실험에 쓰인 미선나무는 충북 괴산에서 잎과 줄기를 구입하 여 사용하였으며, 잎과 줄기를 물, 에탄올, 초음파 전처리 에 탄올 추출물 3가지 추출방법으로 각각 수직 환류냉각기가 설치 되어있는 둥근바닥 플라스크를 사용하여 실험을 진행하였다. 열 수 추출물은 미선나무 잎과 줄기 100 g을 사용하여 100°C의 조건에서 24시간 추출하였고, 에탄올 추출물은 70% 에탄올 용 매에 80°C에서 추출 하였다. 초음파 에탄올 추출물은 일반 에 탄올 추출물과 다르게 추출 전 140kHz 조건에서 1시간 전처리 후 60°C에서 12시간 동안 추출을 진행하였다. 추출 후 각 미선 나무 추출액을 감압여과기를 사용하여 여과하고, 여과 후에 회 전감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축하였다. 농축이 끝난 샘플은 하루 정도 얼린 뒤 동결건조기 (PVTFA 10AT, ILSHINBioBase, Dongducheon, Korea)에 3일 동안 동결건조하여 파우더 상태로 만들어 실험 에 사용하였다.

Melanocell인 B16F10은 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 구입한 B16F10은 10% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)이 첨가 된 DMEM 배지에 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 그 외 사용된 모든 시약들은 Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA) 을 통하여 구입, 사용하였다.

미선나무 추출물의 수율은 각 추출물 별 추출 시 들어간 미 선나무 생약 질량에 대한 동결건조 후 얻어 진 파우더 상태의 추출물의 질량 분율로 계산하여 측정하였다.

미선나무 추출물의 항산화능의 확인을 위하여 환원력 측정 법을 진행하였다. 환원력 측정은 Oyaizu의 방법을 참고하여 실험하였다 (Oyaizu, 1986). 미선나무 추출물 250μl와 0.2M sodium phosphate buffer, 1%의 potassium ferricyanide 250μl 세 가지를 혼합하여, 50°C에서 20분 동안 반응하였다. 반응 한 뒤, 10%의 trichloroacetic acid 250μl를 첨가하고 4,000 rpm 속도로 10분 간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등 액 500μl와 증류수 500 μl를 섞고, 0.1% ferric chloride를 100μl를 넣어 25°C에서 10분간 반응 하여 700nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

미선나무 추출물의 세포생존율을 확인하고자 MTT assay를 사용하였다. 세포 독성평가에 melanoma cell B16F10을 사용 하였고, 1.8 × 10⁵ cells/ml 농도로 96-well plate에 주입한 뒤 부착할 때 까지 incubator에서 배양하였다. 부착 후 배지를 제 거하고 미선나무 추출물을 농도별로 200μl씩 주입하여, 24시 간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 뒤 추출물을 제거하고, 200μg/ml 농도의 MTT 용액을 150μl만큼 주입하여 37°C에서 빛을 차단한 채 다시 3시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 용 액을 제거하고, PBS로 세척 후 DMSO를 200μl주입하여 30분 동안반응하여 microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 570nm에서 흡광도를 확인하여 세포 생존율을 확인하였다.

DPPH (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 자유 라디칼 소거 활성 실험은 각 시료 150μl을 첨가 후 0.1 mM 농도의 DPPH용액 150μl을 혼합하여 25°C에서 30분 간 암실에서 반 응하였다. 30분 후 517nm의 파장에서 흡광도 측정하였다. 측 정한 값은 아래의 식과 같이 하여 DPPH radical scavenging activity (%)로 나타내었다.

Melanin 생성에 중요한 역할을 하는 효소 tyrosinase 저해 활성 정도는 Kim 등 (2011)의 방법을 참고하였다. pH를 6.8 로 맞춘 potassium phosphate buffer 0.1 M 에 L-tyrosine을 0.3mg/ml의 농도로 용해시킨 용액 950μl와 추출물 50μl, 그 리고 tyrosinase (2000 units/ml) 50μl를 혼합하여 37°C의 온 도에서 20분 동안 방치하였다. 20분 후 차갑게하여 반응을 끝 내고, 475nm파장에서 흡광도를 측정하였다.

Melanoma cell인 B16F10을 이용하여 melanin 생성 저해정 도를 평가하였다. 실험방법은 B16F10 세포를 96-well plate에 3.2 × 10⁵ cell/ml의 농도로 각 well에 주입하여 5% CO₂, 37°C 에서 세포가 부착할 때까지 충분히 배양하였다. 세포를 부착 한 뒤 농도 별로 샘플을 처리하여 37°C, 5% CO₂ 조건에서 다시 3일 간 배양하였다. 3일 후에 샘플을 제거 한 뒤, PBS (Phosphate buffer saline)를 사용해 세척하고, 각 well에 1 N 농도의 NaOH를 200μl 첨가해 1시간 동안 반응 시켜 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

데이터의 통계처리는 3회 반복하여 실시하였으며, 통계는 SAS (Statistical Analysis System 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 통하여 two-way ANOVA 방법 으로 실시하였다. 처리구간의 최소 유의 수준의 차는 p < 0.05 로 처리 하였다.

열수 및 70% 에탄올 추출물, 초음파 전처리 70% 에탄올 추출물의 수율을 확인하였다. 수율 확인은 Table 1에 나타내 었다. 열수 추출물의 수율은 6.5%로 세 가지 추출물 중에 가 장 낮은 수율을 보였으며, 70% 에탄올 추출이 9.6%로 다른 추출물보다 높은 수율을 확인할 수 있었다. 초음파 전처리한 70% 에탄올 추출은 11.0%로 70% 에탄올 추출물보다 높은 수율을 보여, 미선나무 추출 수율에 초음파 전처리시 수율 증 가에 도움이 될 수 있음을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 Park 등 (2000)의 연구에서 밝힌 초음파로 인한 높은 운동에 너지 효과로 인하여 미선나무가 영향을 받아 각 종 성분 물질 에 대한 추출이 용이해져 기존의 추출법보다 높은 수율이 나 온 것으로 사료 된다.

환원력 측정을 실시하여 추가적으로 미선나무의 항산화 효 과를 확인하고자 하였다. 결과는 Table 2에 표시하였다. 증류 수를 첨가한 시료군을 control로 하였을 때, 미선나무 추출물 모든 샘플이 control보다 높은 흡광도를 보여 항산화 효과를 확인할 수 있다. 대표적인 항산화관련 양성대조군인 ascorbic acid는 최저 0.854에 달하는 높은 활성을 보였다. 미선나무 추 출물의 경우 일부 농도에서는 열수 추출물이 에탄올 추출물보 다 높은 흡광도를 나타내나, 고농도에서 열수 추출물보다 에 탄올 추출물의 흡광도가 더 높게 확인 되었다. 초음파 전처리 시 활성의 증가를 확인할 수 있으나, 일반 에탄올 추출물에 비 해 그 차이는 크지 않았다. 항산화에 관련하여 보고 된 Kwon 등 (2014b)의 연구에서 느타리버섯의 환원력은 0.5mg/ml농도 에서 0.5 전후로 확인 되었으나, 미선나무는 보다 낮은 농도인 0.3mg/ml에서 70% 에탄올 추출물은 0.515, 초음파 70% 에탄 올 추출물은 0.532의 환원력을 보여 일반적으로 항산화 효과 에 대해 연구 된 천연물 이상으로 항산화에 대한 효과가 좋을 것으로 사료 된다.

세포 실험에 앞서, 미선나무 추출물에 대한 melanin 생성 세포 B16F10의 생존율을 확인함으로서 미선나무 각 추출물의 독성을 확인하고자 하였다. 세포 생존율은 배지만 첨가한 무 처리군의 생존율을 100%로 하였을 때 각 추출물에 대한 세포 수 비율을 산정하였다 (Table 3). 열수 추출물은 0.2mg/ml에 서 최저 93.2%의 생존율을 보였으며, 에탄올 추출물 역시 0.2mg/ml 농도에서 81.4%, 초음파 에탄올 추출물은 0.3mg/ml 에서 83.3%로 미선나무 추출물의 세포 생존율은 일정 농도범 위 내에서 80% 이상으로, 일반적으로 향장관련하여 보고 된 Kim 등 (2013)의 연구에서 천연물 더덕의 세포독성이 20% 미만이기 때문에 미선나무 추출물에 대한 세포생존율은 실험 에 있어 충분한 생존율을 보이는 것으로 사료 된다.

추출물 별 미선나무 샘플의 항산화 측정은 자유라디칼 소거 능 활성을 봄으로서 효과를 확인하였다. 결과는 Fig. 1에 나타 내었다. 농도에 따라 각 추출방법 별 미선나무 추출물의 소거 활성이 증가하는 경향을 확인할 수 있다. 용매 중 0.3mg/ml에 서 59.13%의 활성을 보인 열수 추출물보다 70% 에탄올 추출 물이 69.66%로 더 높은 활성을 보였으며, 초음파 전처리 시 72.76%로 그 값이 증가하였음을 알 수 있다. 양성대조군으로 쓰인 ascorbic acid는 모든 농도구간에서 미선나무 추출물과 유의적인 차이를 보였으며, 추출물이 양성대조군의 효과에는 미치지 못함을 알 수 있다. 미선나무의 DPPH 소거활성은 항 산화효능에 대해 연구된 바 있는 Park 등 (2014a)의 논문에서 초고압 전처리 감귤의 특성에 관한 논문과 비교하였을 때, 초 고압 처리한 감귤이 최대 35%를 나타낸 것에 반해 매우 높은 수치임을 확인할 수 있다. 또한, 양성대조군 ascorbic acid의 활성 값과 크게 차이가 없어, 미선나무 추출물의 항산화 효과 를 확인할 수 있다.

Fig. 1. 

DPPH Free radical scavenging activity of the Abeliophyllum distichum extracts by different extraction process. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Mean with difference letter (A-C) within same sample are significantly different at p < 0.05 and mean with difference letter (a-d) within same concentration are significantly different at p < 0.05. ¹⁾WE: Water Extract. ²⁾EE: 70% Ethanol Extract. ³⁾UE: 70% Ethanol Extract with ultrasonic extraction.

Melanin 색소 생성에 기여하는 효소 tyrosinase에 대한 미선 나무 추출물의 저해정도를 확인하여 미백활성을 확인하였다. 증류수를 넣은 control군을 0%로 하였을 때, 저해율 (%)로 항 산화 활성과 마찬가지로 열수 추출물보다 70% 에탄올 추출물 에서 높은 저해율을 나타내었다 (Fig. 2). 70% 에탄올 추출물 이 높은 농도에서 23.88%에 반해, 초음파 전처리 추출물은 23.34% 활성을 보여 차이는 없으나 항산화 활성에 대한 실험 결과에 비해 초음파 전처리군이 낮은 활성을 보여 상반되는 결과를 확인하였다. 양성대조군인 ascorbic acid와는 유의적인 차이를 보였으며, 양성대조군에 비해 그 효과가 높지 않았다. 그러나 미선나무 추출물의 tyrosinase 저해율은 기존의 Park 등 (2014b)에 의해 연구 보고 된 대추 및 포도 발효물의 미 백논문과 비교하였을 때, 발효 에탄올 대추와 포도추출물은 해 당농도에서 5 ~ 22%의 저해율을 보여, 미선나무의 저해율이 더 높아 미백활성에 대해 다른 천연물 이상으로 효과가 있음 을 시사한다. 이러한 미선나무의 미백효과를 바탕으로 melanoma cell B16F10 세포를 이용한 melanin 생성 저해량 을 추가로 진행하였다.

Fig. 2. 

Tyrosinase inhibition of the Abeliophyllum distichum extracts by different extraction process. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Mean with difference letter (A-C) within same sample are significantly different at p < 0.05 and mean with difference letter (a-d) within same concentration are significantly different at p < 0.05. ¹⁾WE: Water Extract. ²⁾EE: 70% Ethanol Extract. ³⁾UE: 70% Ethanol Extract with ultrasonic extraction.

Melanin 색소를 형성하는 melanoma cell을 이용하여 melanin 생성 억제 활성을 측정하여 미선나무 추출물의 미백 활성을 평가하였다 (Fig. 3). 다른 실험과 마찬가지로 용매는 열수에 비해 70% 에탄올 추출에서 더 높은 활성을 확인할 수 있다. 0.3mg/ml에서 열수 추출물은 39.5%, 70% 에탄올 추출 물은 52.7%로 에탄올 추출물이 미백활성에 더 좋은 효과를 나타내는 것을 확인 할 수 있다. 초음파 전처리 70% 에탄올 추출물은 55.1%의 melanin 저해율을 보여 tyrosinase 저해활 성과는 다르게 초음파 처리가 melanin 색소 생성 저해에 영향 이 있음을 확인하였다. 양성대조군에 비하여 유의적인 차이를 보여 다소 낮은 효과를 보였으나, 미선나무 추출물의 melanin 생성 억제율은 미백효과에 대해 보고한 Lee 등 (2014b)의 연 구에서 발효주박추출물과 비교하였을 때 발효 주박추추물의 경우 melanin 합성 저해율이 13 ~ 25%로 미선나무 추출물의 melanin 생성 저해율이 높아 미백활성에 효능이 있음을 확인 할 수 있다. 가장 높은 농도에서 미선나무 에탄올 추출물에 비해 초음파 전처리 에탄올 추출물의 melanin 생성 억제율이 상승하여 초음파 전처리가 melanin 생성 억제에 도움이 될 수 있으나, 상승폭이 매우 낮으며 저농도에서는 결과가 일반 에 탄올 추출물이 오히려 높게 나와 초음파 전처리가 미선나무 추출물의 활성에 영향을 주는 것에 관해 추가적인 연구가 필 요할 것으로 보인다.

Fig. 3. 

Measured melanin inhibition of the Abeliophyllum distichum extracts by different extraction process. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Mean with difference letter (A-C) within same sample are significantly different at p < 0.05 and mean with difference letter (a-c) within same concentration are significantly different at p < 0.05. ¹⁾WE: Water Extract. ²⁾EE: 70% Ethanol Extract. ³⁾UE: 70% Ethanol Extract with ultrasonic extraction.

국내에서만 자생하는 1속 1종의 미선나무의 미백활성 소재 로서의 가치를 확인하고자, 항산화 효능 및 미백활성에 대한 실험을 진행하였다 (Lee, 1976). 미선나무의 항산화에 대해서 지금까지 보고 된 연구가 있으나 (Park, 2011), 향장소재 중 미백활성 효능에 대한 연구논문은 지금까지 보고된 바가 없었 다. 그리하여 본 연구진은 최근 대량생산에 성공하여, 앞으로 새로운 천연물 소재가 될 미선나무를 활용하기 위하여 연구를 진행하였다. 항산화에 대한 효과를 확인하기 위해 DPPH 자유 라디칼 소거활성 및 환원력에 대한 측정을 하였을 때, 일반적 으로 항산화에 대한 효과가 검증 된 다른 천연물에 뒤지지 않 는 효과를 보였으며, 종래 추출법 중 일반 열수 추출물보다는 70% 에탄올 추출물의 활성이 우수하였고, 초음파 전처리시 활 성 값이 소폭 상승하였다. 항산화에 이어 미선나무 추출물에 대한 미백효과를 확인하였다. Melanin 생성에 핵심적인 작용 을 하는 tyrosinase의 저해활성에서 미선나무 추출물의 미백효 능을 검증하였다. 항산화와 마찬가지로 열수 추출물보다는 70% 에탄올 추출물에서 더 좋은 활성을 보였다. 초음파 전처 리의 경우 오히려 소폭 감소하여 tyrosinase의 저해활성에서 초음파 전처리 효과가 없음을 시사하였다. Melanin 저해율을 평가하였을 때에, 마찬가지로 열수 보다 70% 에탄올 용매 추 출이 더욱 우수한 저해를 보였으며, 이 경우 초음파 전처리가 저해율을 소폭상승 시킴을 알 수 있었다.

상기와 같은 실험 결과를 통하여 미선나무 추출물의 항산화 와 미백효능을 검증하였다. 추출용매는 물보다는 70% 에탄올 이 더 좋을 것으로 판단되며, 일부 실험에서 초음파 전처리군 의 활성이 증가하여 초음파공정이 도움이 될 수 있으나 관련 연구가 더 필요할 것으로 사료된다. 본 연구는 국내 희귀수종 인 미선나무의 미백효과를 확인하고 종래 추출 공정법 중 활 성에 유용한 추출방법을 확인하여, 점차 증가하는 미선나무의 생산을 통해 향후 천연물 향장소재의 가치를 검증하였다. 생 산성이 증가하여 어떤 환경에서도 생산이 가능하다면 미선나무 의 화장품 시장에서의 가치는 나날이 높아질 것으로 사료된다.