘25년 2조 6286억 원에 달할 것으로 전망되고 있다. 하지만 안전성이 확보되지 않은 식품의 과잉 섭취는 독성 및 부작용을 가져올 수 있어 심각한 사회문제를 야기할 수 있기에 이에 대한 철저한 규제 및 관리가 요구되고 있다 (Kim et al., 2006).

새싹작물은 우리나라의 대다수 지역에서 재배되고 있으며, 높은 영양학적 가치, 단기간 재배 기간, 그리고 병충해에 피해를 받기 전에 수확할 수 있어 잔류농약에 대한 우려가 없는 이점을 가지고 있다 (Kim et al., 2015; Kim et al., 2019; Lee et al., 2019). 여기서 ’새싹‘은 단기간 동안 (싹이 튼 후 7 일 가량) 종자에서 발생하는 싹으로 생육단계 초기의 어린 배축을 식용 (食用)으로 하는 것을 말한다 (Nam et al., 2018). 또한, 새싹작물을 각종 질병의 예방을 위해 약초 (藥草)로 사용되기도 한다.

대표적인 새싹작물로는 비만 개선에 좋은 새싹브로콜리, 변 비에 좋은 새싹배추, 고혈압을 낮추는 새싹순무, 혈관 질환에 사용되는 새싹메밀, 비타민이 풍부한 새싹 다채 및 피부에 좋은 새싹밀 등이 있다. 이러한 새싹작물에서의 다양한 기능성 보고는 새싹에 대한 이용 가능성을 증가시키고, 또한 다양한 작물로 확대될 것으로 예상된다 (Lee et al., 2021; Nguyen et al., 2022; Huda et al., 2023).

율무 (Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf)는 종자를 식용으로 사용하며 한방에서는 율무의 껍질을 제거한 씨를 의이인 (薏苡仁)이라고 하며 자양강장제, 진통, 소염제, 건위, 폐결핵 및 이뇨 시에 사용해 왔다 (Weng et al., 2022; Hidaka et al., 1992). 또한, 방약합편에 수재되어 있는 약재로 습비증을 낫게 하며 폐위, 손발 경련이 있을 때 쓰인다. 식품의약품 안전처 고시 “식품의 기준 및 규격”을 보면 식품원료의 곡류 (고유번호 : A가134500)에 속하며 사용 부위는 씨앗으로 되어 있다.

성미 (性味)는 무독 (無毒), 감담 (甘淡), 양 (凉)하며 곡물이지만 단백질이 16%나 높게 함유되어 있고, 주로 지질, 코익솔, 스테롤, 아미노산, 비타민 B₁ (thiamine), 비타민 B₂ (ribo- flavin) 및 코익세놀이드 (coixenolide) 등 지방산이 풍부하고 섬유질 함량이 높아 식품 및 의약품의 원료로도 사용된다 (Patel et al., 2017).

「동의보감 (東醫寶鑑)」에서는 근육통, 관절통, 방광결석 및 부종에 효과가 있다고 하였고,「본경 (本經)」에 의하면 뭉친 근육을 풀어주는 효능이 있다고 하였다 (Li et al., 2013; Kim, 2012). 또한, 식욕을 억제하는 효능으로 인해 현재 비만치료제로 널리 사용되며 혈당 강하 작용, 콜레스테롤 감소 효과가 있고 (Song et al., 2016; Lee et al., 2009) 종기나 사마귀 치료에, 대소변불통 (大小便不通), 창만 (脹滿), 중풍 (中風), 각기 (脚氣)에 큰 효험이 있는 것으로 밝혀져 있다.

최근 율무로부터 다양한 생리활성물질이 분리·동정되었는데, 항염증 작용의 benzoxazinones (Wang et al., 2012), 혈당 강 하 작용의 coixans (Otsuka et al., 1988), 그리고 항암 작용을 하는 α-monolinolein (Takahashi et al., 1986; Lee et al., 2008; Chung et al., 2011) 등이 보고되었다.

율무의 한 품종인 “조현 (Johyun)” 율무는 박피, 다수성인 “수원6호”와 조숙종이면서 기존 재배종에 비하여 단간인 ‘오카야마 재래종’을 교배한 계통을 모본으로, 조숙종이면서 다수 성인 ‘UCN300-25’를 부본으로 하여 육성한 품종이다 (Jang et al., 2005). 이러한 품종은 새싹율무를 활용한 신약개발 및 기능성 식품에 대한 연구가능성을 제시하며, 산업발전 전략에 참고가 될 수 있다.

따라서 본 실험에서는 “조현” 율무의 새싹을 식품으로 사용하기 위한 안전성 확인을 위해 “조현” 율무 새싹을 이용하여 현재 의약품 등의 독성시험기준 (식품의약품안전처고시, 제 2018-93호)에 명시되어 있는 CHO-K1 세포를 이용한 체외 염색체이상시험, 세균을 이용한 복귀돌연변이 시험 및 마우스 골수세포를 이용한 소핵시험을 통해 새싹율무의 유전 독성을 평가하였으며 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법

3. 새싹 율무의 CHO-K1 세포를 이용한 염색체 이상시험

3.1. 시험에 사용한 세포 및 실험조건

실험을 위해 Chinese hamster ovary fibroblast (CHO-K1)를 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 배양액으로 Minimum Essential Medium Eagle (Gibco, Life Technologies, Rockville, MD, USA)에 10% Fetal Bovine Serum (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1% penicillin/streptomycin (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 비율로 첨가하여 사용하였으며, 5%의 CO₂가 공급되는 37℃ 인큐 베이터 조건에서 배양하여 3 일 – 4 일마다 계대배양하였다. 배가 시간 (doubling time)은 15 시간으로 배양플라스크 바닥의 면적에 70% - 80% 이상 생육하여 염색체 수 (mode)는 22 개로 설정하였다.

염색체이상시험에 있어서 농도결정시험을 확인하기 위해 세포 독성평가를 CHO-K1세포에서 수행하여 세포증식억제 처리 농도를 결정하였다. 시험 물질은 5000 μg/㎖를 최고농도로 설정하고 공비를 2로 하여 14 개의 농도단계 (0.06, 0.13, 0.25, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 310, 630, 1250, 2500, 5000 μg/㎖)를 적용하여 시험 수행을 위한 최고농도를 결정하였다.

세포독성 지표인 상대 세포수 증가 (RICC, relative increase in cell counts)는 세포 생존수를 계수하였을 때, (55±5)% 이하에서 세포 독성 농도를 산출하였다. RICC⁵⁵는 혈구계수기를 이용하여 배양용기 당 세포 생존수를 계측하여 세포수를 산출하였고, 용매 대조군의 세포수를 100%로 설정하고 세포 증식 률을 산출하였다.

$$ \mathrm{R}\mathrm{I}\mathrm{C}\mathrm{C}\mathrm{ }\left(\mathrm{R}\mathrm{e}\mathrm{l}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{v}\mathrm{e}\mathrm{ }\mathrm{i}\mathrm{n}\mathrm{c}\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{a}\mathrm{s}\mathrm{e}\mathrm{ }\mathrm{i}\mathrm{n}\mathrm{ }\mathrm{c}\mathrm{e}\mathrm{l}\mathrm{l}\mathrm{ }\mathrm{c}\mathrm{o}\mathrm{u}\mathrm{n}\mathrm{t}\right)=\frac{No. of treated cells}{No.of control cells}\times 100$$

농도결정시험 결과 대사활성계 존재 6 시간 처리군 (+S9 mix)은 0.63 ㎎/㎖, 부재 6 시간 처리군 (-S9 mix)은 1.25 ㎎/㎖, 부재 22 시간 처리군 (-S9 mix)은 0.08 ㎎/㎖으로 RICC₅₅ 농도를 산출하였다.

그 결과에 따라 새싹 율무 농도를 대사활성계 존재 6 시간 처리군은 (0.04 ㎎/㎖, 0.16 ㎎/㎖, 0.63 ㎎/㎖)로, 대사활성계 부재 6 시간 처리군은 (0.08 ㎎/㎖, 0.31 ㎎/㎖, 1.25 ㎎/㎖)로, 대사활성계 부재 22 시간 처리군은 (0.005 ㎎/㎖, 0.02 ㎎/㎖, 0.08 ㎎/㎖)로 설정하여 본 실험을 수행하였다 (Table 1). 새싹 율무는 증류수에 현탁시켜 단계 희석하여 진행하였다.

Table 1.

Cytotoxicity data of Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf sprout extract for dose-determination on Chinese hamster ovary fibroblast.

음성대조군은 시료 대신 증류수를 사용하고, 양성대조군은 대사활성계의 존재 (+S9 mix)하에 cyclophophamide (CPA, Tocris Bioscience, Bristol, England)로 10 μg/㎖을 처리하고, 대사활성계의 비존재군 (-S9 mix)은 mitomycin C (MMC, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)로 0.5 μg/㎖ (6 시간)와 0.15 μg/㎖ (22 시간)로 각각 처리하였다.

염색체이상시험에서 새싹 율무의 6 시간 처리군은 25T culture flask (SLP, Pocheon, Korea)에 2 × 10⁵ 개의 세포를 분주하여 세포배양액 5 ㎖에서 약 3 일간 배양하였다. 그 후, 시료 처리 전에 각 플라스크의 기존배양액을 제거하고 농도의 시험 물질 용액 0.5 ㎖ (+S9 mix) / 5 ㎖ (새싹 율무 0.25 ㎖, 배양액 4.25 ㎖)을 분주하였다. 대사활성계의 존재군 (+S9 mix)은 6 시간의 처리를 하였고, 대사활성계의 비존재군 (-S9 mix)은 0 ㎖ (S9 mix) / 5 ㎖만 첨가하였다. 6 시간 후 phosphate buffered saline (PBS)로 세포 표면을 1 회 세척한 후 새로운 배지 5 ㎖ 첨가하여 16 시간 추가 배양하였다.

새싹 율무 22 시간 처리군은 25T culture flask용기에 2 × 10⁵ 개의 세포를 분주하여 세포배양액 5 ㎖에서 약 3 일간 배 양하였다. 그 후, 각 플라스크의 기존배양액을 제거하여 농도의 시험 물질 용액 0.5 ㎖ (S9 mix) / 5 ㎖ (새싹 율무 0.25 ㎖, 배양액 4.25 ㎖)을 첨가하여 22 시간 동안 배양하였다.

3.2. 염색체표본슬라이드 제작

모든 plate 샘플에서 시험 물질 처리 약 22 시간 후에 colcemid를 100 ㎕ (0.2 ㎍/㎖) 씩 처리한 다음 2 시간 경과 후 세포를 수거하였다. 150 × g으로 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 37℃, 75 mM KCl 저장액을 첨가하여 15 분 간 incubation하였다.

Carnoy’s 고정액 (acetic acid : methanol = 1 : 3)을 세포에 처리하여 고정시켜 염색체 표본을 제작하고 3% Giemsa (Merck, Darmstadt, Germany) 액으로 약 15 분간 염색한 후 염색체 이상을 계수하였다.

3.3. 염색체 이상의 계수

농도당 300 개의 분열중기세포를 코드화한 표본을 이용한 BLIND 방법으로 관찰하였으며, 일본환경돌연변이학회 (Japanese Environmental Mutagen and Genome Society, JEMS) 포유동물시험분과회판 “염색체이상 아틀라스 (JEMS-MMS, 1988)”에 따라 염색체 이상의 계수 및 형태 판별을 분류하였다.

염색체의 이상은 구조적 이상 [염색체형의 절단 (chromosome break, csb) 및 교환 (chromosome exchange, cse)과 염색분체형의 절단 (chromatid break, ctb) 및 교환 (chromatid exchange, cte)]과 수적 이상으로 구분하여 계수하였다. 염색체 구조적 이상에 있어서 염색체형의 절단은 동원체를 갖지 않는 염색체가 있기 때문에 이상중기상 (aberrant metaphases)의 염색체 이상의 수 (total aberration) 및 빈도는 gap의 빈도만 기록하고 양성판정에는 포함시키지 않았다.

3.4. 통계 분석

이상중기상 (aberrant metaphases)의 빈도에 대한 통계처리는 OECD Guidelines, Testing of Chemicals No. 473을 참조하여 gap을 제외한 숫자만을 대상으로 실시하였다 (OECD, 2014).

각각의 중기상 (metaphase)을 1 개 이상의 이상을 포함한 것 (aberrant metaphases)과 염색체 이상이 없는 것 (normal metaphase)으로 나누고, 이상중기상의 빈도에 대해 통계처리를 실시하였다. 또한 수정이상에 대해서는 각 중기상을 핵내 배화 (ER, endoreduplication) 및 배수체 (PP, polyploidy)를 계수하여 그 빈도에 대하여 이상중기상과 동일한 방법으로 통계 처리하였다.

실험데이터의 통계분석은 SPSS version 19.0k (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하였고 유의수준은 0.01에서 Chisquare test 및 Fisher’s exact test를 실시하였다. 유의성이 있는 경우 Cochran-Armitage trend test를 통해 염색체 이상의 발생 빈도에 대한 용량의존성을 확인하였다.

결 과

1. 새싹 율무의 염색체 이상 시험

새싹 율무의 염색체이상 유발성 유무를 확인하기 위하여 난 소유아세포 (CHO-K1)를 이용하여 대사활성계의 부재 (-S9 mix)와 존재 (+S9 mix)하에서 농도결정시험 결과를 바탕으로 관련 시험법에 따라 55±5%의 세포독성이 나타나며 중기염색체 관찰이 가능한 농도를 최고 농도로 하여, 세포독성이 나타나는 중간 농도와 세포독성이 없는 농도를 본시험 농도로 설정하였다.

농도결정시험 결과, 대사활성계 존재 6 시간 처리군 (+S9 mix)은 0.63 ㎎/㎖, 부재 6 시간 처리군 (-S9 mix)은 1.25 ㎎/㎖, 부재 22 시간 처리군 (-S9 mix)은 0.08 ㎎/㎖의 농도에서 55±5%의 세포증식억제율이 나타났으며, 중기염색체의 관찰도 가능하였다. 이 농도를 최고농도로 하고 공비 4의 3 단계로 본시험의 농도를 다음과 같이 설정하였다 (Table 1).

대사활성계 존재 (+S9 mix, 6시간 처리군) : 0.04, 0.16, 0.63 ㎎/㎖

대사활성계 부재 (-S9 mix, 6시간 처리군) : 0.08, 0.31, 1.25 ㎎/㎖

대사활성계 부재 (-S9 mix, 22시간 처리군) : 0.005, 0.02, 0.08 ㎎/㎖

염색체이상시험 결과, 대사활성계 존재 (+S9 mix) 6 시간 처리군에서의 0, 0.04, 0.16, 0.63 ㎎/㎖ 농도에서 각각 0.0, 0.0, 0.3%로 관찰되었으며, 수적이상세포의 출현빈도는 각각 0.7, 0.7, 0.7%로 관찰되었고 (Table 2 and Fig. 1), 대사활성계 부재 (-S9 mix) 6 시간 처리군에서의 0.06, 0.31, 1.25 ㎎/㎖ 농도에서 각각 0, 0.3, 0.3%로 관찰되었으며, 수적이상 세포의 출현빈도는 각각 1.3, 1.3, 1%로 관찰되었다 (Table 3 and Fig. 2). 또한, 대사활성계 부재 (+S9 mix) 22 시간 처리 군에서의 0.005, 0.02, 0.08 ㎎/㎖ 농도에서는 각각 0.0, 0.0, 0.3%로 관찰되었으며 (Table 4 and Fig. 3), 수적이상세포의 출현빈도는 각각 0.7, 1.0, 1.0%로 관찰되었다.

Table 2.

Metaphase analysis in the presence of S9 mix with Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf sprout.

Table 3.

Metaphase analysis in the absence of S9 mix with Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf sprout.

Table 4.

Metaphases analysis in the absence of S9 mix with Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf sprout.

Fig. 1.

Frequency of aberrant metaphases for Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf sprout at 6 hrs treatment with S9 mix.(A); numerically aberrant metaphases (B); structurally aberrant metaphases.

Fig. 2.

Frequency of aberrant metaphases for Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf sprout at 6 hrs treatment without S9 mix.(A); numerically aberrant metaphases (B); structurally aberrant metaphses.

Fig. 3.

Frequency of aberrant metaphases for Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf sprout at 22 hrs treatment without S9 mix.(A); numerically aberrant metaphases (B); structurally aberrant metaphases.

따라서 대사활성계 존재 (+S9 mix) 6 시간 처리군에서 염색체의 구조적 및 수적 이상 빈도가 용매 대조군과 비교하여 유의한 차이가 확인되지 않았고, 대사활성계 부재 (+S9 mix) 6 시간 처리군에서도 3 단계 농도에서 염색체의 구조적 및 수적 이상 빈도가 용매 대조군과 비교하였을 시 유의한 차이가 확인되지 않았다. 그리고 대사활성계 부재 (-S9 mix) 22 시간 처리군의 경우 3 단계 농도에서 염색체의 구조적 및 수적 이상 빈도가 용매 대조군과 비교하여 유의한 차이가 확인되지 않았다.

본 시험에 있어서 양성대조물질에 의한 구조적 염색체이상 발생빈도가 모든 처리군에서 용매 대조군과 비교하여 유의하게 높은 것으로 (p < 0.01) 관찰되었으며, 음성 (용매) 대조값 및 양성 대조값은 시험시설의 적정범위 내였으므로 본 시험의 조건이 적절한 것으로 확인되었다. 이상의 결과에 따라 본 시험 조건 하에서 시험 물질인 새싹 율무는 CHO-K1 세포에 구조적 및 수적 염색체 이상을 유발하지 않는 것으로 판단되었다.

2. 새싹 율무의 세균을 이용한 복귀돌연변이시험 평가

새싹 율무의 발암성 유발 유·무 판단을 위한 자료를 얻기 위하여 박테리아에 대한 복귀돌연변이시험을 실시하였으며, 시험에는 히스티딘 요구성 균주인 Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1547과 트립토판 요구성 균주인 Escherichia coli WP2 uvrA를 포함한 총 5 균주를 이용하여 복귀돌연변이시험을 실시하였다.

용매 대조군 및 시험 물질 첨가 5 단계의 농도 0, 61.7, 185, 556, 1670, 그리고 5000 ㎍/plate로 농도결정시험을 실시하였다. 그 결과, 대사활성계 존재 유무와 관계없이 모든 균주에서 복귀돌연변이 집락수의 증가가 관찰되지 않았다. 또한, 50% 이상의 복귀돌연변이 집락수 감소와 background lawn이 엷어지는 명백한 세포독성 또한 모든 plate에서 나타나지 않았다.

시험 물질을 Top agar에 첨가하였을 때 대사활성계 존재 유무와 관계없이 시험 물질의 침전 및 결정이 1670, 5000 ㎍/ plate의 농도에서 관찰되었으며 plate 중충 후에도 시험 물질의 침전 및 결정이 관찰되었으나, 콜로니 계수에는 영향을 미치지 않았다. 따라서 본 시험의 농도는 해당 시험법에 따라 대사활성계 적용 유무와 상관없이 5000 ㎍/plate의 농도를 최고 농도로 설정하고 0, 61.7, 185, 556, 1670, 5000 ㎍/plate (TA98, TA100, TA1535, TA1537, WP2 uvrA)의 농도로 실 시하였다 (Table 5).

Table 5.

Range-finding study of Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf sprout with and without metabolic activation.

본 시험 결과, 대사활성계 적용 유무와 상관없이 용매 대조군과 비교 시, 5 개의 모든 균주 및 모든 농도에서 복귀돌연변이 집락수 및 용량 의존성에 따른 증가가 나타나지 않음을 확인하였다. 또한, 농도결정시험과 본 시험의 양성 대조군 및 용매 대조군의 콜로니 수는 시험시설의 적정범위 내로 확인되었다. 또한, 각 균별 양성대조군의 콜로니빈도가 음성대조군보다 약 2 배 – 36 배 높은 것으로 확인되어 시험이 적합하게 수행되었음을 확인하였다 (Table 6).

Table 6.

Main study Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf sprout with and without metabolic activation.

이상의 결과에 따라 본 시험 조건 하에서 시험 물질인 새싹 율무는 상기의 5 개 균주에 대하여 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 판단되었다.

3. 새싹 율무의 소핵실험 평가

투여에 의한 군간 체중을 관찰한 결과 용매 대조군에서 34.4 ± 1.65 g, 500 ㎎/㎖ 투여군에서는 33.8 ± 1.47 g, 1000 ㎎/㎖ 투여군에서는 32.9 ± 1.11 g, 2000 ㎎/㎖ 투여군에서는 34.7 ± 1.76 g, 양성 대조군에서 34.2 ± 0.72 g으로 유의한 차이가 없었다 (Table 7 and Table 8).

Table 7.

Clinical signs and body weight changes after administration.

Table 8.

Observations of micronucleus after administration.

동물 개체별로 500개의 전체 적혈구 중 다염성 적혈구 (MNPCE / 4,000 PCE)의 평균 비율에 있어서 모든 투여군의 평균 비율이 용매 투여군과 비교하여 유의성은 없었다. 또한 전체 적혈구 4000 개 중 다염성 적혈구의 비율 비교에 있어서 시험 물질 투여군과 용매 대조군간 평균 차이의 유의성이 없었다. 또한 동물 개체별로 4000 개의 다염성적혈구에서 관찰한 소핵 출현 적혈구의 평균 빈도는 0.11 ± 0.034 g, 500 ㎎/㎖ 투여군에서는 0.11 ± 0.041 g, 1000 ㎎/㎖ 투여군에서는 0.09 ± 0.038 g, 2000 ㎎/㎖ 투여군에서는 0.08 ± 0.011 g, 양성 대조군에서 0.08 ± 0.011 g로 관찰되었다.

통계 결과, 소핵 출현 적혈구의 평균 빈도는 용매 대조군과 비교하여 유의성이 없었다. 또한, 시험 물질 투여군들에 있어서 시험 물질에 의한 용량의존성 반응이 없었다. 또한, 양성 대조군은 용매 대조군의 다염성 적혈구에서 관찰한 소핵 출현 적혈구의 평균 빈도보다 유의하게 높은 것으로 관찰되어 (p < 0.05) 시험 물질의 소핵 출현 빈도 확인을 위한 시험 조건이 적절한 것으로 확인되었다. 이상의 결과에 따라 본 시험 조건 하에서 시험 물질인 새싹 율무는 설치류 조혈세포에 대하여 소핵을 유발하지 않는 것으로 판단되었다.

고 찰

새싹 율무의 약리학적 우수성으로 영약적 가치를 증대시키는 시도가 이루어지고 있음에도 불구하고, 새싹 율무에 대한 안전성 연구 데이터는 전무한 실정이다.

동의보감에 수재되어 있는 약재로 최근 새싹 율무의 식물화 학적 성분 및 항산화 활성을 통해 여러 효능이 증명된 바 있으며 새싹 율무 원방의 안전성이 밝혀진 바 있다. 따라서, 본 시험에서 유전독성연구는 OECD와 KFDA 지침에 따라 복귀돌연변이시험, 염색체이상시험 및 마우스 골수세포를 이용한 소핵시험을 통하여 새싹 율무의 안전성을 확보하고자 하였다.

염색체이상시험에서 CHO-K1 세포주를 이용하였으며, 본 시험의 용량 설정을 위한 예비실험 결과 RICC₅₅ 농도가 대사활 성계 존재하에서는 세균을 이용한 복귀돌연변이시험은 새싹 율무 처리군에서 S9 mix 존재 유무에 상관없이 복귀돌연변이 콜로니 수는 음성 대조군과 비교하였을 때, 증가 양상을 나타 내지 않은 반면에 양성 대조물질에서 유발된 복귀돌연변이 콜로니 수는 대사활성계 미적용 (S9-) 및 적용 (S9+)의 모든 시험 균주에 대하여 음성 (용매) 대조 값이 증가하는 것으로 나타났다.

염색체 이상 시험에서 새싹 율무 처리군은 세포주의 처리시간 및 S9 mix 처리 유무에 상관없이 5% 미만 비정상적인 염색체이상을 나타내었지만, 음성 대조군에 비해 유의적인 변화는 없었다. 소핵시험은 새싹 율무 처리군에서 음성 대조군과 비교 시에 소핵을 가진 다염성 적혈구의 증가를 관찰할 수 없었으며 통계학적 유의성도 나타나지 않았다.

본시험 결과, 대사활성계존재 6 시간 처리군, 대사활성계 부재 6 시간 처리군 및 대사활성계 부재 22 시간 처리군 등 모두에서 염색체의 수적 및 구조적 이상 빈도가 용매 대조군과 비교하여 유의한 차이가 확인되지 않았다. 이상의 결과에 따라 시험 물질인 새싹 율무는 수적 및 구조적 염색체이상을 유발하지 않는 것으로 사료된다.

본 시험 물질인 새싹 율무의 미생물 복귀돌연변이 시험을 확 인하기 위해 히스티딘 요구성 균주인 Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537과 트립토판 요구성 균주 Escherichia coli WP2uvrA 총 5 개의 균주를 이용하여 복귀돌연변이시험을 실시하였다. 용매 대조군 및 시험 물질 첨가 5 단계의 농도 0, 61.7, 185, 556, 1670, 그리고 5000 ㎍/ plate로 농도결정시험을 실시한 결과, 모든 농도에서 명백한 세포독성은 관찰되지 않았다. 따라서 본 시험은 대사활성계 미적용 및 적용 (0, 61.7, 185, 556, 1670, 그리고 5000 ㎍/plate로 TA98, TA100, TA1535, TA1537 그리고 WP2uvrA 균주를 가지고 실시하였으며, 그 결과, 대사활성계 적용 유무와 관계 없이 모든 균주의 모든 농도에서 콜로니 생성 수치의 재현성 있는 증가가 나타나지 않았으며, 용량의존성도 확인되지 않았다. 농도결정시험과 본 시험의 결과 값으로 시험의 재현성이 확인되었다. 농도결정시험과 본 시험의 용매 대조군 및 양성 대조군의 콜로니 수는 시험시설의 적정범위 내로 확인되었으며, 각 균별 양성 대조군의 콜로니 빈도가 음성 대조군보다 약 2 ∼ 36배 높은 것으로 확인되어 시험이 적합하게 수행되었음을 확인하였다. 이상의 결과에 따라 시험 물질인 새싹 율무는 상기 5개 균주에 대하여 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 사료된다.

유전독성을 평가하기 위하여 ICR 마우스 8 주령의 조혈세포를 이용한 체내 소핵시험을 실시하였으며, 예비시험 결과, 모든 시험 물질 투여군에서 사망동물 및 일반증상의 이상증상 이 관찰되지 않았다. 투여에 의한 군간 체중 및 동물개체별로 500 개의 전체 적혈구 중 다염성 적혈구의 평균비율을 관찰한 결과, 용매 대조군과 비교하여 유의한 차이는 없었다. 예비시험의 결과를 기초로 2000 ㎎/kg를 최고 투여농도로 하여 본 시험을 실시하였다. 시험 물질의 흡수 후, 48 시간까지의 소핵 출현 빈도를 관찰하기 위하여 시험 물질을 2 일간 투여하였다. 본시험 결과, 시험 물질 투여군(500 ㎎/㎏, 1000 ㎎/㎏, 2000 ㎎/㎏)에서 전체 적혈구 중 다염성 적혈구의 수는 용매 대조군과 비교하여 뚜렷한 골수세포의 증식억제는 나타나지 않았으며, 시험 물질 투여군들에 있어서 시험 물질에 의한 용량의 존성 반응이 없었다. 개체 당 약 4,000 개의 다염성 적혈구에서 관찰한 소핵유발빈도 역시 용매 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 결과를 보이지 않았으며 시험 물질 투여군들에 있어서 시험 물질에 의한 용량의존성 반응이 없었다. 한편 양성 대조군은 소핵유발빈도에서 용매 대조군에 비해 통계적으로 유의하며 현저한 증가를 보였다. 시험 물질 투여 후 모든 투여군에서 용매 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이는 없었지만 다염성 적혈구에서 관찰한 소핵 출현 적혈구의 평균 빈도는 유의하게 (p < 0.05) 높아 시험 물질의 소핵 출현 빈도 확인을 위한 시험조건이 적절한 것으로 판단되었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 시험 물질인 새싹 율무는 설치류 조혈세포에 대하여 소핵형성에 영향을 주지 않는 것으로 사료된다. 소핵시험은 새싹 율무 처리군에서 음성 대조군과 비교 시에 소핵을 가진 다염성 적혈구의 증가를 관찰할 수 없었으며 통계학적 유의성도 나타나지 않았다.

상기의 결과를 종합하면 새싹 율무는 염색체이상시험, 미생물 복귀돌연변이시험 및 소핵시험 전체의 결과에서 안전성이 뒷받침되며 비교적 안전한 약물로 판단할 수 있다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 연구사업(과제번호: PJ014251022019) 및 2024년도 과학기술정보통신부 연구사업(과제번호: 2018R1A5A2025272)의 재원에 의해 한국연구재단의 지원으로 이루어진 결과로 이에 감사드립니다.

References

• Chung CP, Hsu CY, Lin JH, Kuo YH, Chiang W and Lin YL. (2011). Antiproliferative lactams and spiroenone from adlay bran in human breast cancer cell lines. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59:1185-1194. [https://doi.org/10.1021/jf104088x]
• Hidaka Y, Kaneda T, Amino N and Miyai K. (1992). Chinese medicine, Coix seeds increase peripheral cytotoxic T and NK cells. Biotherapy. 5:201-203 [https://doi.org/10.1007/BF02171052]
• Huda MN, Li X, Jahan T, He Y, Guan C, Zhang K, Gao A, Georgiev MI and Zhou M. (2023). Acceleration of the genetic gain for nutraceutical improvement of adlay(Coix L.) through genomic approaches: Current status and future prospects. Food Reviews International. 39:5377-5401. [https://doi.org/10.1080/87559129.2022.2067175]
• Jang JH, Yi ES, Choi BY, Kim IJ, Park JS, Kim SK and Kim HD. (2005). New variety “Johyun” of Coix lachryma-jobi var. mayuen Stapf with early maturity and short plant height. Korean Journal of Medicinal Crop Science. 13:122-125.
• Japanese Environmental Mutagen Society-Mammalian Mutagenicity Study Group(JEMS-MMS). (1988) Atlas of chromosome aberration by chemicals. Mammalian Mutagenicity Study Group, Japanese Environmental Mutagen Society. Tokyo, Japan. https://www.j-ems.org/groups/mms.html, (cited by 2024 June 24).
• Kim JD. (2012). Literature on the quality and effect of Job’s tears(Coix Lachryma-jobi. var. mayuen S.). Korean Journal of Agricultural History Society. 11:89-122.
• Kim JS, Cho JS and Lee CH. (2015). Effect of environmental factors on sprout germination, growth, and storage of six Aster species. Horticulatural Science and Techonology. 33:638-646 [https://doi.org/10.7235/hort.2015.14147]
• Kim JY, Kim JY, Jenis J, Li ZP, Ban YJ, Baiseitova A and Park KH. (2019). Tyrosinase inhibitory study of flavonolignans from the seeds of Silybum marianum(milk thistle). Bioorganic and Medicinal Chemistry. 27:2499-2507 [https://doi.org/10.1016/j.bmc.2019.03.013]
• Kim JY, Lee MK, Hwang BS, Kim GC and Hwang IG. (2019). Antioxidant activity and tyrosinase inhibitory activities of Codonopsis lancerolata extreact and solvent fraction. Korean Journal of Food Nutrition. 32:611-619.
• Kim YJ, Park HT and Han HS. (2006). A study on the production and marketing of sprouts and leaf vegetables. Korea Rural Economic Ins. 26:5-6
• Lee HJ, Chung MJ, Kim DJ and Choe M. (2009). Effects of Oenanthe javanica, Coicis lachryma-jobi L. var., and Plantaginis asiatica L. water extracts on activities of key enzymes on lipid metabolism. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition. 38:1516-1521. [https://doi.org/10.3746/jkfn.2009.38.11.1516]
• Lee HJ, Lee JH, Jung JT, Lee YJ, Oh MW, Chang JK, Jeong HS and Park CG. (2019). Changes in free sugar, coixol contents and antioxidant activities of adlay sprout(Coix lacryma-jobi L.var. ma-yuen Stapf.) according to different growth stage. Korean Journal of Medicinal Crop Science. 27:339-347 [https://doi.org/10.7783/KJMCS.2019.27.5.339]
• Lee MY, Lin HY, Cheng F, Chiang W and Kuo YH. (2008). Isolation and characterization of new lactam compounds that inhibit lung and colon cancer cells from adlay(Coix lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf) bran. Food and Chemical Toxicology. 46:1933-1939. [https://doi.org/10.1016/j.fct.2008.01.033]
• Lee SH, Eun CH, Baek JH and Kim IJ. (2021). Adipocyte differentiation inhibition, whitening, antibacterial and antioxidant activities of extracts from Aloe vera by-product. Journal of Applied Biological Chemistry. 64:171-176 [https://doi.org/10.3839/jabc.2021.025]
• Li PC, Tsai WH and Chien CT. (2013). Dietary Monascus adlay supplements facilitates suppression of cigarette smoke-induced pulmonary endoplasmic reticulum stress, autophagy, apoptosis and emphysema-related PLGF in rat. Food Chemistry. 136:765-774. [https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.08.007]
• Maron DM and Ames BN. (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects. 113:173-215. [https://doi.org/10.1016/0165-1161(83)90010-9]
• Nam TG, Kim DO and Eom SH. (2018) Effects of light sources on major flavonoids and antioxidant activity in common buckwheat sprouts. Food Science and Biotechnology. 27:169-176. [https://doi.org/10.1007/s10068-017-0204-1]
• Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). (2014). OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. No. 473. In vitro mammalian chromosomal aberration test. Organisation for Economic Co-operation and Development. Paris, France. https://www.oecd.org/env/test-no-473-in-vitro-mammalian-chromosomal-aberration-test-9789264264649-en.htm, (cited by 2024 June 24).
• Otsuka H, Hirai Y, Nagao T and Yamasaki K. (1988). Anti-inflammatory activity of benzoxazinoids from roots of Coix lachryma-joby var. ma-yuen. Journal of Natural Products. 51:74-79. [https://doi.org/10.1021/np50055a009]
• Patel B, Patel G, Shah S and Parmar S. (2017). A Review: Coix lacryma jobi L. Research Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry. 9:248-252. [https://doi.org/10.5958/0975-4385.2017.00046.2]
• Song MY, Jung HW and Park YK. (2016). Antiobesity effect of water extract of Coix lachrymajobi var. mayuen in high fat fed C5BL/6 mice. Journal of Korean Medicine Obesity Research. 16:27-35 [https://doi.org/10.15429/jkomor.2016.16.1.27]
• Takahashi M, Konno C and Hikino H. (1986). Isolation and hypoglycemic activity of coixans A, B and C, glycans of Coix lachryma-jobi var. ma-yuen seeds. Planta Medica. 52:64-65. [https://doi.org/10.1055/s-2007-969074]
• Vogel HJ and Bonner DM. (1956) Acetylornithinase of Eschericki coli: Partia1 purification and some properties. Journal of Biological Chemistry. 218:97-106. [https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)65874-0]
• Wang L, Sun J, Yi Q, Wang X and Ju X. (2012). Protective effect of polyphenols extract of adlay(Coix lachryma-jobi L. var. mayuen Stapf) on hypercholesterolemia-induced oxidative stress in rats. Molecules. 17:8886-8897. [https://doi.org/10.3390/molecules17088886]
• Weng WF, Peng Y, Pan X, Yan J, Li XD, Liao ZY and Zhou ML. (2022). Adlay, an ancient functional plant with nutritional quality, improves human health. Frontiers in Nutrition. 9:1019375. https://www.frontiersin.org/journals/nutrition/articles/10.3389/fnut.2022.1019375/full, (cited by 2024 July 03). [https://doi.org/10.3389/fnut.2022.1019375]