Current Issue

Korean Journal of Medicinal Crop Science - Vol. 30 , No. 2

[ Research Articles ]
Korean Journal of Medicinal Crop Science - Vol. 30, No. 2, pp.124-133
Abbreviation: Korean J. Medicinal Crop Sci
ISSN: 1225-9306 (Print) 2288-0186 (Online)
Print publication date 30 Apr 2022
Received 22 Oct 2021 Revised 22 Mar 2022 Accepted 22 Mar 2022
DOI: https://doi.org/10.7783/KJMCS.2022.30.2.124

갯방풍 지상부 용매 분획물의 비표적 대사체 프로파일링 및 항산화 활성
김철중1전지형2최선강3유창연4이재근5,
1㈜화진바이오코스메틱 생명공학연구소 과장
2㈜화진바이오코스메틱 생명공학연구소 연구원
3강원대학교 농생명산업학과 교수
4강원대학교 식물자원응용과학과 교수
5㈜화진바이오코스메틱 생명공학연구소 연구소장

Antioxidant Activity and Non-Targeted Metabolic Profiling of Solvent Fractions of Glehnia littoralis Shoots
Chul Joong Kim1Ji Hyeong Jeon2Seon Kang Choi3Chang Yeon Yu4Jae Geun Lee5,
1Manager, Research Institute of Biotechnology, HwajinBioCosmetic, Chuncheon 24232, Korea
2Researcher, Research Institute of Biotechnology, HwajinBioCosmetic, Chuncheon 24232, Korea
3Professor, Department of Agricultural Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
4Professor, Department of Bio-Resource Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
5Chief technology officer, Research Institute of Biotechnology, HwajinBioCosmetic, Chuncheon 24232, Korea
Correspondence to : (Phone) +82-33-258-6801 (E-mail) leejeakun@hanmail.net


This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

ABSTRACT
Background

The soft petiole of the Glehnia littoralis shoot is used as a raw material for food. It contains specific ingredients such as polyacetylene and coumarin. However, basic research considering their safety verification, efficacy, and ingredient identification is needed.

Methods and Results

In this study, GC/MS compound profiling and LC/UVD were performed to evaluate the antioxidant activity of G. littoralis shoot extract fractions, and to identify the compounds contained therein. Total phenol and flavonoid content as well as antioxidant activity were maximum in the ethyl acetate layer, and a significant correlation was confirmed between total phenol content and antioxidant activity. GC/MS compound profiling, revealed a total of more than 40 compounds, and active ingredients such as coumarin-based phellopterin unique to G. littoralis and polyacetylene-based falcarinol (panaxinol) were qualitatively analyzed. The highest coumarin content was found in the ethyl acetate layer.

Conclusions

In this study, the antioxidant activity and compounds contained in the shoot (soft petiole) fractions of G. littoralis were confirmed. These basic data may contribute to expanding the material value of G. littoralis in the future.


KeyWords: Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., Antioxidant Activity, Coumarin, Ethyl Acetate Fractions, Non-targeting Metabolic Profiling, Shoots

서 언

노화는 시간이 흐름에 따라 개체의 기능이 퇴화되는 것을 말하며, 생물에서는 신체적 기능 손실 및 저하, 세포분열 능력의 상실로 다양한 질병을 초래하는 것으로 알려져 있다 (Naranjo et al., 2017; Kwon et al., 2021). 세포의 노화는 텔로미어 말단소립 기능장애, 종양유전자 활성화, 지속적인 DNA 손상, 산화 스트레스 등의 내·외생적 스트레스 반응에 의해 배아 발달 시기부터 노년기까지 광범위하게 일어나며, 노년기에 손상된 조직은 재생력 감소로 유기체 노화의 가속화를 유발 시킨다 (Micco et al., 2020; Helbling-Leclerc et al., 2021).

노화의 주요 원인인 산화 스트레스는 세포질과 미토콘드리아를 자극하여 유발되는 것으로 알려져 있으며, 세포막의 손상과 활성산소의 증가는 산화 스트레스를 증대시키고, DNA 핵 손상과 미토콘드리아의 산화적 인산화 저해로 세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다 (Hanzhi et al., 2017; Oh et al., 2020).

식물에 함유된 이차대사산물인 phytochemical은 생리적 활성을 나타내는 주요성분으로 유기황화합물, 테르펜, 폴리페놀, 유기산, 다당체, 지질로 구분된다. 이중 항산화 효과를 나타내는 폴리페놀은 플라보노이드, 이소플라본, 안토시아닌, 페놀산, 스틸벤 등으로 분류된다. 이차대사산물은 식물체에서 유전적 요인, 환경적 요인에 의해 생합성되는 것으로 알려져 있지만, 대부분 환경적 요인의 영향이 큰 부분을 차지하고, 알칼로이드, 글리코사이드, 스테로이드, 에센셜 오일 등의 활성 성분의 양적 변화가 나타나는 것으로 알려져 있다 (Zargoosh et al., 2019; Kim et al., 2020).

염생식물은 생육지 토양에 집적된 염분농도, 흡수된 염의 대사방법 등 염에 대한 적응성이 중성식물에 비해 높은 식물을 말하며, 계절변동과 생육지의 환경에 따라 형태적인 변이가 큰 것으로 알려져 있다 (Min, 1990). 염생식물은 직·간접적으로 염분이 식물체에 유입되는 독특한 생태계 구조에서도 생존 가능하며, 육상식물들과 다른 이차대사산물들을 함유하는 것으로 알려졌지만, 효능 및 성분에 관한 다양한 연구가 이루어지지 않고 있다 (Lee et al., 2004). 2019년 국가해양생태계종합조사에 따르면 국내에서 자생하는 염생식물은 72 종으로 확인되었고, 3 면의 해안에서 총 1,813,536 ㎡의 분포 면적을 차지하는 것으로 보고되었다 (Lee et al., 2019).

염생식물 중 갯방풍 (Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miquel)은 국내 자생하는 다년생 해양 초본식물로 일본, 중국, 만주, 사할린, 오호츠크, 쿠릴열도 및 북미 캘리포니아에서 알래스카까지 태평양 연안에 분포하며 (Kim et al., 2005; Choo et al., 2008), 해양의 영향을 강하게 받는 바닷가 해안사구에 서식한다. 갯방풍 연구는 β-sitosterol과 bergapten을 추출해 낸 것을 시작으로 (Seo and Ryu, 1977), polyacetylene 화합물인 falcarindiol, falcarinol, coumarin 화합물인 bergapten, xanthotoxin, umbelliferone, scopoletin, 그리고 sesquiterpene 화합물인 (5β,10α)-Lasidiol angelate 등이 보고되었고 (Um et al., 2010) 함유된 정유물질은 항생 (Shin et al., 2005), 추출물은 항염 (Yoon et al., 2010) 및 항암 (de la Cruz et al., 2015)의 효과가 보고되었다.

현재, 갯방풍은 지상부 연한 잎자루만 식품공전에 식용할 수 있는 원료로 사용이 가능한 상태이며 (MFDS, 2021), 유효성, 성분규명 등에 관한 다양한 연구가 이루어지지 않은 상태이다.

따라서, 본 연구에서는 갯방풍 지상부 (연한 잎자루) 추출물 및 분획물의 항산화 생리활성 평가와 함유된 compound의 GC/MS non-targeting 정성분석과 LC/UVD 정량분석을 실시하여, 염생식물 갯방풍의 소재적 가치를 검증하고 활용범위를 확장하고자 시험을 수행하였다.


재료 및 방법
1. 재료

실험에 사용한 갯방풍은 2019년 5월에 강원도 강릉시 (위도 37.84083, 경도 128.65416)에서 재배된 갯방풍 (G. littoralis Fr. Schmidt ex Miquel, Solnaemall, Gangneung, Korea) 지상부를 건조하여 사용하였다.

건조에 사용된 열풍건조기는 KED-132A (Kiturami Co., Ltd., Cheongdo, Korea), 추출에 사용된 에탄올은 95% 발효주정 (Daehan Ethanol Life Co., Ltd., Hwasung, Korea)을 사용하였고, 추출기는 COSMOS-660 (Kyumgseo E&P, Incheon, Korea), 감압농축기는 R-220 pro set (Büchi, Postfach, Switzerland), 동결건조기는 PVTFD 300R (Ilshinbiobase, Yangju, Korea)을 이용하였다. 이외에 분획에 사용된 용매는 Thermo fisher scientific (Waltham, MS, USA), 생리활성에 사용된 시약은 Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.

2. 추출물 제조 및 용매별 분획

추출물은 갯방풍 지상부 건조물 2.5 ㎏에 50% 에탄올 50 ℓ를 첨가하고 50℃에서 5 시간 동안, 5 회 반복 추출한 후, 농축, 동결건조 한 분말을 시료로 사용하였다.

용매별 분획은 Jeon 등 (2012)의 방법을 변형하여 실시하였고, 위의 분말 시료 10 g을 증류수 500 ㎖에 용해한 후, 비극성 용매 n-hexane과 1 : 1로 혼합한 다음, 수층과 n-hexane 층이 나뉘도록 방치하여 n-hexane 층을 분리하였다. 동일한 방법으로 총 3 회 추출하여 n-hexane 분획물을 얻었다. 이후 수층에 chloroform, ethyl acetate, BuOH을 차례로 넣어 각각 추출하였다. 이때, 추출용매는 남은 용액과 동일한 양으로 첨가하였다.

n-hexane, chloroform, ethyl acetate, BuOH, 물층 순으로 극성의 차이를 이용한 분획물을 수득한 후, 분획물별로 농축, 동결건조하여 폴리페놀 함량 및 항산화활성 검정, LC/UVD를 이용한 coumarin 계열 정량분석의 시료로 사용하였다 (Fig. 1).


Fig. 1.  Flow diagram of extract and solvent fractions from shoots in Glehnia littoralis in this study.


3. 폴리페놀 함량
3.1. 총 페놀

총 페놀은 Folin & Ciocalteu의 방법을 변형한 Singleton 등 (1999)의 방법으로 갯방풍 지상부의 50% 에탄올 추출물과 용매별 분획물 (n-hexane, chloroform, ethyl acetate, BuOH, 물층)의 함량을 비교하였다.

시료 100 ㎕ (1 ㎎/㎖)에 Folin-ciocalteu's phenol 50 ㎕를 혼합하여 상온에서 5 분간 반응시키고, 이후, 20% sodium carbonate 300 ㎕를 첨가하여 상온에서 15 분간 추가로 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 증류수 1 ㎖를 첨가하여 UV/Vis spectrophotometer (UMBS0300-3040, Molecular Devices, San jose, CA, USA)로 740 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

표준물질 gallic acid는 0, 100, 150, 250, 350, 500 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 검량선 (y = 0.002x + 0.017, R2 = 0.999)을 작성하였고, gallic acid equivalents (㎎·GAE/g)로 정량값을 산출하였다.

3.2. 총 플라보노이드

총 플라보노이드는 Chandra 등 (2014)의 방법으로 50% 에탄올 추출물, 용매별 분획물의 함량을 비교하였다.

1 M potassium acetate 100 ㎕에 10% aluminum nitrate 100 ㎕을 혼합하고, 시료 500 ㎕ (1 ㎎/㎖)를 첨가하여 상온에서 40 분간 반응시키고, UV/Vis spectrophotometer (UMBS0300-3040, Molecular Device, San jose, CA, USA)를 이용하여 510 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

표준물질 quercetin은 0, 10, 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 검량선 (y = 0.004x + 0.035, R2 = 0.999)을 작성하였고, quercetin equivalents (㎎·QUE/g)로 정량 값을 산출하였다.

4. 항산화 활성
4-1. DPPH 음이온 radical 소거능

DPPH 소거능은 Clarke 등 (2013)의 방법으로 50% 에탄올 추출물, 용매별 분획물의 활성을 비교하였다.

농도별로 희석한 시료 100 ㎕와 1.5 mM DPPH 100 ㎕를 30 분간 암실 반응시키고, UV/Vis spectrophotometer (UMBS0300-3040, Molecular Device, San Jose, CA, USA)를 이용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군은 ascorbic acid를 사용하였고, 최대효과 50% 소거하는데 필요한 농도인 half maximal effective concentration (EC50)으로 활성 값을 산출하였다.

4.2. ABTS 양이온 radical 소거능

ABTS 소거능은 Ozgen 등 (2006) 방법으로 50% 에탄올 추출물, 용매별 분획물의 활성을 비교하였다. 2.6mM potassium persulfate와 7.4mM ABTS를 1 : 1 비율로 혼합한 후, 15 시간동안 암상태로 반응시켜 ABTS 용액을 제조하였다.

농도별로 희석한 시료 100 ㎕와 ABTS 용액 90 ㎕를 혼합하여 10 분간 상온에서 반응시킨 후, UV/Vis spectrophotometer (UMBS0300-3040, Molecular Device, San jose, CA, USA)를 이용하여 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군은 ascorbic acid를 사용하였고, EC50으로 활성 값을 산출하였다.

4.3. SOD 유사활성

SOD 유사활성은 Marklund and Marklund (1974)의 방법으로 50% 에탄올 추출물, 용매별 분획물의 활성을 비교하였다.

1,000 ㎍/㎖의 농도로 제조된 시료 40 ㎕에 Tris-HCl buffer (50 mM Tris + 10 mM EDTA, pH 8.5) 200 ㎕와 7.2 mM pyrogallol 10 ㎕를 혼합한 후, 25℃에서 10 분간 반응시켰다. 1 M HCl 10 ㎕를 가하여 반응을 종료시킨 후, UV/Vis spectrophotometer (UMBS0300-3040, Molecular Device, San jose, CA, USA)를 이용하여 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

양성대조군은 ascorbic acid를 사용하였고, 시료 첨가군과 미첨가군의 흡광도 차이를 백분율 (%)로 하여 활성을 산출하였다.

5. Gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) 정성분석

갯방풍 지상부의 50% 에탄올 추출물에 대한 비표적 대사체 분석 프로파일링 (non-targeting metabolic profiling)은 GC/MS로 실시하였다.

갯방풍 지상부를 50% 에탄올로 추출, 농축, 동결건조한 후, 분말 시료에 n-hexane을 첨가하여, 10,000 ㎍/㎖ 농도로 제조한 후, 적정한 농도로 희석하여 수행하였다.

GC는 6890N GC system (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA) MS는 Pegasus Ⅳ (LECO Co., St. Joseph, MI, USA)을 이용하였고, Column은 Agilent GC column DB-5MS (30 m × 25 m, 0.2㎛, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)을 사용하였으며, Table 1과 같은 조건으로 정성분석을 실시하였다.

Table 1. 
The condition of non-targeting metabolic profiling in n-hexane extract from G. littoralis shoots using GC/MS.
Injection volume 1 μl
Inlet temp 280℃
Split 50:1
Oven temp 30℃ (5 min hold) -- 10℃/min -- 300℃ (10 min hold)
Transferline temp 280℃
Sovent delay 0 sec
Ionization Electron impact (EI)
Detector voltage 1750 V
Ion source temp 220℃

6. LC/UVD 정량분석

Compound 중 coumarin 계열 정량분석은 50% 에탄올 추출물, 용매별 분획물로 나누어 L C/UVD로 실시하였다. UltiMate 3000 HPLC system (Thermo Fisher Scientific Inc., San Jose, CA, USA)을 사용하였고, 컬럼은 (5 ㎛, 250 ㎜ × 4.6 ㎜, Bischoff Analysentechnik und -geräte GmbH., Böblinger, Leonberg, Garmany)을 사용하였다. 이동상은 water (A)와 acetonitrile (B)로 농도 구배에 따른 기울기 용리 조건 (0 - 5 min: 80% A, 5 - 60 min: 80 → 0% A, 60-70 min: 0% A, 70-71 min: 0 → 80% A, 71 - 80 min: 80% A)을 설정한 후, 컬럼 온도 30℃, 유속 1.0 ㎖/min, 주입량 10 ㎕, 검출파장 203 ㎚로 분석하였다.

표준물질은 sigma-aldrich의 scopoletin, umbelliferone, imperatorin과 chemfaces의 phellopterin을 구입하였고, 5 point 농도범위에서 표준곡선을 작성한 후 얻은 회귀식 (scopoletin y = 0.482x + 0.077, R2 = 0.999, umbelliferone y = 1.005x + 0.027, R2 = 0.999, imperatorin y = 0.996x + 0.017, R2 = 0.999, phellopterin y = 0.993x + 0.010, R2 = 0.999)에 값을 대입하여 정량값을 산출하였다.

7. 통계처리

실험은 3 회 반복으로 진행하였으며, 평균 ± 표준편차를 나타내었다. 시험 결과와 관련된 통계처리는 SPSS program (Statistical Package for Social Science, Version 24, IBM, Chicago, IL, USA)을 이용하여 분산분석(ANOVA)으로 5% 수준에서 Duncan`s Multiple Range Test (DMRT)에 의하여 대조군과 시험군 간의 유의차를 검증하였다 (p < 0.05).


결과 및 고찰
1. 폴리페놀 함량
1.1. 총 페놀, 총 플라보노이드

갯방풍 (G. littoralis Fr. Schmidt ex Miquel) 지상부 분획 (Fig. 1)의 총 페놀 함량은 chloroform < hexane < 물층 < BuOH < ethyl acetate 순으로 8.44, 10.55, 14.92, 50.20, 72.52 ㎎·GAE/g, 총 플라보노이드 함량은 물층 < chloroform < hexane < BuOH < ethyl acetate 순으로 2.48, 3.09, 5.49, 17.40, 21.61 ㎎·QCT/g이 검출되었다. 총 페놀, 플라보노이드 모두 ethyl acetate 분획물에서 가장 높은 함량을 나타내었다 (Table 2).

Table 2. 
Antioxidant activity of extract and solvent fractions from G. littoralis shoots.
Fraction Total phenols (㎎·GAE/g) Total flavonoids (㎎·QCT/g) DPPH EC50 (μg/㎖) ABTS EC50 (μg/㎖) SOD (%)1)
Extract (50% EtOH) 46.55±3.03a 16.60±2.00a 93.87±9.07d 236.51±7.91c 36.74±2.77d
Hexane fraction 10.55±1.02cd 5.49±1.00c 608.12±5.80b 880.06±53.71b 12.98±2.40f
Chloroform fraction 8.44±0.26e 3.09±0.73d 856.49±91.57a 1250.13±150.80 10.60±1.99f
Ethyl acetate fraction 72.52±5.17a 21.61±1.27a 81.72±8.49de 113.26±7.83d 45.63±1.44b
BuOH fraction 50.20±5.00b 17.40±1.80b 108.56±3.76d 119.24±8.08d 40.83±1.12c
Aqueous fraction 14.92±1.31c 2.48±0.59d 208.69±25.28c 293.19±32.61c 19.12±3.03e
Ascorbic acid - - 19.98±2.10f 51.84±1.74d 66.61±0.54a
Values are expressed as means ± SE (n = 3). Means within a column followed by the same letter are not significantly different based on the Duncan's Multiple Range Test (DMRT, p < 0.05). 1)Sample concentration 1,000 ㎍/㎖.

2. 항산화 활성
2.1. DPPH, ABTS radical 소거능

분획물 (Fig. 1)의 DPPH radical 소거능은 chloroform < hexane < 물층 < BuOH < ethyl acetate 순으로 856.49, 608.12, 208.69, 108.56, 81.72㎍/㎖, ABTS 소거능은 chloroform < hexane < 물층 < BuOH < ethyl acetate 순으로 1250.13, 880.06, 293.19, 119.24, 113.26 ㎍/㎖ EC50이 측정되었다. DPPH, ABTS 모두 ethyl acetate 분획물에서 가장 높은 소거능을 나타내었다 (Table 2).

식물에 함유된 폴리페놀성 화합물은 고유한 색을 나타내고, 단백질 및 다른 분자들과 결합하는 phenolic hydroxyl group (Choi et al., 2011)은 대체적으로 중간 극성을 나타내어 ethyl acetate 층에서 함량이 높은 것으로 알려져 있다 (Kim et al., 2019).

산복사나무, 열처리 양파, 배초향 및 레몬그라스 분획물의 활성을 비교한 선행연구에서도 ethyl acetate 분획물의 총 페놀, 플라보노이드 추출수율이 높았고, 이에 따라 항산화 활성이 증가되는 것을 확인하였다 (Lee et al., 2007; Kim et al., 2012; Kim et al., 2017; Hacke et al., 2018). 또한, 염생식물 칠면초에서도 ethyl acetate 분획물의 높은 폴리페놀 함량과 항산화 활성의 상관관계가 확인되었다 (Choi et al., 2009).

본 시험에서도 선행연구와 유사한 것을 보았을 때, ethyl acetate 층의 높은 폴리페놀 함량에 의해 항산화 활성이 증가되는 것으로 생각되어진다.

2.2. SOD 유사활성

분획물 (Fig. 1)의 SOD 유사활성 결과, 시료 농도 1,000 ㎍/㎖를 처리하였을 때, chloroform < hexane <물층 < BuOH < ethyl acetate 순으로 10.60, 12.98, 19.12, 40.83, 45.63% 활성이 측정되었다 (Table 2).

Jeon 등 (2012)은 참취 분획물의 SOD 측정값을 비교하였을 때, ethyl acetate 분획물 42.8% (농도 1,000 ㎍/㎖), Kwon 등 (2020)은 도라지 ethyl acetate 분획물 22.5% (농도 500 ㎍/㎖)로 총 페놀이 다량 함유되어 ethyl acetate 층이 높은 활성을 나타낸다고 보고하였다.

반면, 염생식물 50% 메탄올 전초 추출물의 SOD 유사활성을 측정한 Park (2006)은 갯까치수영 22.36%, 실망초 20.09%, 갯능쟁이 17.74%, 통보리사초 16.49%를 나타내었고, 본 실험에서는 50% 에탄올 지상부 추출물이 36.74%를 나타내어, 염생식물 중에 상대적으로 SOD 유사활성이 높은 것으로 확인되었다.

Superoxide는 체내에서 가장 많이 발생하는 활성 산소이며, 체내 SOD 효소는 활성산소를 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉매하며, 이후 catalase와 peroxidase에 의해 물분자와 산소분자로 전환된다. 또한 SOD 효소와 다르지만 체내에서 이와 유사한 역할을 하는 물질을 SOD 유사활성물질이라 부른다 (Kim et al., 1994; Park, 2006). 본 시험의 갯방풍 50% 에탄올 추출물과 분획물의 SOD 유사활성 결과는 SOD나 SOD 유사물질들에 의해 자동산화가 억제되어 활성을 나타낸 것으로 생각되어진다.

2.3. 폴리페놀 함량과 항산화 활성 간의 상관관계 분석

추출물과 분획물 (Fig. 1)의 총 페놀 및 플라보노이드 함량과 항산화 활성 간의 상관관계는 Table 3과 같다.

Table 3. 
Correlations between poly phenol and flavonoid contents and antioxidant activities of shoots extract and fractions from G. littoralis.
Fractions Activity TPC1) TFC2) DPPH ABTS SOD
Extract (50% EtOH) TPC 1
TFC .993 1
DPPH .637 .545 1
ABTS -.932 -.884 -.873 1
SOD -1.000* -.994 -.634 .931 1
Hexane fraction TPC 1
TFC .209 1
DPPH -.774 -.781 1
ABTS .619 .897 -.976 1
SOD -.951 .104 .540 -.345 1
Chloroform fraction TPC 1
TFC -.761 1
DPPH -.671 .029 1
ABTS -.891 .383 .935 1
SOD .789 -.999 -.073 -.423 1
Ethyl acetate fraction TPC 1
TFC .392 1
DPPH .990 .520 1
ABTS .976 .181 .934 1
SOD .226 -.808 .084 .434 1
BuOH fraction TPC 1
TFC -.693 1
DPPH -.572 .988 1
ABTS -.789 .990 .995 1
SOD .348 -.917 -.968 -.850 1
Aqueous fraction TPC 1
TFC -.477 1
DPPH .399 .666 1
ABTS -.581 .992 .569 1
SOD -.762 -.207 -.868 -.084 1
1)TPC; total phenol contents, 2)TFC; total flavonoid contents. Values are expressed as means ± SE (n = 3). Means within a column followed by the same letter are not significantly different based on the Duncan's Multiple Range Test (DMRT, p < 0.05). *Correlation is significant at level 0.01.

이중, 항산화 활성이 높은 ethyl acetate 분획물의 총 페놀과 DPPH, ABTS는 r = 0.990, r = 0.976으로 유의적인 상관관계를 나타내었고 (p < 0.01), DPPH와 ABTS 라디칼 소거능에서는 r = 0.934의 유의적 상관관계를 나타내었다 (p < 0.05). 반면, 총 플라보노이드와 SOD 유사활성에서는 유의적인 상관관계가 없는 것으로 나타났다.

총 페놀과 플라보노이드는 free radical을 소거할 수 있는 주요성분으로 알려져 있고, DPPH와 ABTS와의 상관관계를 통하여 항산화 활성을 검증하는 것으로 알려져 있다 (Esmaeili et al., 2015). Jeon 등 (2012)은 free radical 소거능, 효소적 반응, 환원적 반응 항산화를 비교한 시험에서 ethyl acetate에서 최대의 활성을 나타내었고, 총 페놀 및 플라보노이드와 항산화 활성과의 상관관계를 검증하였다. Park과 Kim (2017)은 서목태 발효물 (영지 균사체)에서 폴리페놀과 DPPH, ABTS의 유의적인 상관관계를 검증하였다. 또한, Jang 등 (2012)은 약초 추출물의 총 폴리페놀과 ABTS 라디칼 소거능 (r = 0.915)과 DPPH 라디칼 소거능 (r = 0.750)의 상관관계를 나타내었으며, 플라보노이드 양과 DPPH 라디칼 소거능 (r = 0.514)과 환원력 (r = 0.674)의 상관관계를 검증하였다.

3. GC/MS 정성분석

갯방풍 지상부에 함유된 compound profiling 결과, 총 40여종 compound가 확인되었고, 이중 19 종 compound (α-phellandrene, 4-isopropyl-2-cyclohexenone, 2,4-di-tert-butylphenol, 3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-OL, palmitic acid, methyl linolenate, ledene oxide-(I), phytol, linoleic acid, falcarinol, imperatorin, DL-alpha-tocopherol acetate, stigmasterol, 2-linoleoylglycerol, methyl (Z)-5,11,14,17-eicosatetraenoate, campesterol, 2-palmitoylglycerol, i-propyl 6,9,12-hexadecatrienoate, phytyl acetate)는 다른 compound에 비해 다량 검출되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2 and Table 4).


Fig. 2.  GC/MS compounds chromatogram of non-targeting metabolic profiling in n-hexane extract from G. littoralis shoots.


Table 4. 
GC/MS qualitative analysis compounds of non-targeting metabolic profiling in n-hexane extract from G. littoralis shoots.
Type Identified chemical common name Retention Time (sec) Formula Height Area
Fatty acid Myristic acid 1230.7 C14H28O2 850,138 18,956,032
Palmitic acid 1360.4 C16H32O2 10,547,870 377,925,050
Linolenic acid 1463.2 C18H30O2 17,176,334 465,785,210
Stearic acid 1471.4 C18H36O2 3,359,457 56,710,525
2-Palmitoylglycerol 1645.1 C19H38O4 5,473,921 107,914,605
Oleamide 1763.5 C18H35NO 833,706 14,235,975
Octacosane 1772.2 C28H58 731,772 13,744,576
Heptacosane 1814.2 C27H56 1,676,887 33,411,504
Terpenioids 3,7,11,15-Tetramethyl-2-hexadecen-1-ol 1279.9 C20H40O 27,154,310 443,346,725
Phytol 1440.3 C20H40O 21,024,348 438,270,016
Squalene 1777.7 C30H50 654,108 10,921,045
Phytyl acetate 2186.9 C22H42O2 3,695,703 201,354,894
Coumarin Phellopterin 1431.0 C17H16O5 1,063,863 19,663,095
Isopimpinellin 1505.6 C13H10O5 2,597,511 48,533,071
Imperatorin 1567.8 C16H14O4 10,859,477 275,003,398
Fatty alcohol 1-Nonadecanol 1814.5 C19H40O 1,685,730 33,906,897
Octacosanol 1899.0 C28H58O 4,045,024 94,246,944
Sterol Stigmasterol 1975.2 C29H48O 9,685,397 321,195,036
Campesterol 2010.4 C29H50O 7,197,643 265,400,275
Vitamin DL-alpha-Tocopherol acetate 1910.6 C29H50O2 19,211,198 480,605,042
Phytonadione 2024.1 C31H46O2 579,016 15,205,112
Polyacetylene Falcarinol 1401.1 C17H24O 9,846,175 168,581,605
Glycerol 2-Linoleoylglycerol 1727.0 C21H38O4 7,250,868 193,223,077
Wax Ester Tetracosane 1590.6 C24H50 3,357,341 61,500,824
Sesquiterpenes ç-Elemene 999.1 C15H24 577,651 9,193,753
Etc Heneicosane 1488.8 C21H44 1,580,736 27,926,208
(+)-alpha-Phellandrene 627.5 C10H16 2,793,696 50,074,114
2-Cyclohexen-1-one, 4-(1-methylethyl)- 793.2 C9H14O 3,309,467 67,985,563
Benzaldehyde, 4-(1-methylethyl)- 844.5 C10H12O 589,102 9,530,106
Naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydro-1,1,6-trimethyl- 941.9 C13H18 611,234 14,536,796
Carvenone oxide 1011.3 C10H16O2 1,092,521 20,112,694
2,4-Di-tert-butylphenol 1055.7 C14H22O 3,775,718 62,768,384
3,7,11,15-Tetramethyl-2-hexadecen-1-ol 1279.9 C20H40O 27,154,310 443,346,725
Methyl linolenate 1345.2 C19H32O2 7,280,550 267,689,278
Ledene oxide-(II) 1452.9 C15H24O 10,296,551 158,947,179
4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4-olide 1565.4 C21H40O2 2,938,619 18,941,003
Methyl (Z)-5,11,14,17-eicosatetraenoate 1730.9 C21H34O2 9,240,150 244,876,405
2-Nonadecanone 2012.9 C19H38O 1,648,851 29,828,340
i-Propyl 6,9,12-hexadecatrienoate 2178.1 C19H32O2 6,584,844 365,099,063
Isopropyl linoleate 2386.7 C21H38O2 974,640 62,357,362

총 40 여종 compound는 fatty acid, terpenoids, coumarin, fatty alcohol, sterol, vitamin, polyacetylene, glycerol, wax ester, sesquiterpenes 등으로 확인되었으며, 갯방풍 특유의 유효 성분 coumarin 계열 phellopterin, imperatorin, isopimpinellin과 polyacetylene 계열 falcarinol (panaxinol)이 정성분석 되었고, 갯방풍 생육 및 대사산물 합성 경로에 대한 추가적인 연구가 수행되어야 할 것으로 생각되어진다.

4. LC/UVD 정량분석

갯방풍 지상부에 함유된 coumarin 4 종 성분을 측정한 결과, 50% 에탄올 추출물에서는 scopoletin 2.11 ㎎/g, umbelliferone 0.09 ㎎/g, imperatorin 0.47 ㎎/g, phellopterin 0.02 ㎎/g이 검출되었다. 4종의 coumarin 성분 중 scopoletin이 다량 함유되어 있는 것을 확인하였다. 반면, 분획물 (Fig. 1)의 coumarin 4종 성분을 측정한 결과, 물층 < BuOH < chloroform < hexane < ethyl acetate 순으로 불검출, 0.53, 0.54, 1.07, 4.46 ㎎/g의 총 함량이 측정되었다 (Fig. 3 and Table 5).


Fig. 3.  LC/UVD targeting compounds chromatogram of extract and solvent fractions from G. littoralis shoots.

Representative LC/UVD chromatograms of coumarin type detected from shoots extract and fractions from G. littoralis. Std; standard coumarin chromatogram, A; 50% ethanol extraction, B; hexane fraction, C; chloroform fraction, D; ethyl acetate fraction, E; BuOH fraction, F; aqueous fraction.



Table 5 
LC/UVD quantitative analysis compounds of extract and solvent fractions from G. littoralis shoots.
Fraction Scopoletin (㎎/g) Umbelliferone (㎎/g) Imperatorin (㎎/g) Phellopterin (㎎/g) Total (㎎/g)
Extract (50% EtOH) 2.11±0.21 0.09±0.01 0.47±0.05 0.02±0.03 2.66±0.26
Hexane fraction 0.09±0.01 N.D.1) 0.88±0.02 0.10±0.00 1.07±0.97
Chloroform fraction 0.27±0.09 0.04±0.01 0.23±0.03 N.D. 0.54±0.80
Ethyl acetate fraction 4.28±0.24 0.01±0.03 0.17±0.05 N.D. 4.46±0.02
BuOH fraction 0.33±0.06 0.09±0.02 0.11±0.07 N.D. 0.53±0.26
Aqueous fraction N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
1)N.D.; not detected. Each value is means ± SD of three replicate tests.

분획물에서는 50% 에탄올 추출물과는 달리 phellopterin 검출되지 않았다. 이중, ethyl acetate 층에서는 scopoletin이 4.28 ㎎/g으로 다량 함유되어 있는 것이 확인되었고, haxane층의 chromatogram을 확인하였을 때, coumarin 4종 성분 이외에 정량되지 않은 미지의 peak들이 측정되어, 향후 추가적인 시험이 필요할 것으로 사료된다.

Um 등 (2010)은 갯방풍에서 scopoletin과 umblliferone을 분리하였고, 분리한 scopoletin 50 μM 농도에서 H2O2만 처리한 대조군 대비 약 60% 이상 reactive oxygen species (ROS) 소거능을 나타내었다. Chang 등 (1995)은 umbelliferone이 xanthine oxidase (XO) 억제에 매우 중요한 역할을 한다고 보고하였으며, Budzynska 등 (2015)는 imperatorin이 scopolamin에 의해 유발된 기억장애에 대해 보호할 수 있다고 보고하였다. 또한, Li 등 (2007)은 phellopterin이 전압 개폐형 및 수용체 의존성 칼슘 채널의 자극에 유도된 Ca2+ 유입을 억제한다고 보고하였으며, coumarin 계열은 항산화, 기억장애 보호 및 항균·함염 등의 활성이 보고되어지고 있다 (Ryu et al., 2001; Kontogiorgis and Hadjipavlou-Litina, 2005).

식물에는 다양한 항산화 성분이 함유되어 있고, 이러한 항산화 성분은 산화적 스트레스 및 신호로부터 식물체를 보호하는데 중요한 역할을 하며, 섭취 시에는 천연 항산화제의 역할을 하여 질병 예방에 도움을 줄 수 있지만 (Kasote et al., 2015), 항산화제 효능·효과, 경제성, 공급의 한계성과 같은 이유로 합성된 소재들이 사용되어왔다. 하지만, 안전성 및 소비자의 거부감으로 인하여 천연물 (육상, 해양식물) 자원 유래의 천연 항산화제 개발의 시도가 늘어나고 있다 (Park and Kweon, 2013).

본 시험에서 수행한 갯방풍 지상부 분획물에 대한 기초적인 생리활성 검증과 지상부에 함유된 compounds를 확인하였고, 분획 방법에 따른 유효성분 함량 변화를 측정하였다. 추가적인 연구를 통해 scopoletin, umbelliferone, phellopterin, imperatorin 외의 coumarin 계열의 compounds 분석 및 유효성 검증을 수행한다면, 기능성 소재로서의 가치와 해양식물의 활용도가 증가할 수 있을 것으로 생각되어진다.


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