본 실험에 사용된 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물은 제주 대학교 생물학과 분자생물학실험실로부터 제공받아 사용하였 고 추출방법은 Shin 등 (2011)의 논문에 기술한 바와 같다 (Shin et al., 2011).

Human neuroblastoma SH-SY5Y 세포는 한국 세포주은행 에서 분양 받아 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS), 100 unit/ml penicillin/ streptomycin, 20 mM HEPES 가 포함된 Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM, Gibco, Carlsbad, CA, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였다. 실험을 위해 세포는 1 × 10⁶ cells/ml의 농도로 심어 48시간 배양한 후 FBS가 포함되지 않은 배지로 교환하였다. 20시간 안정화시킨 후 최종농도가 1, 10, 100, 500 μM 되도록 MPP⁺를 처리하여 세포사멸 효과를 확인하였 고 에탄올에 녹인 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물은 최종농 도가 10, 50, 100, 200μg/ml 되도록 처리하여 세포사멸 보호 효과를 관찰하였다.

세포 생존율은 trypan-blue를 이용하여 측정하였다. 24 well plate (1 × 10⁵ cells/well)에 분주된 세포에 MPP⁺ 또는 각각의 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후 세포를 모두 수거하여 0.4% trypan-blue와 섞어 hemo-cytometer를 이용하 여 살아있는 세포수와 죽은 세포수를 계수하였다. 아래의 식 을 이용하여 생존율을 산출하였다.

세포 생존율 (%) =살아있는 세포수 / (살아있는 세포수 +죽은세포 수) × 100

시료의 독성을 확인하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)- 2,5-diphenyl-terazolium bromide (MTT; Sigma, St. Louis, MO, USA) 분석법을 수행하였다. 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양한 세포 (1 × 10⁵ cells/ well)에 MTT용액 (0.2mg/ml)을 첨가하여 3시간 반응시킨 후 배지를 모두 제거하였다. 생성된 formazan을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 녹여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

Phosphate buffered saline (PBS) 수세 후 수확한 세포에 protease inhibitor가 포함된 lysis buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X- 100)를 넣어 30분간 반응한 후 14,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 얻어진 30μg의 단백질을 10% polyacrylamide gel에 서 전기영동하였다. 분리된 단백질은 nitrocellulose membrane 에 전이시킨 후 단백질 발현 분석을 위해 anti-mouse PARP (Santa Cruz Biotech, Dallas, TA, USA), anti-rabbit cleaved caspase-3 (Cell signaling, Danvers, MA, USA), anti-mouse beta-actin (Sigma, St. Louis, MO, USA) 항체를 이용하여 반응하였고 enhanced chemiluminescence kit (ECL) 방법으로 확인하였다

본 실험의 결과는 3회 반복하여 평균 ± 표준편차로 표시 하였다. 통계처리는 Student’s t-test에 의해 수행되었으며 p < 0.05인 경우 유의한 것으로 판정하였다.

퇴행성 신경계 뇌혈관질환의 하나인 파킨슨병은 도파민의 부족으로 발병되어 각종 증상이 유발되는데 이는 뇌 흑질의 신경세포의 사멸과 관련되어 있는 것으로 보고되어 있다 (Gelb et al., 1999; Bae et al., 2010). 뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨병과 같이 신경세포의 사멸로 인해 신경손상이 심각할 경우 완전한 회복이 어려워 이를 예방 및 극복하기 위한 많은 방안들을 모색하기 위해 노력하고 있다. 본 연구에서는 신경 손상을 보호하기 위한 기능성 소재를 찾아보고자 진귤 과피 추출물의 신경세포 사멸 보호 효과를 조사하였다. 파킨슨병과 연관된 세포사멸 기전을 연구하기 위해서 주로 사용하는 약물 은 MPP⁺로 이는 신경독성물질인 MPTP가 뇌혈관장벽을 통과 해 세포에서 MPP⁺라는 대사물질로 바뀌어 신경세포에 독성을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 따라서 본 실험에서 도 파킨슨병을 유발하기 위해 인간 신경세포인 SH-SY5Y 세 포에 MPP⁺를 사용하여 신경 세포 사멸에 미치는 영향을 알아 보고자 trypan blue exclusion 분석을 통해 생존율을 측정하 였다. 다양한 농도 (1-500 μM)의 MPP⁺를 신경세포에 24시간 동안 처리한 결과, 1-50 μM 농도에서는 세포 사멸 효과가 거 의 나타나지 않았고 100 μM 처리군에서는 57%의 생존율을 보여 유의적으로 세포 생존율이 감소하기 시작하였으며 500 μM 농도에서는 40%의 낮은 생존율을 나타내었다 (Fig. 1A).

세포사멸 조절은 산화적 스트레스와 같은 다양한 요인에 의 해 활성화되는 caspase 신호전달 경로를 통해 이루어진다. 미토콘드리아에서 방출된 cytoch-rome c, Apaf, caspase-9에 의 해 형성된 apoptosome은 세포사멸에 직접적으로 관여하는 caspase-3의 활성화와 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)의 분절화를 유도하며 세포의 응축이나 핵의 분해 등 구조적인 변 화단계를 거치게 된다 (Bredesen et al., 2006; Delivoria- Papadopoulos et al., 2007). MPP⁺에 의한 세포 사멸이 caspase-3의 활성화를 통해 조절되는지 확인하기 위해 사멸 관 련 단백질들의 발현을 분석하였다. 그 결과, 대조군에 비해 100 μM과 500 μM의 농도로 처리된 MPP⁺ 처리군에서 핵 내 에 존재하는 PARP의 분절현상이 관찰되었고 caspase-3의 경 우 불활성화 상태에서 사멸이 진행될수록 분절화된 형태로 바 뀌게 되어 cleaved 형태의 활성형이 증가되는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 1B). 이러한 결과는 MPP⁺에 의한 신경세포 사멸이 caspase-3 경로를 통해 조절되고 있음을 보여주는 것 이다.

Fig. 1. 

Induction of caspase-mediated neuronal cell death. (A) Neurotoxicity of MPP⁺ on SH-SY5Y cells by trypan blue exclusion. Data are represented as mean ± SD of 3 separate experiments. *p < 0.05 vs control (B) Expression of apoptosis- related proteins by western blot analysis.

진귤은 제주도에서 자생하는 재래종 감귤로 이들의 말린 과 피인 진피는 한약재의 소재로 널리 사용되고 있다. Citrus속의 성분 및 생리활성 분석을 통해 과육보다는 과피의 중요성이 강조되었고 (Yusof et al., 1990) 다른 식물이 거의 가지고 있 지 않은 감귤 특유의 성분인 tangeretin이나 nobiletin 같은 polymethoxylated flavones을 다량 함유하고 있다 (Nogata et al., 2006; Shin et al., 2011). 이들은 수확시기에 따라 생리 활성물질의 함유량에 많은 변화를 가지고 있으며 항염, 항산 화 효능 외 항비만에 효과적인 것으로 보고되어 있다 (Choi et al., 2007; Shin et al., 2011; Hyon et al., 2010; Kang et al., 2012). 그러나, 진귤과 뇌혈관질환성 신경손상과의 관련 성 및 진귤의 성숙되는 정도에 따른 효능에 대해서는 거의 알 려져 있지 않다. 따라서 예로부터 약재로 계속하여 사용하고 있는 진귤 과피의 성숙 정도가 신경손상 회복에 어떠한 영향 을 미치는지 알아보고자 미성숙 진귤 과피와 성숙 진귤 과피 추출물을 이용하여 신경세포 손상에 대한 보호효능을 조사하 였다. 먼저 80% 에탄올을 이용하여 추출한 미성숙 과피 추출 물과 성숙 과피 추출물의 독성을 확인하기 위해 SH-SY5Y 신 경세포에 각각의 추출물을 10μg/ml에서 200μg/ml까지의 농 도로 처리하였다. 그 결과, 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물 을 처리한 실험군 모두에서 대조군과 유사한 생존율을 나타 내는 것으로 보아 세포 독성에는 아무런 영향을 미치지 않 았다 (Fig. 2A). 미성숙 및 성숙 진귤 과피 추출물의 신경세 포 보호 효과를 살펴보기 위해 신경세포에 각각의 추출물을 농도별로 30분 전처리한 후 250 μM의 MPP⁺를 처리하였고 24시간동안 배양한 후 이들의 생존율을 trypan blue exclusion 으로 측정하였다. 성숙 진귤 과피 추출물을 처리한 경우, 10μg/ml 농도에서는 50%의 생존율을, 200μg/ml의 농도에서 는 58%의 생존율을 나타내었다. 이는 52% 생존율을 보인 MPP⁺ 처리군과 별다른 차이를 보이지 않는 결과로서 성숙 진 귤 과피 추출물의 신경세포 보호 효과는 관찰 할 수 없었다. 반면, 미성숙 진귤 과피 추출물의 경우 100μg/ml과 200μg/ml의 농도로 처리한 후 세포의 생존율은 78%로 회복 되었고 48%의 생존율을 보인 MPP⁺ 처리군에 비해 매우 유의 성 있는 결과를 나타내었다 (Fig. 2B). 이러한 결과는 성숙 진 귤 과피 추출물에 비해 미성숙 진귤 과피 추출물이 보다 강한 보호 효능을 가지고 있음을 보여주는 것으로 미성숙 진귤 과 피 추출물이 가지는 30%의 보호 효능은 기존의 연구들과 비 교해 볼 때 유사한 결과를 나타내었다. 특히, 신경계세포인 SH-SY5Y 세포나 PC12 세포에서 MPP⁺로 세포사멸을 유도한 연구들 중 LiuWei dihuang 처리는 MPP⁺ 처리군의 47%의 생존율이 82%로 회복되었고, lycopene은 62%의 생존율을 가 지는 MPP⁺ 처리군에 비해 20%의 보호효과를 나타내었다 (Yi et al., 2013; Tseng et al., 2014). 차의 폴리페놀 성분으로 널 리 알려진 epigallocatechin-3-gallate (EGCG)의 경우 30%의 보 호 효능을, 황백 (Phellodendri cortex) 추출물의 경우 10% 정 도의 보호 효과를 가지는 것으로 보고되어 있다 (Jung et al., 2009; Ye et al., 2012). 기존에 보고된 물질들의 생리활성 정 도와 처리농도의 범위, 세포의 특이적인 환경조건들로 인해 보 호 효과는 10-35% 정도로 다양하게 나타나고 있으며 이들의 신경세포 손상 보호 효능과 비교해 볼 때 30%의 보호 효과를 가지는 미성숙 진귤 과피 추출물의 경우 일정 수준 이상의 신 경 손상 보호 효능을 발휘하는 것으로 생각된다. 보다 더 정 확한 효능 검증을 위해 파킨슨 증상을 완화시키는 약물과의 비교분석 및 이들의 조절 기전에 대한 지속적인 연구가 진행 되어야 할 것이다.

Fig. 2. 

Protective effect of immature CPE on the MPP⁺-induced neurotoxicity. (A); Measurement of cytotoxicity of immature CPE or mature CPE. (B); Effects of immature CPE or mature CPE on MPP⁺- induced neuronal cell death. Data are represented as mean ± SD of 3 separate experiments. *p < 0.05 vs MPP⁺-treated cells. #p < 0.05 vs mature CPEtreated cells. CPE; Citrus sunki peel extract.

진귤 과피 추출물의 세포손상 보호 효과를 검증하기 위해 세포 사멸 관련 단백질들의 발현양상을 분석하였다. 성숙 과피 추출물 처리군의 경우, MPP⁺ 처리군과 마찬가지로 PARP의 분 절현상과 활성화되는 cleaved caspase-3의 발현양이 증가되는 것을 확인 할 수 있었다. 미성숙 과피 추출물의 경우 PARP의 분절현상이나 활성화되는 cleaved caspase-3의 발현양을 거의 관찰 할 수 없는 대조군과 유사한 발현양상을 보여 주었다 (Fig. 3).

Fig. 3. 

Inhibitory effect of immature CPE on the expression of apoptosis-related proteins. CPE; Citrus sunki peel extract.

일반적으로 과실은 성숙되는 정도에 따라 phytochemical은 많은 변화를 가진다. 제주재래종 감귤 과피의 경우도 수확 시 기가 늦어짐에 따라 폴리페놀의 함량이 감소되어 항산화 효능 이 약화되는 것을 보고하였고 (Kim et al., 2009). Shin등 (2011)의 연구에 따르면, 일반적인 감귤이 가진 9가지의 플라 보노이드 성분 중 진귤에서 5가지를 확인하였다. 성숙과 미성 숙 과피의 hesperidin 함유량이 유사한 경우를 제외한 모든 플 라보노이드성분 (tangeretin, nobiletin, sinensetin) 분석에서 성 숙과피보다 미성숙과피에서 3-5배정도의 높은 함유량을 가진 다고 보고하였다 (Choi et al., 2007; Shin et al., 2011). 이 처럼 성숙되면서 변화하게 되는 생리활성 물질들의 함량 차이 로 인해 풍부한 플라보노이드성분을 함유한 미성숙 진귤 과피 추출물이 성숙 진귤 과피 추출물에 비해 신경손상에 대한 보 호 효과가 유의적으로 나타나는 것으로 추측된다.

이상의 결과로 볼 때 미성숙 진귤 과피 추출물이 caspase-3 dependent pathway를 통해 MPP⁺ 유도성 신경세포 사멸에 대 한 보호 효과를 가지며 이는 뇌혈관질환 예방을 위한 기능성 소재로서의 가능성을 보여주는 것이다. 그러나 미성숙 진귤 과 피가 가지는 보다 구체적인 성분 분석에 의한 효능과 동물모 델을 통한 보호 효과는 추후 연구를 통해 밝혀야 할 것으로 보인다.