Current Issue

Korean Journal of Medicinal Crop Science - Vol. 28 , No. 6

[ Research Articles ]
Korean Journal of Medicinal Crop Science - Vol. 28, No. 6, pp.428-434
Abbreviation: Korean J. Medicinal Crop Sci
ISSN: 1225-9306 (Print) 2288-0186 (Online)
Print publication date 31 Dec 2020
Received 29 Sep 2020 Revised 09 Nov 2020 Accepted 09 Nov 2020
DOI: https://doi.org/10.7783/KJMCS.2020.28.6.428

유산균으로 발효한 황기 잎 추출물의 이화학적 특성 및 항산화 활성
송빛나1이다빈2이성현3박보람4최지호5김용석6박신영7,
1농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 발효가공식품과 연구원
2농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 발효가공식품과 연구원
3농촌진흥청 국립농업과학원 기능성식품과 연구관
4농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 발효가공식품과 연구사
5농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 발효가공식품과 연구관
6전북대학교 식품공학과 교수
7농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 발효가공식품과 연구사

Physicochemical Properties and Antioxidant Activity of Extract from Astragalus membranaceus Bunge Leaf Fermented with Lactic Acid Bacteria
Bit Na Song1Da Bin Lee2Sung Hyun Lee3Bo Ram Park4Ji Ho Choi5Yong Suk Kim6Shin Young Park7,
1Researcher, Fermentated Processing Food Science Division, NIAS, RDA, Wanju 55365, Korea
2Researcher, Fermentated Processing Food Science Division, NIAS, RDA, Wanju 55365, Korea
3Researcher, Functional Food & Nutrition Division, NIAS, RDA, Wanju 55365, Korea
4Researcher, Fermentated Processing Food Science Division, NIAS, RDA, Wanju 55365, Korea
5Researcher, Fermentated Processing Food Science Division, NIAS, RDA, Wanju 55365, Korea
6Professor, Department of Food Science and Technology, Chonbuk National University, Jeonju 54896, Korea
7Researcher, Fermentated Processing Food Science Division, NIAS, RDA, Wanju 55365, Korea
Correspondence to : (Phone) +82-63-238-3641 (E-mail) soyoenj@korea.kr


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ABSTRACT
Background:

This study aimed to investigate the quality characteristics of Astragalus membranaceus Bunge leaf (AMBL) fermented with lactic acid bacteria and the applicability of its biologically active compounds.

Methods and Results:

An assessment of physicochemical properties such as pH, total acidity, free sugars, and isoflavonoid (calycosin-7-o-β-d-glucoside, ononin, calycosin, and formononetin) was conducted. Furthermore, the levels of antioxidant compounds, including polyphenols and flavonoids, and radical scavenging activities of the extracts using 2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazylhydrate and 2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) were investigated. The calycosin content in the water extract of AMBL fermented with Leuconostoc mesenteroides increased by approximately twice as much as the control.

Conclusions:

These results indicate that L. mesenteroides can be used to improve biological activity through fermentation, and that AMBL can be used as a functional materials and edible resource in industrial areas.


KeyWords: Astragalus membranaceus Bunge, Leaf, Antioxidant Activities, Fermentation, Lactic Acid Bacteria

서 언

황기 (Astragalus membranaceus Bunge)는 콩과 (Leguminosae)에 속하는 다년생 초본으로 주로 Astragalus membranaceus의 뿌리를 일컫는다. 황기의 뿌리는 다당류, 사포닌, 플라보노이드, 아미노산과 미량원소 등의 약리작용을 하는 다양한 성분이 함유되어 있어 면역증강을 비롯하여 생리적 활성 증진을 위해 임상에서 응용되어 왔다 (Kitagawa et al., 1983; He and Findlay, 1991; Toda and Shirataki, 1999; Jeon et al., 2010). 특히 황기 뿌리에는 이형다당류 (heteropolysaccharide)와 astrogaloside I - IV 등이 풍부하게 존재하며 이들은 면역조절 기능에 기인하여 근래에 약물개발 분야에서 많은 관심을 받고 있다 (Zhong et al., 2012).

황기속 식물인 Astragalus vulneraria의 연구결과 지상부에서 새로운 flavonol glycoside인 isorhamnetin 3-o-β-Dapiofuranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-galactopyranoside와 isorhamnetin 3-o-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-galactopyranoside를 분리하였다 (Bedir et al., 2000). 또한 몽고황기 (A. membranaceus var. mongholicus)의 지상부로부터 2 개의 새로운 cycloartane-type의 사포닌인 mongholicoside A와 B는 분리 보고되었다 (Yu et al., 2007).

황기 지상부와 지하부에서 astrogaloside I - IV 등의 사포닌 성분을 비교한 결과 지상부에서 일부 astrogaloside의 함량은 지하부와 유사하거나 지하부 보다 더 높은 수준으로 나타난다고 보고하였다 (Kim et al., 2012). 최근 연구에 의하면 황기의 지상부는 지하부 보다 더 높은 수준의 페놀성 화합물을 포함하고 있으며 페놀성 화합물 중에서도 phenolic acid (chlorogenic, caffeic, ferulic, p-coumaric)보다 flavonoids (formononetin 및 quercetin, rutin, quercitrin, isorhamnetin, kaempferol, luteolin)가 더 높은 비율로 포함되어져 있음을 보고되고 있다 (Jun et al., 2012). Isoflavonoid 성분은 식물성 유사호르몬 (phytoestrogen)의 일종으로 에스트로겐과 구조적유사성을 가지며, 작용도 유사하여 여성호르몬의 천연 대체물질로서 알려져 있고, 특히 이들은 항산화효과, 미백 및 주름개선 등의 노화방지 효과를 가지고 있으며, 천연물에서 추출되어 다양한 방면으로 응용되어지고 있다 (Kim et al., 2007).

최근에는 황기 싹이 항주름 및 항알러지 효능의 증진을 확인하여 화장품 소재로서 가능성이 있다고 확인되었다 (Jung, 2018). 최근 천연물 등 다양한 기질에서도 자랄 수 있는 미생물을 활용해 고체발효 함으로써 발효 대상 기질을 그대로 이용해 생물 전환 효율을 높이는 기술을 사용하고 있다 (Bae et al., 2004). 이는 미생물이 식물체에서 생물 전환 작용을 하여, 2차 대사산물의 기능성을 구명하는 연구가 진행되고 있으며, 섬유소 및 각종 천연물을 분해 및 변환하는 능력이 우수하므로 대부분 식물유래 천연물질을 발효 대상으로 사용할 수 있는 장점이 있기 때문이다 (Cho et al., 2006).

유산균, 효모, 곰팡이 등의 미생물을 이용한 발효 기술의 연구로 다당체, 올리고당, 아미노산 펩타이드 등의 발효 산물을 얻고, 상호 간의 시너지 작용으로 생리활성 효능이 상승된다는 연구가 많이 진행되고 있다 (Ahn et al., 2013). 유산균은 발효를 통해 젖산 및 여러 가지 대사산물을 생산하는 미생물로 각종 발효식품, 건강기능식품, 의약품, 사료 첨가제 등으로 광범위하게 이용되고 있으며, 최근에는 건강 증진 및 질병 예방의 특징을 가지는 probiotics 균주에 대한 연구와 응용이 증가되고 있다 (Kim and Lim, 2018). 대표적인 유산균인 Lactobacillius sp.는 β-glucosidase 활성을 가지고 있어 다양한 식물 배당체의 장내가수분해에 있어 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Choi et al., 1999).

그러나 지금까지 황기의 잎을 포함한 지상부는 황기의 지하부 못지 않는 생리 및 약리적 효능이 있음에도 불구하고 황기의 지하부의 생육을 위해 재배하는 동안 가지치기를 통해 제거되어 왔다. 황기와 같은 근류 혹은 근경류를 사용하는 약용작물의 경우 부가가치가 높은 상태로 지하부를 수확하기 위해서는 파종 후 수확까지 장기간이 소요되는 단점을 가지고 있다. 반면 지상부의 경우 재배 기간 동안 수시로 수확이 가능하다는 장점을 가지고 있으며 현재 대부분 폐기되고 있는 현실을 고려할 때 잉여자원의 재이용이라고 하는 장점을 가지고 있다. 이러한 황기 지상부의 활용도를 증가시키기 위한 연구가 필요한 실정이다.

따라서, 본 연구에서는 유산균으로 황기 잎을 발효하여 기능성뿐만 아니라 이용성을 증가시킨 식품 개발과 더불어 다양한 용도로 쓰일 수 있는 소재를 개발하기 위한 기초자료로 제공하고자 하였다.


재료 및 방법
1. 실험재료

본 실험에 사용된 균주는 국립농업과학원 발효가공식품과 (Wanju, Korea)에서 분리한 Lactobacillus brevis E3-8 (KACC 92213P), Leuconostoc mesenteroides N12-4, L. plantarum N56-12를 사용하였으며, 황기 (Astragalus membranaceus Bunge) 잎은 전북 익산에서 2017년에 재배되어 1 년 7 개월 동안 생육시킨 개체의 잎을 채취하여 농촌진흥청 원예특작과학원 약용작물과 (Eumseong, Korea)에서 확인 후사용하였다.

2. 균주 배지 및 배양조건

균의 보존용 배지로는 Lactobacilli MRS Agar 배지 (Difco, Detroit, MI, USA)를 사용하여, 37℃에서 48 시간 평판 배양하였다. 형성된 단일 colony를 Lactobacilli MRS Broth 배지 (Difco, Detroit, MI, USA)배지에 37℃에서 48 시간 3 회 계대 배양한 후, 접종원으로 사용하였다.

3. 발효 황기 잎 제조

황기 잎은 세척한 것을 음건하여 5 분간 찌고 1 시간 건조하는 과정을 거친 후, 균주를 같은 조건에서 접종하기 위해 적외선 수분 측정기 (MS-70, AND Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 수분 함량을 50%로 조정하였다. L. brevis, L. mesenteroides, L. plantarum을 계대 배양한 뒤 초기균수를 1 × 106/㎖ 접종하여 37℃의 incubater (VS-1203PFHLN, Vision Scientific Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 48 시간 동안 배양하며 발효시켰다.

균을 배양한 황기 잎은 -80℃ 초저온냉동기 (deep freezer, Ilsin BioBase Co., Ltd., Dongducheon, Korea)에서 24 시간 동결시킨 후 동결건조기 (freeze dryer, Ilsin BioBase Co., Ltd., Dongducheon, Korea)에서 72 시간 동안 동결 건조시킨 것을 분쇄하여 시료로 사용하였다.

4. 추출물 제조

동결 건조한 발효 황기 잎을 사용하여 물 추출물을 제조하였다. 물 추출물의 제조는 다음과 같다. 각 발효물 5 g에 끓인 증류수 100 ㎖을 혼합 후 ultrasonication (Power Sonic 420, Hwashin Co., Seoul, Korea) 로 1 시간 씩 2 회 반복 추출한 후 Whatman No. 2 여과지를 이용하여 여과시킨 후, 여과액을 200 ㎖로 정용하여 rotary vacuum evaporator (BUCHI, Flawil, Switzerland)를 이용하여 50℃ 이하에서 감압·농축한 뒤, 이를 같은 추출용매로 용해하여 본 실험의 분석용 시료로 사용하였다.

5. pH 및 산도 측정

발효 황기 잎의 pH는 시료 2 g을 칭량하여 8 ㎖의 증류수를 가하여 균질화한 후 3,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 pH meter (HM-30P, DKK-TOA Co., Tokyo, Japan)로 측정하였다.

총 산도는 pH 측정의 시료와 동일한 시료를 3,000 rpm에서 15 분간 원심분리한 후 시료액 0.1 ㎖에 0.9 ㎖의 증류수를 가하여 1.0 ㎖로 정용한 후, 0.1 N NaOH로 pH 8.3에 도달 할 때까지 적정하였다. 적정에 소비된 NaOH 소비량을 이용하여 acetic acid 함량 (%)으로 환산하여 총산 함량을 표시하였다. 실험은 3 회 반복하여 그 평균값으로 나타내었다.

6. DPPH radical 소거 활성 측정

2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate (DPPH) radical에 대한 Blois 등 (1958)에 의한 방법을 변형하여 측정하였다.

각 농도별로 조제 한 시료 0.2 ㎖에 0.2 mM의 DPPH 용액 0.8 ㎖를 가하여 혼합한 뒤 상온에서 30 분간 반응시킨 후 microplate reader (Biotek Syergy Mx, Biotek Instruments Inc., VT, USA)를 이용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 각 시료를 3 회 반복 측정하여 평균값을 구하였다. DPPH radical 소거능은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 아래와 같이 백분율로 나타내었다.

전자공여능 (%) = [1 − (시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)] × 100

7. ABTS 라디칼 소거 활성 측정

2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) 소거활성 측정은 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온 암소에서 24 시간 동안 방치하여 radical을 형성시킨 다음 실험 직전에 ABTS 용액을 732 ㎚에서 흡광도가 0.70 ± 0.03이 되도록 phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)로 희석하여 사용하였다. 희석된 용액 950 ㎕에 추출물 50㎕를 가하여 암소에서 10 분간 반응시킨 후 microplate reader (Biotek Syergy Mx, Biotek Instruments Inc., VT, USA)로 732 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

8. 총 페놀성 화합물 측정

총 페놀성 화합물 함량의 측정은 페놀성 물질인 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 원리를 이용한 Folin-Denis 방법을 응용하여 측정하였다 (Kim et al., 1993).

황기 잎 추출물 시료를 0.2 ㎖를 시험관에 취하고 증류수 1.8 ㎖를 가하여 2 ㎖로 만든 후, 0.2 ㎖의 Folin-Ciocalteu's phenol reagent (Sigma-Aldirch Co., St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 3 분간 실온에 방치하였다. 70℃에서 녹인 Na2CO3 포화용액 0.4 ㎖를 가하여 혼합하고 증류수 1.4 ㎖를 첨가한 후 실온에서 1 시간 경과 후 microplate reader (Biotek Syergy Mx, Biotek Instruments Inc., VT, USA)로 725 ㎚에서 흡광도를 측정하고 표준물질로는 gallic acid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 표준곡선을 구해 정량하였다.

9. 총 플라보노이드 화합물 측정

황기 잎 추출물 시료 0.1 ㎖를 취하여 튜브에 넣고, 증류수를 0.4 ㎖와 5% NaNO2 0.03 ㎖를 첨가하여 잘 혼합한 후 5 분간 실온에 방치하였다. 10% AlCl2 0.03 ㎖를 첨가하여 혼합하고 실온에 5 분간 방치 한 후, 1 M NaOH 용액을 0.2 ㎖ 첨가하였다. 1 분간 상온에서 반응시킨 후 증류수를 3.24 ㎖를 첨가한 후 잘 혼합하여 microplate reader (Biotek Syergy Mx, Biotek Instruments Inc., VT, USA)로 510 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 quercetin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하여 표준곡선을 구해 정량하였다.

10. 유리당 분석

유리당 분석은 HPLC (Waters 2414, Waters Co., Miliford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 발효 황기 잎 추출물을 희석하여 0.45㎛ PVDF membrane filter (Waters Co., Miliford, MA, USA)를 여과한 것을 시험용액으로 하였고, column은 YMC-PACK Polyamine II (5 ㎛, 4.6 ㎜ × 250 ㎜, YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan)을 사용하였으며, mobile phase는 acetonitrile : water 혼합액 (75 : 25, v/v), flow rate는 1.0 ㎖/min, detector는 ELSD signal (Waters 2414, Waters Co., Miliford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다.

11. 추출물의 성분 분석

발효 황기 잎의 추출물 시료의 성분은 HPLC (Waters 2998, Waters Co., Miliford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 발효 황기 잎 추출물을 희석하여 0.2㎛ PVDF membrane filter (Waters Co., Miliford, MA, USA)를 여과한 것을 시험용액으로 하였고, 분석조건은 다음과 같다.

Column은 ACQUITY HPLC BEH C18 (1.7㎛, 2.1㎜ × 50 ㎜, Waters Co., Miliford, MA, USA), mobile phase 조성은 solvent A는 0.5%의 acetic acid를 포함한 water를 혼합하여 사용하였으며 solvent B의 경우 acetonitrile를 사용하였고, flow rate 및 column 온도는 각각 0.5 ㎖/min, 30℃, 검출 파장은 280㎚로 detector는 Photodiode array detector ELSD signal (Waters 204, Waters Co., Miliford, MA, USA)를 사용하여 검출하였다.

HPLC에서 나타난 peak area의 3 회 반복 평균값을 취한 후 표준품의 양과 peak area사이의 상관관계를 도출하여 검량선을 작성하여 계산하였다 (Jang et al., 2016).

12. 통계처리

본 실험의 결과는 3 회 반복 실험을 실시한 뒤 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 실험결과에 대한 통계분석은 SPSS 25.0 program (Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 ANOVA를 실시한 후 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)방법을 사용하여 각 처리구간의 유의적 차이를 검증하였다 (p < 0.05).


결과 및 고찰
1. 발효 황기 잎의 이화학적 특성 변화

발효 황기 (Astragalus membranaceus Bunge) 잎의 pH는 대조구가 pH 6.28인데 비하여 L. plantarum 실험군의 pH가 6.15로 가장 낮은 값을 나타내었다. 일반적으로 유산균 배양에 많이 사용되는 MRS배지의 pH가 6.2 - 6.6 사이인 것을 고려하여 이를 적정 pH로 보고 유산균 발효 시험에 사용하였다 (Table 1). 본 연구는 균주 접종에 의한 황기 잎 내 생리활성의 변화를 확인하는 것으로, 균주를 접종할 시료는 해당 균주의 생육이 가능할 조건이어야 하는 것이 기본 전제이다 (Bae et al., 2004).

Table 1. 
Changes in pH and total acidity of fermented A. membranaceus Bunge leaves.
Sample Components
pH Total acidity (%)
Control 6.28±0.01c 0.24±0.01b
Lactobacillus brevis 6.37±0.03b 0.40±0.01a
Leuconostoc mesenteroides 6.48±0.02a 0.36±0.03a
Lactobacillus plantarum 6.15±0.01d 0.37±0.02a
Values are means ± SD (n = 3). *Means with different superscript in the same column are significantly different at 5% by Duncan’s Multiple Range Tests (DMRT, p < 0.05).

발효 황기 잎의 산도는 발효 후에 증가함을 보였고, L. brevis로 발효한 실험구의 산도가 0.40%로 가장 높은 값을 보였다. 산도의 증가는 유산균 배양에 의해 생성된 유기산과 미생물의 유기물 분해 시 발생하는 적은 양의 옥살산, 젖산 및 아세트산 등이 생성되어 (Kim and Bae, 1999) 잡균의 생육을 저해시킬 뿐만 아니라, 잡균에 의한 오염 방지 및 추출물의 저장성이 향상될 것으로 기대된다.

2. 추출물의 DPPH 및 ABTS 항산화 활성

발효 황기 잎의 DPPH 라디칼 소거능의 결과는 다음과 같다. 대조군 42.2%에 비해 발효 황기 잎의 결과가 L. brevis 51.02%, L. mesenteroides 64.33%, L. plantarum 50.78%로 모두 증가하였으며, L. mesenteroides 로 발효한 실험군이 가장 높은 활성을 나타내었다 (Table 2). 폴리페놀 함량이 증가하면 항산화 등의 생리활성이 비례적으로 증가한다고 보고되고 있으며(Imai et al., 1994; Halliwell et al., 1995), 본 연구에서는 발효 황기 잎에서의 DPPH 활성이 높은 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 Kim 등 (2016)이 보고한 바와 같이 유산균에 의한 발효물의 항산화 활성이 높아지기 때문이라고 판단되었다. 또한 Jun 등 (2014)의 연구에서 밤송이추출물의 Lactobacillus sakei를 이용한 발효 시 대조군보다 높게 나왔다는 결과와 유사함을 보였다.

Table 2. 
Antioxidant activity of hot water extracts from fermented A. membranaceus Bunge leaves.
Sample Contents (%)
DPPH ABTS
Control 42.20±0.60c 68.44±0.74d
Lactobacillus brevis 51.02±0.79b 75.66±0.80c
Leuconostoc mesenteroides 64.33±1.33a 87.08±0.80a
Lactobacillus plantarum 50.78±0.95b 79.55±0.67b
Values are means ± SD (n = 3). *Means with different superscript in the same column are significantly different at 5% by Duncan’s Multiple Range Tests (DMRT, p < 0.05).

DPPH 라디칼 소거 활성능이 유리라디칼이 제거되는 원리를 이용한다면, ABTS 라디칼 소거능은 양이온 라디칼이 제거되는 것을 이용하므로 두 종류의 라디칼 소거능 확인의 필요가 있을 것으로 사료되어 실험 진행하였고 발효 황기 잎의 ABTS 라디칼 소거능의 결과는 다음과 같다. 대조군 68.44%에 비해 발효 황기 잎의 결과가 L. brevis 75.66%, L. mesenteroides 87.08%, L. plantarum 79.55%로 모두 증가하였으며, L. mesenteroides로 발효한 실험군이 가장 높은 활성을 나타내었다 (Table 2).

이러한 결과는 DPPH 라디칼 소거 활성에서 발효한 황기잎이 발효하지 않은 황기 잎 대비 증가한다는 결과와는 일치하나, DPPH 라디칼 소거 활성과 비교하여 제거 능력이 다소 높은 것으로 나타났다. 이러한 소거능의 차이는 측정방법의 차이로 사료된다. Jeong 등 (1994)에 의하면 DPPH는 자유라디칼을 ABTS는 양이온 라디칼을 소거하는 점에서 서로 차이가 나며 두 기질과 반응물과의 결합정도가 달라지므로 라디칼 제거 능력에서도 차이가 있음을 보고한 바와 같이 이는 본 연구 결과와 유사하였다.

3. 추출물의 총 폴리페놀 함량 변화

대조구에서는 4.51 ㎎/㎖의 총 페놀함량을 보였지만 L. mesenteroides는 발효한 실험군에서는 6.46 ㎎/㎖로 증가하였다. L. brevisL. plantarum는 각각 6.11 ㎎/㎖, 6.10 ㎎/㎖으로 유사한 결과값을 나타내었다 (Table 3). 이 결과는 Kim 등 (2016)이 수행한 유산균 발효의 효과 연구에서 폴리페놀의 함량이 대조군에 비해 발효물에서 증가했다고 보고한 결과와 유사하였다.

Table 3. 
Total phnolic and flavonoid content in extract from fermented A. membranaceus Bunge leaves.
Sample Contents (㎎/㎖)
Total polyphenols Total flavonoids
Control 4.51±0.10d 4.08±0.02d
Lactobacillus brevis 6.11±0.06b 5.29±0.02b
Leuconostoc mesenteroides 6.46±0.05a 5.39±0.02a
Lactobacillus plantarum 6.10±0.14c 5.13±0.01c
Values are means ± SD (n = 3). *Means with different superscript in the same column are significantly different at 5% by Duncan’s Multiple Range Tests (DMRT, p < 0.05).

발효한 실험군에서 총 페놀의 함량이 증가한 결과는 DPPH 라디칼 소거능 측정의 결과와 유사함을 보여 총 페놀의 함량이 DPPH 라디칼 소거능과 상관성이 있다고 추정되었다. Lee 등 (2004)은 DPPH 라디칼 소거능은 총 폴리페놀의 함량과 관련이 높다고 보고하였으며, Song 등 (2011)은 유산균 발효에 의하여 DPPH 라디칼 소거능이 증가한 것이 페놀성 화합물의 증가에 의해 기인한 것으로 추정된다고 보고한 바 있다.

4. 추출물의 총 플라보노이드 화합물 함량 변화

대조군에서의 총 플라보노이드 함량은 4.08 ㎎/㎖으로 나타났고, L. mesenteroides는 발효한 실험군에서는 5.39 ㎎/㎖로 가장 높았다. L. brevisL. plantarum는 각각 5.29 ㎎/㎖, 5.13 ㎎/㎖으로 결과값을 나타내었다 (Table 3).

플라보노이드 또한 폴리페놀의 일종이며, 일반적으로 폴리페놀 함량이 증가하면 항산화 등의 생리활성이 비례적으로 증가한다고 보고되고 있다 (Imai et al., 1994; Halliwell et al., 1995). 미생물에 의한 생물전환을 통해 총 폴리 페놀과 총 플라보노이드의 함량 변화에 영향을 줄 수 있으며, Lactobacillus paracasei, L. rhamnosus 등을 이용하여 칡과 엉겅퀴의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드가 증가하는 것이 보고되었다 (Kim et al., 2019; Park et al., 2019). 이와 같이 발효한 황기 잎의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 증가함은 L. brevis, L. mesenteroidesL. plantarum의 대사과정을 통한 생물전환을 통해 이루어졌을 것으로 판단하였다.

5. 추출물의 유리당 함량 변화

대조군의 경우 fructose 117.55 ㎎/100g, glucose 21.99 ㎎/100g, sucrose 9.87 ㎎/100g이 검출되었다. L. brevis, L. mesenteroides, L. plantarum을 발효한 실험군의 유리당 함량은 모두 감소하였다. L. mesenteroides로 발효한 실험군은 fructose와 glucose가 각각 117.55 ㎎/100g, 4.59 ㎎/100g으로 가장 낮은 함량을 나타내었고, glucose는 대조구에 비해 4.8배 감소하였다. L. brevis로 발효한 실험군은 sucrose가 2.06 ㎎/100g으로 가장 낮은 함량을 보였다 (Table 4).

Table 4. 
The free sugar content of fermented A. membranaceus Bunge leaves.
Sample Components (㎎/100 g)
Fructose Glucose Sucrose
Control 117.55±9.14a 21.99±0.80a 9.87±0.17a
Lactobacillus brevis 109.24±5.30a 16.24±2.29c 2.06±0.58c
Leuconostoc mesenteroides 69.60±8.97b 4.59±0.57d 5.38±0.47b
Lactobacillus plantarum 110.77±5.77a 18.98±0.70b 5.30±0.37b
Values are means ± SD (n = 3). *Means with different superscript in the same column are significantly different at 5% by Duncan’s Multiple Range Tests (DMRT, p < 0.05).

이 결과는 유산균으로 발효함에 따라 glucose나 전체적인 유리당의 함량이 현저히 감소하였는데, 발효 과정 중에 유산균에 의해 당류가 영양원으로 사용되었기 때문인 것으로 사료된다 (Kim et al., 1999).

6. 추출물의 성분 변화

발효 황기 잎의 이소플라본 성분 함량을 측정하였다. 본 실험에서는 황기 잎에 존재하는 이소플라본 성분인 calycosin-7-o-β-d-glucoside, ononin, calycosin, formononetin을 HPLC로 분석을 통해 확인하였다.

분석 결과 대조구의 calycosin-7-o-β-d-glucoside, ononin, calycosin, formononetin은 각각 71.89㎎/100g, 0.97㎎/100g, 5.41 ㎎/100g, 0.86 ㎎/100g으로 나타내었다. 발효 황기 잎의 calycosin과 formononetin은 대조구에 비해 모두 증가 하였으며, L. mesenteroides로 발효한 실험군이 각각 9.93 ㎎/100g, 5.41 ㎎/100g으로 가장 높게 증가하였다. 또한 ononin은 모든 실험군에서 유사하게 증가하였다. 반면에 calycosin-7-o-β-dglucoside은 모든 실험군이 각각 66.78 ㎎/100g, 61.53 ㎎/100g, 59.89 ㎎/100g으로 감소하였다 (Table 5).

Table 5. 
The isoflavonoid compounds of hot-water extracts from fermented A. membranaceus Bunge leaves.
Sample Contents (㎎/100 g, dry weight)
Calycosin-7-O-β-d-glucoside Ononin Calycosin Formononetin
Control 71.90±7.21a 0.97±0.10b 5.41±0.54c 0.86±0.09c
Lactobacillus brevis 66.78±6.68b 1.26±0.13a 5.51±0.55c 0.92±0.09bc
Leuconostoc mesenteroides 61.53±6.15c 1.22±0.12a 9.93±0.99a 5.41±0.54a
Lactobacillus plantarum 59.89±5.99c 1.27±0.13a 7.60±0.76 1.05±0.10b
Values are means ± SD (n = 3). *Means with different superscript in the same column are significantly different at 5% by Duncan’s Multiple Range Tests (DMRT, p < 0.05).

이는 Chien 등 (2006)이 보고한 바와 같이 유산균에 의한 배당체의 비배당체화 활성에 의해 나타난 것으로, Pyo 등 (2005)의 보고와 같이 이는 유산균의 β-glucosidease의 활성과 밀접한 관련이 있을 것으로 추정되었다.

이는 황기에는 calycosin 및 formononetin의 배당체를 많이 함유하고 있는데 이러한 배당체형태의 성분들인 calycosin 7-o-β-D-glucoside 및 formononetin 7-o-β-D-glucoside가 균주의 효소분해 작용으로 인해 비배당체 형태인 calycosin 및 formononetin으로 전환되어 함량이 증가한 것으로 사료된다. Im 등 (2010)의 당분해효소를 이용하여 배당체 형태의 황기 성분을 aglycon형태로 전환한 연구결과 및 Lee 등 (2013)의 유산균 발효를 통해 자음 강화탕의 배당체 성분인 nodakenin을 aglycon인 nodakenitine으로 전환시킨 보고와 유사하였다. 이러한 황기의 대표적인 isoflavonoid 성분인 calycosin 및 formononetin은 항산화, 항염증 효능 및 면역증진 활성 등의 다양한 생리활성 효능이 보고되어 있는데 (Du et al., 2012), 배당체 형태로 존재하여 체내 흡수, 이용률 저하 등 미비한 효과를 나타내는 성분들을 유산균 발효공정을 통해 미생물의 효소를 이용하여 유기물을 분해 및 변화시킬 뿐만 아니라 활성성분의 생물전환을 일으켜 체내흡수율과 생체 이용률을 증진 시키므로 식품산업 등 여러모로 폭넓은 이용 가능성이 있을 것으로 사료된다 (Cho et al., 2006).


Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업과학기술 연구사업(과제번호: PJ 01357002)의 지원에 의해 이루어진 것이며 이에 감사드립니다.


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