본 실험에 사용한 소목은 (Caesalpinia sappan L.)은 서울 경동시장에서 구매를 하였으며, 표본시료 (OMRL-091024)는 경희대학교 한방재료가공센터 연구실에 보관되어 있다. 포 도상균의 배양에 Mueller-Hinton agar (MHA)와 Mueller- Hinton broth (MHB)를 Difco Laboratories사 (Baltimore, MD, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 원광대학교병원 (Iksan, Korea) 성형외과 환자들에서 분리한 MRSA 6주와 황 색포도구균 표준균주 (ATCC 25923) 및 MRSA 표준균주 (ATCC 33591) (ATCC, Manassas, VA, USA) 각 1주를 사 용하였다. 실험 전, 모든 포도상구균은 30% glycerol을 이용하 여 −70℃에 보관하였다가 실험 전 48시간 전에 37℃에 배양 하여 사용하였다.

HgB는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)로부터 구 입하여 사용하였으며, column chromatography (C. C.)용 silica gel (SiO₂)은 Kiesel gel 60 (Merck, Darmstadt, Germany), 그리고 octadecyl SiO₂ (ODS) gel은 LiChroprep RP-18 (Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. Thin layer chromatography (TLC)는 Kieselgel 60 F₂₅₄와 RP-18 F_254S (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였고, 실험에 이 용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum은 Varian Inova AS 400 (Varian, Palo Alto, CA, USA)으로 측정하였다.

건조 및 분쇄된 소목 5 kg을 80% MeOH 수용액 (20 L × 3)으로 실온에서 24시간 3회 추출한 후 여과지로 여과 하였다. 얻어진 추출물을 감압 농축하여 MeOH 추출물 (512 g)을 얻었다. MeOH 추출물은 H₂O (2 L)와 ethyl acetate (EtOAc, 2 L × 3)로 분배 추출 및 감압 농축하여 EtOAc 분획 (35 g)을 얻었다.

EtOAc 분획 (35 g)으로부터 SiO₂ c.c. (ϕ 6.5 × 20㎝, CHCl₃-MeOH-H₂O = 8 : 3 : 1 → 15 : 30 : 1 → 10 : 3 : 1→7 : 3 : 1, 1.3 L, 각 3 L)를 실시하여 16개의 분획 물 (E-1 ~ E-16)을 얻었다. 그 중에서 소분획 E-6 (3.8 g)을 SiO₂ c.c. (ϕ 4 × 15㎝, nCHCl₃-MeOH (7 : 1, 5.5 L)로 10개 의 분획 (E-6-1~E-6-10)으로 나누었다고, 그 중 화합물 1 (E- 6-5, 38㎎)를 분리하였다.

EI/MS m/z 284 [M]⁺; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO, δ_H) 7.90 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-1), 6.65 (1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz, H-2), 6.45 (1H, dd, J = 2.4 Hz, H-4), 4.08 (1H, J = 12.0 Hz, H-6a), 4.50 (1H, J = 12.0 Hz, H-6b), 2.95 (2H, s, H-7), 6.40 (1H, s, H-8), 6.98 (1H, s, H-11).

MRSA는 S. aureus가 항생제인 methicillin에 내성을 가지는 것이며, 유전체 중 Mobile genetic element A (mecA)라 불 리는 내성유전자를 획득함으로서 나타난다 (Kim, 2011). 따라 서 mecA 유전자 검출을 위해서 MHA에서 배양하고 증식한 한 개의 집락을 취하여, 300㎕의 cell lysis buffer 에 혼합하 였으며, 20분간 100℃로 가열한 다음, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 뒤, 상층액을 이용하였다. 추출한 DNA 2㎕ 를 MRSA Primer Mix Kit (Genotek Co., Daejeon, Korea) 를 이용하여 PCR을 시행하였다. PCR 반응조건은 94℃, 60초, 55℃, 60초, 72℃, 60초로 30회 반응시켰다. 증폭산물을 2% agarose gel에 넣고, 0.5% Tris-borate buffer에서 25분간 전기 영동하여 판독하였다.

최소억제농도 (Minimum inhibitory concentrations, MICs) 의 측정은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines에 기술된 broth microdilution method 에 따라 수행하였다. 실험 전, BRZ와 HgB는 DMSO (diluted using MH broth; v/v)를 이용하여 희석하였고 MHB에 연속 2배 희석으로 96well-plates 와 microtube에 준비하였다. S. aureus 접종물들은 0.5 McFarland standard (approximately 1.5 × 10⁸ colony-forming units (CFU)/mL)로 조정하였으며, 최종적으로 접종물들은 약 1.5 × 10⁶ CFU/spot로 희석되었다. MICs 값은 37℃에서 24시간 동안 배양하여 S. aureus의 성장 이 억제되는 가장 낮은 농도로서 정의하였다.

본 실험에 사용된 checkerboard method는 BRZ와 HgB사 이에 상호영향을 확인하기 위하여 사용하였다. MHA에서 밤 새 배양된 집락을 취하여 최종적으로 1.5 × 10⁶ CFU/spot으로 접종하였다. 96well-plates에 혼합효과를 측정할 BRZ와 HgB 를 최고 농도에서 연속 2배 희석하여 BRZ는 수평축으로 HgB는 수직축으로 각 well 에 연속적으로 희석하였다. 이후 37℃에서 24시간 동안 배양 후에 BRZ와 HgB의 상호적으로 억제한 가장 낮은 농도로서 정의하였으며, 두 약재 사이의 상 호작용은 fractional inhibitory concentration (FIC)로 나타내 었다.

FIC index는 공식에 따라 계산되었다:

A는 A 희석열에서 억제효과를 보이는 최소농도이며 B는 B 열에서 억제효과를 보이는 최소농도이다. MIC_A와 MIC_B는 BRZ와 HgB 각각의 최소억제농도이다. FIC index가 FIC index가 ≤ 0.5이면 synergism, > 0.5-4이면 indifference, > 4이 면 antagonism으로 정의하였다.

실험균주에 대한 time-kill 분석은 Fu 등 (2007)과 최 등 (2008)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였으며, S. aureus에 대해 BRZ와 HgB의 상승효과를 시간대별로 측정하 기 위하여 수행하였다. 시험균주는 MH broth에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였고, 이후 BRZ와 HgB을 연속 2배 희석하여 BRZ는 수평축으로 HgB는 수직축으로 각 well 에 연속적으로 희석하였으며, S. aureus의 접종물은 MIC 실험법 과 동일하게 최종적으로 약 1.5 × 10⁶ CFU/spot이 되도록 첨 가하였다. 이후 0, 12, 24, 36, 48 시간 동안 37℃에서 각각 배양한 후 600㎚에서 microplate reader로 측정하였다.

소목을 80% MeOH로 추출하였고, 추출물을 극성에 따라 EtOAc로 분배 추출하였다. EtOAc 분획에 대하여 Silica gel 컬럼을 이용하여 화합물 1을 분리하였다. 화합물 1(reddishcrystals) 은 TLC에 전개하고, 10% 황산 발색 시 붉은색으로 발색되었으며, EI/MS 측정결과 분자량은 284 [M]⁺로 결정을 하였다. ¹H-NMR (400MHz, DMSO, δ_H) spectrum 데이터 분석 결과, δ_H 7.90 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-1), 6.65 (1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz, H-2) 및 6.45 (1H, dd, J = 2.4 Hz, H-4) 의 signal로부터 1,2,4-3치환 benzene이 존재함을 확인할 수 있었고, δ_H 6.40 (1H, s, H-8), 6.98 (1H, s, H-11)의 signal 로부터 이중결합이 존재함을 확인하였다. 산소가 치환된 영역 에서는 δ_H 4.08 (1H, J = 12.0 Hz, H-6a) 및 4.50 (1H, J = 12.0 Hz, H-6b)로부터 한 개의 oxygenated methylene proton이 존재를 확인 하였으며, 고자장 영역에서는 적분 값이 2로 나타난(1H: 1) methylene proton [δ_H 2.95 (2H, s, H-7)] signal이 관측되었다. Proton NMR data를 종합한 결과, 화합 물 1은 소목에서 주요화합물로 보고되어 있는 brazilein으로 구조 동정을 하였고, proton 및 carbon data를 참고문헌 (Kim et al., 1997)과 비교하여 brazilein임을 최종 구조결정 하였다.11

Fig. 1.  Chemical structure of Brazilein (BRZ).

1940년대 초, S. aureus 감염증의 치료를 위해 penicillin, methicillin 등의 항생제를 사용하여 왔으나, 1940년대 후반에 penicillin에 대하여 내성을 나타내기 시작하였으며, 1950년대 에 tetracycline, chlororamphenicol 및 erythromycin에 대해서 도 내성이 나타나기 시작하였다 (Leclercq et al., 1998; Kim et al., 2010). 1961년에는 MRSA가 보고되었고 그 출현빈도 는 계속 증가하고 있으며, MRSA 감염증으로 인한 사망자의 비율 또한 1993년에 12%에서 2002년에 66%로 급증하였다 (Kim et al., 2013). 특히 2004년에 발표된 대학병원 중환자실 병원 감염 감시결과에 따르면, 전국 16개의 만 15세 이상의 환자를 대상으로 분리된 S. aureus 중 93%가 MRSA라고 보 고되었다 (Kim, 2013). S. aureus는 세포벽 합성단백질인 penicillin binding protein의 변형되고 low affinity penicillin binding protein (PBP2’ 또는 PBP 2a)이 생성된 경우이며, 이 변형된 PBP를 encoding하는 유전자인 mecA 유전자를 검 출할 경우 MRSA라 동정하고 있으며 MRSA에 특이적인 mecA 유전자는 Staphylococcal cassette chromosome mec 라 불리는 이동성 유전자에 위치하고 있으며 독성과 내성을 운반 하고 다른 종간에도 전파가 가능하다고 알려지고 있다 (Kim, 2011). 따라서 음성 대조군으로 methicillin에 감수성을 나타내 는 S. aureus인 MSSA (methicillin-susceptible S. aureus) 표 준균주 (ATCC 25923)와 양성 대조군인 MRSA 표준균주 (ATCC 33591) 및 분리된 6 균주의 내성 여부를 mecA 유전 자 검출로서 측정하여 Table 2에 나타내었다.

식물에서 항균 활성이 있는 물질을 추출해 내고 자 하는 연 구는 전 세계적으로 오래전부터 진행되어 왔으며 항생제 내성 균들이 등장하여 새로운 항생제에 대한 개발요구가 증대됨에 따라 최근 이에 대한 연구는 더욱 활발하게 진행되고 있다 (Aqil et al., 2005; Jang et al., 2012; Kim et al., 2013). 따라서 본 연구는 식물로부터 항균물질을 찾아내기 위한 연구 의 일환으로, 우리나라에서 오래 동안 사용되어 인체에 큰 해 가 없는 것으로 알려진 한약 재료 중의 하나인 소목에서 BRZ을 분리하여 항균활성이 있는 추출물을 감염성 질환의 치 료에 사용할 수 있게 함을 목표로 시행되었다. 소목은 콩과 (Leguminosae)의 식물로 Caesalpinia sappan L.의 심재를 전 통 한약으로 행혈 (行血) • 지혈 • 구어혈 (驅瘀血) • 진통 • 소종 (消腫)의 치료를 위하여 사용되어 왔다 (Kwon et al., 2007; Eum et al., 2013). 또한 HgB는 임상적으로는 중요하지 않으 나 매우 광범위한 항균활성을 가지고 있는 aminoglycoside계 항생물질이며 가축에 대한 구충을 목적으로 사료첨가제로 사 용되고 있다. (Kalivoda et al., 2011). 따라서 Standard broth microdilution method에 따라 총 6개의 포도상구균에 대하여 BRZ와 HgB의 항균 감수성 측정을 수행하였으며, 측정된 포 도상구균에 대하여 BRZ는 62.5-500㎍/mL, HgB는 250- 500㎍/mL에서 억제되었다. 대조구로 사용된 oxacillin은 1.9- 500㎍/mL 이상으로 측정되었다. 이는 실험에 사용된 균주들 이 methicillin 뿐만 아니라 β-lactam 계열 항생제인 oxacillin 에서도 내성을 보유한 것이며, oxcaillin 보다 S. aureus에 대 한 항균력은 BRZ가 더 높다는 것을 보여주었다. 측정된 BRZ 와 HgB의 MIC는 Table 3에 나타내었다.

현재 사용되는 항생제는 심각한 부작용과 내성으로 국가차 원에서 사용량을 제한하고 있으며, 특히 aminoglycoside계 항 생물질은 대체로 심각한 이독성과 신독성에 대한 우려로 BRZ 를 비롯한 천연 항균물질을 이용하여 부작용이 높은 항생물질 에 대한 사용량을 줄이면서 우수한 효능을 가진 새로운 항생 제 개발이 현재 주목받고 있다 (Kettle and Schacht, 2002). BRZ와 HgB의 상승효과는 checkerboard dilution assay를 사 용하여 측정한 결과를 FIC index로 나타내었다. MRSA 표준 균주인 ATCC 33591에 대한 FICI는 0.18로 상승효과를 나타 내었으며, MSSA 표준균주인 ATCC 25923 또한 0.5로 상승 효과를 나타내었다. 또한 2개의 임상분리 균주 (KWMrI 1039 및 KWMrI 1040)에 대해서도 0.18 및 0.5로 상승효과를 나 타내었다. 결론적으로 실험한 모든 S. aureus 균주에 대하여 BRZ는 HgB의 MIC값을 감소시켰으며, HgB 또한 BRZ의 MIC값의 감소를 나타내므로 각각의 성분에 대한 특이적인 화 학적 작용으로 활성이 증가한 것으로 생각된다 (Table 4).

BRZ와 HgB 혼합에 따른 상승작용을 증명하기 위하여 MRSA 표준균주와 MSSA 표준균주에 BRZ와 HgB을 혼합 처리하여 Time-kill 분석을 실시하였다. Fig 2-3.에 나타난 바 와 같이, MRSA 균주에서 BRZ는 3.9㎍/mL의 농도와 HgB 62.5㎍/mL에서의 농도에서 균의 성장을 완전히 저해하지 않 았으나 BRZ는 3.9㎍/mL의 농도와 HgB 62.5㎍/mL을 혼합 처리 시 MRSA 균주를 48시간이 지나도록 완전히 억제하는 것으로 나타났다. 또한 MSSA 균주에서도 HgB 125㎍/mL 와 BRZ 15.6㎍/mL을 혼합 처리 시 MSSA 균주를 완전히 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 추가연구를 통하여 독성여 부와 전신 투여 가능성 여부가 규명된다면 새로운 항균제로서 사용이 가능할 것이며 우수한 신약후보물질이 될 수 있을 것 으로 사료된다.

Fig. 2.  The time-kill curves of brazilein against the standard MSSA (ATCC 25923) strain.

The growth of bacteria was determined by measuring the OD of the cultures at 600㎚.

Fig. 3.  The time-kill curves of brazilein against the standard MRSA (ATCC 33591) strain.

The growth of bacteria was by measuring the OD of the cultures at 600㎚.