쥐꼬리망초 (Justicia procumbens)를 비롯한 126과, 599종의 식물체 (Table 1)를 상온조건 음지에서 건조한 다음 0.6mm이 하로 분쇄하여 건조시료를 제조하고, 준비된 건조시료 100 g 을 5 L 삼각플라스크에 넣고 99% methanol 2 L를 부어 실온 에서 24시간 두었다. Methanol 추출액은 부흐너깔때기 (Buchner funnel, Daihan Scientific, Seoul, Korea)에 whatman여과지 (#1, Whatman International Ltd., Maidstone, England)를 사용하여 감압 여과하였다. 감압 여과된 methanol 분획은 회전진공농축기 (R-215, BCHI Labortechnik AG, Flawil, Switzerland)를 이용하여 45°C에서 감압 농축한 후 동 결 건조 (IlshinBiobase, Dongdoochun, Korea)하여 methanol 조추출물로 조제한 다음 냉동 보관 (–5 ± 1°C)하면서 항균성 실험에 사용하였다.

항균 활성 시험에 사용한 균주는 농촌진흥청 농업유전자원 센터의 KACC (Korean Agricultural Culture Collection (RDA-Genebank Information Center, Jeonju, Korea)로부터 분양받은 미생물을 사용하였는데 그람양성 세균으로는 Staphylococcus aureus (S. aureus, KACC 10768)를 그람음 성 세균으로는 Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa, KACC 10185)을 그리고 항진균 활성에는 효모류인 Candida albicans (C. albicans KACC 30003)를 사용하였으며 세균류 의 배양용 배지는 Nutrient agar배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)를 진균류의 배양용 배지는 YPD배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)를 사용하였다. 시험균주들은 각각의 배지에 접종하여 30°C에서 2-3일간 배 양한 다음 5°C냉장고에 보관하였으며 미생물 생육억제 시험 48시간 전에 세균류는 Nutrient broth배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)에 그리고 진균류는 YPD broth배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)에 각 각 재배양하여 시험에 사용하였다.

식물체 methanol 조추출물 0.1 g을 ethanol 1 mL에 녹이고 (10% W/V, 100mg ml^–1), 이를 다시 2차 증류수로 다시 10배 희석한 조추출물 희석액 (1% W/V, 10mg mL^–1)을 준비 하여 미생물 생육억제 시험에 사용하였다.

미생물 생육억제 활성검정은 96-well microplate (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하였는데, 96-well microplate의 각 홀에 식물체 조추출물 희석액 (1% W/V, 10mg mL^–1) 30 μL와 살균증류수에 희석시킨 미생물 배 양체 희석액 (1X10⁴ CFU ml^–1) 30 μL를 혼합하여 총 60 μL로 만들어 microplate well에서의 최종적으로 식물체 조 추출물 농도를 5,000μg ml^–1 (5mg mL^–1)로 조정하여 식물체 조추출물의 미생물 생육억제 효과를 조사하였다.

Positive control로는 식물체 조추출물 희석액 대신에 nutrient broth나 YPD broth를 첨가하였고 negative control로 는 식물체 조추출물 희석액 대신에 멸균증류수를 첨가하였다. 미생물이 접종된 96-well microplate는 건조와 오염을 방지하 기 위하여 microplate 뚜껑을 덮은 다음 주방용 랩 (Lock & Lock Co., Asan, Korea)으로 밀봉하여 30°C로 조절된 항온배 양기 (Multi Thermo Incubator MTI-202, EYELA, Tokyo, Japan)에서 배양하였다.

접종된 96-well microplate는 도립현미경 (CKX41, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 배양 1일 후 부터 미생물의 증식을 관찰하였다.

식물체 조추출물의 미생물 생육억제 효과의 표시는 positive control에서의 미생물 증식농도에 대비하여 식물체 조추출물 첨가시 미생물 증식농도가 90 ± 10% 정도로 증식되는 경우에 는 –, 60 ± 20% 증식되는 경우에는 +, 25 ± 15% 증식되는 경우에는 ++ 그리고 positive control대비 10%이하의 증식이 나타나는 경우에는 +++로 표시하였다 (Table 2).

Family	Scientific name	Plant parts	growth inhibitionb			Family	Scientific name	Plant parts	growth inhibitionb
			S.a.c	P.a.	C.a.				S.a.	P.a.	C.a.

식물체 추출물에 대한 96-well microplate이용 생육억제 효 과 시험은 1회 시험에 3반복이상 실시하였으며 3회 이상 실 시하여 일관된 생육억제 효과가 나오는 것을 확인한 다음 항 균효과에 대한 결과를 작성하였다.

126과, 599종의 식물에서 뿌리, 잎 등의 부위별로 나누 어 methanol로 추출한 조추출물 708종의 조추출물이 화장품 에 주로 오염원이 되는 3종 미생물, Staphyloccus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans등의 생육에 미치는 영향을 조사하였다 (Table 2).

S. aureus에 대하여 positive control 대비, 90%이상의 생육 억제 효과를 나타낸 식물추출물은 노박덩굴 (Celastrus orbiculatus)의 잎부위, 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi)의 뿌리, 대황 (Rheum undulatum Linne)의 지상부, 누린내풀 (Caryopteris divaricata)의 지상부 부위를 비롯한 4종이었으 며 P. aeruginosa에 대해서는 내장단풍 (Acer palmatum var. nakaii)의 잎부위 추출물을 비롯한 38종으로 나타났다 (Table 2).

Ham 등(2013)에 따르면 S. aureus에 효과적인 항균작용을 나타내는 식물은 탱자나무 (Poncirus trifoliata)의 ethanol 추 출물, 홍화 (Carthamus tinctorius)의 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 추출물이라 보고하였는데 본 연구에 사 용된 탱자나무 (Poncirus trifoliata)의 methanol 추출물에서는 활성이 나타나지 않았는데 추후 재검토가 필요하다.

국내 한약재에서의 항균활성 연구 (Doh, 2010)에서 지유 (Sanguisorba officinalis), 황련 (Coptis chinensis) 그리고 마 치현 (Portulaca oleracea)의 물, 메탄올 추출물에서 S. aureus와 Vibrio parahaemolyticus에 강한 항균 활성을 가지며, 물보다는 메탄올 추출액의 항균 활성이 높은 것으로 나타났으 며 특히 지유 (Sanguisorba officinalis)의 물 및 메탄올추출물 이 S. aureus 및 V. parahaemolyticus에 대하여 강한 항균 활 성이 보고하였다. 본 연구에서는 지유 (Sanguisorba officinalis) 메탄올 추출물이 S. aureus에 대해서 생육억제효과가 없는 것 으로 나타났는데 Doh (2010)의 연구에서는 사용된 추출물 농 도가 5% 희석농도임에 비해서 본 연구에서 사용된 지유 (Sanguisorba officinalis) 메탄올 추출물 희석농도는 Doh (2010)의 연구에 비해서 1/10의 낮은 농도 (0.5%)로 사용되어 생육억제 효과가 나타나지 않은 것으로 판단된다.

녹농균인 Pseudomonas aeruginosa는 병원내 감염의 주요한 원인균 중의 하나로 각종의 임상검체나 병원 환경에서도 분리 되며, 종양환자나 면역기능이 떨어진 환자에게 감염이 쉽게 유 발되며 화장품에서도 발견된 사례가 보고되는 세균이다.

P. aeruginosa에 대해서 90%이상의 생육억제 효과를 나타낸 추출물은 내장단풍 (Acer palmatum var. nakaii) 잎, 석창포 (Acorus gramineus Sol.) 지상부, 우슬 (Achyranthes japonica) 전초, 창포 (Acorus calamus var. angustatus) 뿌리, 섬댕강나무 (Abelia coreana var. insularis) 잎 및 줄기, 참개별꽃 (Pseudostellaria coreana) 전초, 노박덩굴 (Celastrus orbiculatus Thunb.) 잎, 측백나무 (Thuja orientalis) 잎, 국화마 (Dioscorea septemloba) 뿌리, 진달래 (Rhododendron mucronulatum Turcz.) 지상부, 개수염 (Eriocaulon miquelianum) 전초, 땅빈 대 (Euphorbia humifusa) 전초, 펠라고니움 (Pelargonium inquinans) 전초, 물수세미 (Myriophyllum verticillatum) 전초, 글라디올러스 (Gladiolus gandavensis Van) 잎 줄기, 타래붓꽃 (Iris lactea var. chinensis) 뿌리, 창포붓꽃 (Iris netschinskia) 씨앗, 송장풀 (Leonurus macranthus) 전초, 익모초 (Leonurus sibiricus) 뿌리, 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi) 뿌리, 수 골무꽃 (Scutellaria dentata var. alpina) 전초, 비목나무 (Lindera erythrocarpa) 과실, 삿갓나물 (Paris verticillata) 전 초, 댕댕이덩굴 (Cocculus trilobus) 과실, 상동잎쥐똥나무 (Ligustrum quihoui var. latifolium) 잎, 타래난초 (Spiranthes sinensis) 전초, 백송 (Pinus bungeana) 잎, 싱아 (Aconogonum polymorphum) 지상부, 가는개여뀌 (Persicaria trigonocarpa Nakai) 지상부, 봄여뀌 (Persicaria vulgaris) 전 초, 큰꽃으아리 (Clematis patens) 지상부, 큰꽃으아리 (Clematis patens) 뿌리, 상동나무 (Sageretia theezans) 잎 줄 기, 매실나무 (Prunus mume) 잎, 섬황벽나무 (Phellodendron insulare) 잎, 팥꽃나무 (Daphne genkwa) 지상부, 금마타리 (Patrinia saniculaefolia) 전초, 누린내풀 (Caryopteris divaricata) 뿌리추출물 등 38종으로 나타났다.

Moon 등 (2004)의 연구에 의하면 P. aeruginosa를 비롯하여 B. subtilis, S. aureus, S. epidermidis 등에 항균력을 가진 약 용식물은 감국 (Chrysanthemum indicum), 감초 (Glycyrrhiza uralensis), 계피 (Cinnamomum cassia), 녹차나무 (Camellia sinensis), 모과나무 (Chaenomeles sinensis), 목단 (Paeonia suffruticosa), 애엽 (Artemisia princeps), 인진호 (Artemisia capillaris), 적양 (Alnus japonica), 정향 (Syringa pubescens subsp. patula), 천초 (Zanthoxylum bungeanum), 측백 (Platycladus orientalis), 팔각향 (Illicium verum) 등을 보고하 였는데 본 연구에서는 측백 (Platycladus orientalis) 추출물이 동일한 결과를 보였으나 목단 (Paeonia suffruticosa) 추출물 등은 효과가 없었는데, 앞으로 본 연구결과와 상이한 부분에 대해서는 차후에 동시 실험을 실시하는 것이 좋을 것으로 생 각된다.

Eum (2012)의 연구에서는 P. aeruginosa에 대한 항균물질을 찾기 위하여 한의학에서 전통적으로 사용되어 오던 34종류의 약용식물로부터 에탄올 추출물들을 이용하여 항균활성을 조사 한 결과 치자나무 (Gardenia jasminoides), 우엉 (Arctium lappa), 귤나무 (Citrus unshiu), 황벽나무 (Phellodendron amurense) 등의 에탄올 추출물들이 P. aeruginosa ATCC 27853에 대해서 항균활성을 나타내었다고 하였으며 이들 중 치자나무 (Gardenia jasminoides)의 에탄올 추출물은 P. aeruginosa에 대해 강한 항균활성을 나타내었다고 보고하였는 데 본 연구의 메탄올 조추출물에서는 생육억제 효과가 나타나 지 않았다.

S. aureus와 P. aeruginosa에 대해서 동시에 90%이상의 생 육억제 효과를 나타낸 식물추출물은 노박덩굴 (Celastrus orbiculatus)의 잎, 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi) 뿌리, 대황 (Rheum undulatum Linne) 지상부, 누린내풀 (Caryopteris divaricata) 지상부 부위로 나타나 (Table 2) 이들 추출물들은 앞으로 항세균제 용도로 활용성이 높을 것으로 생각된다.

사람에게 구내염과 질염 등 칸디다증을 유발하는 진균류인 Candida albicans에 대해서 60%이상의 생육억제효과를 나타 낸 추출물은 좀꽝꽝나무 (Ilex crenata var. microphylla) 잎, 등칡 (Aristolochia manshuriensis) 줄기, 병풍취 (Cacalia firma) 지상부, 층층나무 (Cornus controversa) 과병, 너도밤나 무 (Fagus crenata var. multinervis) 잎, 호밀 (Secale cereale) 전초, 등나무 (Wisteria floribunda) 충낭, 가침박달나 무 (Exochorda serratifolia) 줄기, 사과나무 (Malus pumila var. dulcissima) 줄기, 쉬나무 (Evodia daniellii) 잎부위 등 10종으로 나타났다.

특히 너도밤나무 (Fagus crenata var. multinervis)의 잎부위 추출물은 90%이상의 증식억제효과를 나타내어 가장 높은 억 제효과를 나타내었고 사과나무 (Malus pumila var. dulcissima) 의 경우 줄기부위 추출물은 생육억제효과를 나타내었으나 잎 부위에서의 추출물은 억제효과가 나타나지 않아 식물체 부위 별로 뚜렷한 차이가 나타났다.

Cho 등 (2008)의 연구에서는 오배자 (chinese galls, Rhus javanica) 추출물이 그람 양성균인 Staphylococcus aureus와 그람 음성균인 Pseudomonas aeruginosa와 E. coli에 대한 항 세균 활성이 우수하였고, 육계나무 (Cinnamomum cassia) 추 출물은 효모균인 Candida albicans와 진균류인 Aspergillus niger에 대해 우수한 항진균 활성을 나타내었다고 보고하였다.

Shim (2008)의 연구에서는 고삼추출물, 황금추출물 그리고 황금+고삼추출물 등이 1주 배양시 Candida albicans를 사멸시 켜 고삼추출물과 황금추출물이 Candida albicans에 대해서 우 수한 항균력을 갖고 있음을 확인하였는데 본 연구에서는 오배 자 (chinese galls), 육계나무 (Cinnamomum cassia), 고삼 (Sophora flavescens) 추출물 등이 본 연구에 포함되지 않아 실험결과의 직접적인 비교가 어려웠다.

다만 본 연구에서 황금 (Scutellaria baicalensis)의 메탄올 조 추출물은 Staphylococcus aureus와 Pseudomonas aeruginosa에 대해서 생육억제 효과가 나타났으나 Candida albicans에 대해 서는 억제효과가 나타나지 않았다.

Seong (2006)의 연구에서는 백작약 (Paeonia japonica)의 dichloromethane추출물과 methanol추출물이 C. albicans에 대 하여 높은 수준의 항진균 활성을 나타내었고 물 추출물은 항 균 활성이 없었고 methanol추출물보다 dichloromethane 추출 물의 항균활성이 높았다고 보고하였는데 본 연구에서 사용된 작약 (Paeonia japonica)에서는 생육억제 효과가 나타나지 않 아 Paeonia 근연종간에서 항균활성에 대한 차이점이 실제로 존재하는지는 좀 더 연구가 진행되어야 할 것 같다.

Kim 등 (2009)의 연구에서는 수종의 한약재를 에탄올로 추 출하여 Candida속 진균류에 대한 생육저해 효과를 연구하였는 데 깽깽이풀 (Jeffersonia dubia, 황련) 추출물은 C. albicans에 대해서, C. tropicalis에 대해서는 민들레 (Taraxacum mongolicum, 포공영) 추출물, 약모밀 (Houttuynia cordata, 어 성초) 추출물, 작약 (Paeonia lactiflora var. hortensis) 추출물 이 저해효과를 나타내었으며 이들 추출물은 C. glabrata, C. parapsilesis, C. utils 등 3개종에 대해서는 항균활성은 나타나 지 않았다고 보고하였는데 본 연구에 사용된 깽깽이풀 (Jeffersonia dubia, 황련)의 메탄올 추출물은 C. albicans에 대한 생육억제 효과가 나타나지 않았다.

본 연구에서는 10종의 식물추출물이 C. albicans에 대하여 상당한 수준의 항진균 활성을 나타내므로 앞으로의 연구를 통 하여 사람에 대한 안전성 여부가 규명된다면 화장품에 첨가할 수 있는 천연 항진균성 보존제의 소재로 사용될 가능성이 있 다고 생각된다.

Cho 등 (2008)의 연구에서 가자, 오배자, 계피추출물을 단독 으로 사용했을 때는 세균과 진균에 대해 충분한 항균 활성을 갖지 못했지만 3종 식물 추출물을 조합한 최적 조합비로 구성 된 혼합추출물은 세균과 진균에 대해 상호 보완적인 작용을 하여 S. aureus, P. aeruginosa, E. coli 등의 세균류와 C. albicans, Aspergillus niger 등의 진균류에 대해 우수한 항균 활성을 나타내었고 상업적으로 널리 사용되고 있는 파라벤 혼 합 방부제와 유사한 정도의 방부 활성을 나타냄을 확인한바 있다.

본 연구에서는 Cho 등 (2008)의 연구에서 사용된 3종 식물 추출물에 대한 미생물 생육억제실험이 진행되어 않아 직접적 인 비교가 어려우나 본 연구에서 생육억제활성이 나타난 식물 추출물을 조합하여 비교 실험할 필요가 있을 것으로 생각된다.

2종의 세균, S. aureus, P. aeruginosa에 대해서 동시에 90%이상의 생육억제 효과를 나타낸 식물 중에서 노박덩굴 (Celastrus orbiculatus)의 잎, 대황 (Rheum undulatum)의 지 상부, 누린내풀 (Caryopteris divaricata)의 지상부, 그리고 C. albicans에 생육억제 효과를 나타낸 식물중에서 좀꽝꽝나무 (Ilex crenata var. microphylla)의 잎, 등칡 (Aristolochia manshuriensis)의 줄기, 병풍취 (Cacalia firma)의 지상부, 너 도밤나무 (Fagus crenata var. multinervis)의 잎, 호밀 (Secale cereale)의 전체부위, 사과나무 (Malus pumila var. dulcissima)의 줄기 등은 한약재에 비해서 가격이 싸고 비교적 재배가 쉬우며 생체량이 많고 산야에서 쉽게 자랄 수 있는 종 류로 이들 추출물 재료에 대한 경제성은 충분히 확보될 수 있 을 것으로 여겨진다.

앞으로 이들 추출물들에 대한 인체 독성의 안전성 실험이 밝혀진다면 화장품첨가용 천연보존제 혹은 다양한 세균 및 진 균의 감염에 의해서 유발되는 여러 감염성질환의 치료 및 병 원내 감염을 예방하는 천연항균 대체 물질로서 다양하게 사용 될 가능성이 있을 것으로 생각되며 앞으로 식물 기원의 천연 살균 물질을 연구하는 연구자에게 이 연구가 참고 자료가 되 었으면 한다.