본 실험에 사용한 고추냉이 잎은 강원도 태백에서 구입하여 물로 잘 씻어 흙이나 먼지 등의 이물질을 제거하고 5 cm 크 기로 절편을 만들어 동결건조한 후, 분쇄기 (IKA M20, IKA, Staufen, Germany)를 이용하여 20 ~ 30 mesh로 분쇄하여 시료 로 사용하였다. 분말상태인 고추냉이 잎에 시료 중량의 10배 인 70% 에탄올을 가한 뒤 상온에서 24시간 교반하면서 (150 rpm, HY-HS11, Hanyang Science, Seoul, Korea) 유용 성분들을 추출하였고, Whatman No. 2 (Whatman Ltd, Maidstone, Kent, UK) 여과지를 이용하여 여과한 후, 회전진 공농축기 (EYELA N-100, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하 여 40°C에서 감압 농축하였다. 농축된 추출물은 동결건조기 (Modulyod-115, Thermo Electron Co., Waltham, MA, USA) 를 이용하여 건조된 분말을 제조하였다. 또한, 열수 추출물은 분쇄된 고추냉이 잎에 10배 (w/w)의 증류수를 가한 후, 100°C 수욕상에서 3시간동안 환류냉각 (GLHMP-F200, Global Lab, Seoul, Korea)하면서 추출하여 조여과 (Whatman No. 2)한 후, 40°C에서 감압 농축하여 동결건조 하였다. 건조된 고추냉이 잎 추출물은 무게를 측정하여 추출물 수율을 측정한 후, –20°C 냉동고에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

고추냉이 잎의 일반성분은 AOAC 법 (1990a)과 식품공전의 분석방법 (2002)에 따라 3회 분석하여 평균값으로 하였다. 즉, 수분 함량은 상압가열건조법, 회분 함량은 550°C 회화법 을 이용하여 분석하였다. 조단백질 함량은 단백질 자동분석기 (Kjeltec protein analyzer, Tecator, Sweden)로, 조지방 함량 은 Soxhlet 법 (Hawthorne et al., 2000)으로 분석하였다. 탄수화물 함량은 위의 결과치를 합한 값을 100에서 뺀 값으 로 하였다.

총 식이섬유 (total dietary fiber, TDF) 함량 측정은 AOAC법 (1995a)과 Shin 등 (2014)의 방법에 따라 효소중량 법 (enzymatic-gravimetric method)에 따라 분석하였다. 먼저 α-amylase를 사용하여 액화시킨 건조 된 시료에 효소 protease 및 amyloglucosidase를 반응하여 단백질과 전분을 가수분해하 였다. 다음 용액 중에 포함 된 수용성 식이섬유를 에탄올을 사 용해 침전시키고, 항량을 구한 crucible에 용액을 감압 여과하 였다. 마지막으로 잔사를 에탄올과 아세톤을 사용해 세척하고 건조한 뒤 건조 된 잔사의 단백질 및 회분의 양을 제외시킨 건조 전, 후 무게차를 통해 총 식이섬유의 함량을 구하였다.

무기질 (Ca, P, Mg, K, Na, Fe, Zn, Cu, Mn) 함량은 AOAC법 (1984a)과 Shin 등 (2014)의 방법에 의하여 분석하 였다. 즉, 시료를 칭량하여 550°C에서 회화시킨 후, 5ml의 HNO₃용액을 가한 후 25ml 메스플라스크에 넣고 증류수로 정 용한 후 Inductively Coupled Spectrometer (ICP, Lactam 8440, Plasma Lab., Australia)를 이용하여 분석하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다.

잎의 sinigrin 및 allyl isothiocyanate 분석을 위해 시료를 –60°C에서 동결 건조시킨 후 막자사발에 넣고 액체 질소를 넣 어가면서 분쇄하였다. 분말시료 1 g에 deionized water 100ml를 가하여 진탕배양기에서 350 rpm으로 2분간 마쇄한 후 Toyo No. 2 filter paper를 이용하여 여과한 후 0.45 μm membrane filter로 다시 여과하였다. 분석방법은 sinigrin 및 allyl isothiocyanate 분 석은 추출액 3ml와 10mM tetraheptylammonium bromide를 함유한 acetonitrile/120mM phosphate buffer (pH 6.5) 80/20 (v/v) 혼합액을 동량 혼합한 후 0.45 μm membrane filter에 통과 시켜 HPLC로 분석하였으며 (Park et al., 2006), HPLC 조건 은 Table 2와 같았다.

총 페놀 함량은 Folin-Denis법 (Gutfinger, 1981)과 Shin 등 (2014)의 방법에 따라 추출물 1ml에 Folin- Ciocalteau 시 약 및 10% Na₂CO₃용액을 각 1ml씩 차례로 가한 다음 실온 에서 1시간 정치한 후 spectrophotometer (UV 1600 PC, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 700nm에서 흡광도를 측 정하였다. Caffeic acid (Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA) 를 0 ~ 100μg/ml의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 산출하였다.

총 플라보노이드는 Moreno 등 (2000)의 방법과 Shin 등 (2014)의 방법에 따라 추출물 0.5ml에 10% aluminum nitrate 0.1ml 및 1M potassium acetate 0.1ml, ethanol 4.3ml를 차 례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 정치한 다음 415nm에 서 흡광도를 측정하였다. Quercetin (Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준물질로 하여 0 ~ 100μg/ml의 농도 범위에서 얻어진 표준 검량선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량 을 계산하였다.

2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH)는 free radical 에 대한 시료의 항산화 효능을 확인하기 위하여 사용한다. 전 자공여능 측정은 Kim 등 (2002)의 방법과 Shin 등 (2014)의 방법을 변형하여 측정하였다. Ethanol에 용해시킨 0.4 mM DPPH 용액 0.8ml에 시료 0.2ml을 첨가하여 vortex mixer로 5초간 진탕하고, 암소에서 10분 동안 방치 후 517nm에서 흡 광도를 측정하였다. 전자공여능은 다음 식에 의하여 DPPH free radical 소거능을 나타내었다.

고추냉이 잎 추출물의 환원력은 Oyaizu (1986)의 방법을 변 형하여 측정하였다. 시료 1ml에 pH 6.6의 200 mM 인산 완 충액 및 1%의 potassium ferricyanide를 각 1ml씩 차례로 가하여 교반한 후 50°C의 수욕상에서 20분간 반응시켰다. 여 기에 10% TCA 용액을 1ml 가하여 13,500 × g에서 15분간 원심분리하여 상등액 1ml에 증류수 및 ferric chloride를 각 1ml씩 혼합하여 700nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원력은 시료 첨가군과 대조군의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다.

모든 측정값은 평균값 ±표준편차 (mean ± SD)로 표시하였 고 통계처리는 SAS program (Statistical Analysis System, version 8.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 사용하 였으며, 유의성 검정은 분산분석 (ANOVA)을 한 후 p < 0.05 수준에서 Duncan 다중검정법 (Duncan’s Multiple Range Test)으로 분석하였다.

본 연구에서 분석된 고추냉이 잎의 일반성분과 식이섬유소 함량을 Table 3에 정리하였다. 고추냉이 잎 100 g (wet weight basis)중에는 수분 91.2%, 탄수화물 4.7%, 조단백 2.2%, 조지방 0.7%, 조회분 1.2%가 함유되어 있으며, 총 식 이섬유소 함량은 4.6%이었다. 또한 고추냉이 잎 100 g의 총 열량은 385.23 kcal로 분석되었다. 한편 영양소의 함량을 평가 하는데는 실제적인 고형물의 함량이 중시되므로 wet weight basis보다는 dry weight basis가 효과적일 것으로 판단하여 고 추냉이 잎의 일반성분과 식이섬유소 함량을 건량기준으로 환 산하여 Table 3의 괄호 안에 표시하였다. 그 결과 탄수화물 53.41%, 조단백질 25.00%, 조회분 13.64% 및 조지방 7.95% 로 나타났다. 따라서 고추냉이 잎의 주된 성분은 대부분의 식 물체의 구성성분인 탄수화물과 단백질로 구성되어 있었으며, 일반성분 중에서 조지방 함량이 가장 낮은 것으로 나타났다.

Table 4는 고추냉이 잎 100 g (dry weight basis)중 무기질 함량을 분석한 결과이다. 칼륨이 약 5.96 g으로 가장 함량이 높았고 그 다음이 칼슘 (1.79 g), 인 (772.05mg), 마그네슘 (614.89mg) 순이었다. 미량영양소인 아연, 망간, 철분, 및 구리 함량도 각각 3.52mg, 5.00mg, 17.72mg, 및 0.23mg 함유되어 있는 것으로 분석되었다. 식품성분표 (농촌진흥청 2011)의 분 석결과보다 함량이 높게 나타났으며 이는 고추냉이의 재배방 법 및 시기에 따른 결과로 보여진다.

고추냉이의 sinigrin과 allylisothiocyanate의 함량을 검정 한 결과 Table 5에 나타내었으며, sinigrin은 69.2mg/g, allyl isothiocyanate은 241.0mg/g함량을 나타내었다. 이러한 것은 추 출과 분석과정에서 sinigrin이 myrosinase에 의해 가수분해 되 어 allyl isothocyanate가 생성되기 때문이며 고추냉이에서의 향미성분의 분석은 sinigrin의 함량과 함께 allyl isothiocyanate 의 함량을 검정하는 것이 애초 고추냉이에 포함되어진 sinigrin 의 함량을 예측할 수 있는 방법이 될 것으로 생각된다.

본 연구에서 사용한 추출 용매는 식품으로 사용가능한 에탄 올과 물을 사용하였다. 추출용매별 고추냉이 잎 추출물의 추 출수율은 70% 에탄올 추출물에서 21.33%로 열수 추출물의 15.37%에 비해 높은 수율을 나타내었다. 천연물에 존재하는 폴리페놀계 화합물들은 분자 내 phenolic hydroxyl기가 효소 단백질과 같은 거대분자들과 결합하는 성질을 가지고 있기 때 문에 항산화, 항심혈관질환, 항암, 항골다공증 및 항당뇨와 같 은 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Scalbert et al., 2005; Sakihama et al., 2002). Fig. 1에서 보는바와 같이, 고 추냉이 잎 열수추출물 및 70% 에탄올 추출물에 함유된 총페 놀 함량은 각각 19.44 ± 0.23 및 19.33 ± 1.17mg GAE/g로 나타났으며, 플라보노이드 함량은 각각 7.69 ± 0.71 및 19.25 ± 1.41mg QE/g를 나타내었다. 식물 기원의 시료에서 페 놀 화합물은 그 함량은 많을수록 항산화 활성이 높으며 (Duval and Shetty, 2001), 식물시료의 변색에 주된 영향을 미 치는 인자로 알려져 있다 (Choi and Lee, 1999). 플라보노이 드류는 polyphenolic substance로서 화학구조에 따라 flavonols, flavones, catechins, isoflavones 등으로 분류되며, 물과 에탄올 에 대한 용해도가 다르고 이들의 구조적 차이에 따라 과산화 지질 생성 억제 등의 생화학적 활성에 영향을 준다 (Middleton and Kandaswami, 1994). Kim 등 (2004)은 20여종의 약용식물 류의 총 페놀과 플라보노이드 함량과 항산화 활성의 상관관계 에서 폴리페놀의 함량이 플라보노이드보다 많을수록 항산화 활 성이 높다고 보고한 결과와는 유사한 결과를 나타내었다.

Fig. 1. 

Total phenol and total flavonoids contents of hot water and 70% ethanol extracts obtained from Wasabi japonica Matsum leaves.

DPPH radical 소거능을 이용한 고추냉이 잎 추출물들의 항 산화 활성은 Fig. 2와 같이 70% 에탄올 추출물의 각각의 농 도에서 19.74 ~ 36.90%를 나타내었으며, 동일한 농도의 열수 추출물에서는 19.54 ~ 37.86%의 DPPH 라디칼 소거능을 보여 70% 에탄올 추출물과 열수 추출물이 비슷한 결과를 나타내었 으며, 항산화제로 잘 알려져 있는 BHT와 α-tocopherol보다 낮은 항산화 활성을 보여 주어 Park 등 (2001)의 연구결과와 유사한 결과를 나타내었다. Kang 등 (1995)은 전자공여능이 phenolic acid와 flavonoids 및 기타 phenol 성 물질에 대한 항산화작용의 지표라 하였으며, 이러한 물질은 환원력이 클수 록 전자공여능이 높다고 하였다. 또한, 70% 에탄올과 열수 추 출물의 농도별 환원력을 측정한 결과 Fig.3과 같이 1,000μg/ml의 농도에서 70% 에탄올 추출물과 열수 추출물의 환원력이 각각 0.12 (A700), 0.12 (A700)로 나타나 70% 에 탄올 추출물과 열수 추출물이 차이가 없음을 나타내었다. 이 상의 결과에로 비추어 볼 때, 추출 용매별 고추냉이 잎 추출 물들에 함유된 총페놀 및 총 플라보노이드의 조성 및 함량의 차이가 이들 추출물의 항산화 활성에 주요한 영향을 미치는 것으로 판단된다.

Fig. 2. 

DPPH radical scavenging activity of hot and 70% ethanol extracts obtained from Wasabi japonica Matsum leaves.

Fig. 3. 

Reducing power of hot and 80% ethanol extracts obtained from Wasabi japonica Matsum leaves.

고추냉이 잎의 일반성분 및 아미노산, 무기질 항산화 효과 에 대해서 조사하였다. 식품영양학적 접근에서의 고추냉이 잎 일반성분은 건량기준으로 당질 53.41%, 조단백질 25.00%, 조지방 7.95% 및 조회분 13.64%이었고 고추냉이 잎 100g의 함유 열량은 385.23 kcal로 분석되었으며, 총 식이섬유소 함량 은 건량기준으로 52.27%이었다. 또한, 무기질 중 칼륨의 함유 량이 가장 높았고 그 다음이 칼슘, 인, 마그네슘 순으로 나타나 알칼리성 재료임을 알 수 있었다. Sinigrin과 allyisothiocyanate 함량은 69.2mg/g 및 241.0mg을 나타내었다. 총 페놀 함량은 고추냉이 잎 열수 추출물 및 70% 에탄올 추출물에서 각각 19.44 ± 0.23 및 19.33 ± 1.17mg GAE/g로, 총 플라보노이드 함 량은 고추냉이 잎 열수 추출물 및 70% 에탄올 추출물에서 각 각 7.69 ± 0.71 및 19.25 ± 1.41mg QE/g로 나타났다. DPPH 라디칼 소거능 및 환원력과 같은 항산화 활성은 70% 에탄올 추출물과 열수 추출물의 차이가 없었으며, 항산화효과는 항산 화에 대해 연구 된 바 있는 다른 천연물에 비해 그 효능이 비슷하거나 떨어져 항산화에 대한 효과는 있으나 높지 않을 것으로 보인다. 이들의 결과로 비추어 볼 때, 고추냉이 잎 추 출물들에 함유된 총페놀 및 총 플라보노이드의 조성 및 함량 의 차이가 이들 추출물의 항산화 활성에 주요한 영향을 미치 는 것으로 판단된다.